Abstract

O câncer de ovário é a doença ginecológica mais letal que afecta as mulheres em os EUA. O Cancer Genome Atlas Rede identificadas mutações do p53 em 96% dos carcinomas de ovário seroso de alto grau, demonstrando o seu papel crítico. Além disso, a via Fator Transformador de Crescimento Beta (TGF) é disfuncional em várias doenças malignas, incluindo cancro do ovário. Este estudo investigou como expressão do tipo selvagem, mutante, ou a ausência de p53 altera a resposta de células do cancro do ovário para a sinalização TGF-p, assim como a resposta do epitélio da superfície do ovário e do epitélio do tubo falópico para TGFp. Apenas as células de cancro do ovário que expressam p53 de tipo selvagem foram crescimento inibido por TGF-p, enquanto que as células de cancro do ovário que eram p53 mutante nulo ou não eram. TGF induzida migração em células SKOV3 p53 nulo, que não foi observado em células SKOV3 com expressão estável de R273H p53 mutante. Knockdown de p53 de tipo selvagem nas OVCA 420 células de cancro do ovário melhoradas a migração celular em resposta a TGF-p. O aumento da expressão da proteína de DKK1 e TMEPAI, dois genes pró-invasivos com a expressão aumentada na fase tardia do cancro metastático do ovário, foi observada em knockdown p53 e células nulas, enquanto que as células que expressam de forma estável o mutante p53 demonstraram menor DKK1 e indução TMEPAI. Expressão de p53 ou p53 perda de autorização de proliferação contínua de linhas de células de cancro do ovário na presença de TGF-p mutante; No entanto, as células que expressam mutante exibem p53 reduzida migração e diminuição dos níveis de proteína de DKK1 e TMEPAI

Citation:. Ó hAinmhire E, Quartuccio SM, Cheng W, Ahmed RA, o Rei SM, Burdette JE (2014) Mutação ou perda de p53 diferencialmente Modifica TGF Acção no cancro do ovário. PLoS ONE 9 (2): e89553. doi: 10.1371 /journal.pone.0089553

editor: Sumitra Deb, Virginia Commonwealth University, Estados Unidos da América

Recebido: 12 de setembro de 2013; Aceito: 21 de janeiro de 2014; Publicação: 20 de fevereiro de 2014

Direitos de autor: © 2014 Burdette et al. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Licença Creative Commons Attribution, que permite uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o autor original ea fonte sejam creditados

Financiamento:. Esta pesquisa foi apoiado em parte por doações do Liz Cancer Research Fund Tilberis ovário L /T /UIC /0.1.2011, Prêmio Vahlteich da UIC College of Pharmacy and American Cancer Society Research Scholar Grant Illinois Divisão RSG-12-230-01-TBG . Os financiadores não tiveram nenhum papel no desenho do estudo, coleta de dados e análise, decisão de publicar ou preparação do manuscrito

CONFLITO DE INTERESSES:.. Os autores declararam que não existem interesses conflitantes

Introdução

o câncer de ovário é a quinta maior causa de morte por cancro ea doença ginecológica mais letal entre as mulheres americanas. Em 2013, cerca de 22.240 casos de câncer ovariano serão diagnosticados, resultando em 14.030 mortes [1]. A elevada taxa de mortalidade pode ser atribuído ao facto de que mais de 60% dos cancros do ovário serão diagnosticados após a doença se espalhou para locais distantes. Uma vez metástase, a taxa de sobrevivência de cinco anos cai para menos de 30% [1]. A ineficiência do diagnóstico é principalmente devido a uma falta de compreensão dos eventos que iniciam e mecanismos de progressão que dão origem ao câncer de ovário, com algumas estratégias de detecção precoce [2]. Importante, se o cancro do ovário é diagnosticado mais cedo, as taxas de sobrevivência pode ser tão elevada como 90% [1]. Essas estatísticas ilustram a necessidade fundamental para compreender melhor os eventos mecanicistas iniciais de câncer de ovário que vai ajudar com o diagnóstico precoce e um melhor prognóstico dos pacientes.

O supressor tumoral p53 é o gene mais comumente mutado em todos os cânceres humanos [2] . p53 é um factor de transcrição que controla muitas funções celulares, tais como o ciclo celular, apoptose e resposta a danos no ADN [3]. A maioria

TP53

mutações são mutações missense, onde um único resultados substituição de bases de nucleotídeos em qualquer disfunção ou ausência de atividade de p53 [4]. Estas mutações levam a um aumento da proliferação, invasão e metástase em muitos cancros [5]. O Genoma Atlas Cancer Network (CGAN) identificado como sendo p53 mutada em até 96% dos cancros resistentes serosas de quimioterapia, de elevado grau de ovário, indicando um papel essencial para a p53 mutações no cancro do ovário seroso [6]. Além disso, a Agência Internacional de Investigação do Cancro (IARC)

TP53

banco de dados indica que a mutação p53 mais frequente no cancro do ovário seroso é uma arginina para histidina conversão no resíduo de aminoácido 273 (R273H) dentro do domínio de ligação ao DNA , que responde por 8% de todas as mutações do gene p53 [7]. R273H p53 mutante tem sido relatado para desempenhar um papel na promoção da mama e de metástases do cancro do pulmão [8], [9], aumentando a migração e invasão.

Outra importante via de sinalização que é modificado no cancro do ovário é o crescimento transformante via do factor Beta (TGF) [10]. TGFp é uma superfamília de factores de crescimento peptídicos que regulam o crescimento, diferenciação, apoptose, e a migração [10]. sinais de TGF-p por ligação a uma família de receptores de membrana de serina /treonina-quinase, que fosforila a jusante moléculas de sinalização, principalmente SMADs 2 e 3 [11]. Uma vez activadas, estas complexos Smad translocar para o núcleo e interagir com vários co-activadores e repressores para modular a transcrição de Smad-regulados [11], [12]. TGFp desempenha um papel importante na indução da paragem do crescimento em células de ovário normais [13]. Em algumas células cancerosas, TGFp induz apoptose e paragem do ciclo celular, enquanto que em outras células cancerosas que perde a capacidade para induzir a paragem do crescimento e pode em vez disso promover a invasão celular [10]. Pode também desempenhar um papel na quimiorresistência em cancros do ovário serosas avançada [14]. Os componentes principais de TGF-p, via os receptores de TGF-p, e proteínas Smad, raramente são mutado ou perdido em cancro do ovário [5], sugerindo que a ruptura da via TGFp ocorre por outros mecanismos.

como p53 e Smads são ambos factores de transcrição, a p53 é capaz de interagir com Smads para modificar tanto a p53 e vias de sinalização de TGF-p [4]. Smads pode formar um complexo transcricional de p53 para induzir a expressão de genes que promovem a paragem do ciclo celular, tal como p21 [4]. Smads e ligam p53 para os seus próprios elementos responsivos nos promotores de genes de TGF-p-responsivos para ativar sinergicamente ou reprimir a transcrição [4]. De facto, tem sido mostrado que a p53 é necessária para a paragem do ciclo celular induzida por TGF-p [4]. Além disso, a p53 mutante R273H anula a paragem do ciclo celular induzida por TGF-p e promove o comportamento metastático, bloqueando a p63 em células de carcinoma da mama [8]. Nestas células, o p53 mutante /Smad complexo inibe a transcrição mediada por p63 levando à invasão na presença de Ras oncogénico [8].

Dada a elevada percentagem de mutações do gene p53 em tumores ovarianos [6] ea recente evidências de que p53 e Smads interagem para regular a metástases em células de carcinoma da mama [8], o papel da p53 mutante, em resposta ao TGFp sinalização no cancro do ovário, foi investigada. p53 e TGFp estão implicadas em muitos cancros, tais como cancro da mama e do pulmão no seu próprio [15], [16] e em concerto [8]. Em cancros da mama e do pulmão, p53 mutante interage com Smads para alterar a transcrição de genes que regulam a metástase [8], mas pouco se sabe sobre como p53 e TGF interagir de câncer de ovário. Factores necessários para o crescimento e metástases em cancros da mama, pulmão, e cancro do cólon pode não ser necessário em cancro do ovário, conduzindo a efeitos específicos de tecidos de sinalização de p53 mutante [17]. Dois genes (

TMEPAI

e

DKK1

) foram estudados com base em seu papel na metástase do câncer de ovário.

TMEPAI

é um regulador negativo induzido por TGF-p [18] e está envolvida na metástase induzida por TGF-p em linhas celulares de carcinoma da mama [18], mas nunca foi descrita para ser co-regulado por p53 e Smads.

DKK1

é um inibidor da sinalização de Wnt, que muitas vezes é regulada no cancro do ovário metastático, e está associada com mau prognóstico [19]. Maspin, uma proteína anti-metastático, também foi escolhido como tem regulamento estabelecido pela p53 e Smads [20]. O estudo avaliou se a expressão de uma das mutações de p53 mais comuns em cancro do ovário (R273H) altera a resposta celular para Smad sinalização para modular a proliferação e migração celular.

Materiais e Métodos

celular cultura

Todos os reagentes foram obtidos em Life Technologies (Carlsbad, CA), a menos que indicado de outra forma. OVCA 420, OVCA 429, e OVCA 432 são linhas celulares que foram publicados anteriormente [21], [22], enquanto as células OVCAR5 estão disponíveis através do National Cancer Institute (NCI), como parte do NCI60 linha de células de tumor tela de drogas anticâncer [ ,,,0],23]. As células OVCA 420, OVCA 429, OVCA 432, e OVCAR5 (presentes do Dr. Gustavo Rodriguez e Dr. Teresa Woodruff na Northwestern University) foram mantidas em meio essencial mínimo (MEM) suplementado com 10% de soro fetal bovino (FBS), 1 % de L-glutamina, aminoácidos não essenciais a 1%, 1% de piruvato de sódio, e 1% de penicilina /estreptomicina. células OVCAR3 foram obtidas de ATCC (Manassas, VA) e mantidas no mesmo meio como acima, com a excepção de suplementação com 20% de FBS. células SKOV3 foram adquiridas de ATCC e mantidas em 5A de McCoy suplementado com 2,3 g de carbonato /L de sódio, 10% de FBS e 1% de penicilina /estreptomicina.

linhas celulares estáveis ​​foram seleccionados usando plasmídeos resistentes a antibióticos que contêm o gene de interesse. células SKOV3 expressam de forma estável p53 mutante R273H [24] (Addgene, o plasmídeo: 16439, doado pelo Dr. Vogelstein, escola Johns Hopkins University of Medicine, Baltimore, MD) foram selecionados utilizando 500 ug /ml de G418 (bio-produtos Gêmeos, West Sacramento , CA) e mantidas em meios contendo SKOV3 200 ug /ml de G418. OVCA 420 células que expressam a p53 de shRNA ou mexidos shRNA (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO) foram seleccionados utilizando 4 ug /ml de puromicina (Sigma-Aldrich) e mantida com 1 ug /mL de puromicina. p53 do tipo selvagem plasmídeo [24] foi comprado de Addgene (plasmídeo Addgene: 16434, doado pelo Dr. Vogelstein, escola Johns Hopkins University of Medicine, Baltimore, MD):

normal imortalizada células epiteliais da superfície do ovário humano (. Iosé 80) foram uma oferta do Dr. Nelly Auersperg na Universidade de Vancouver e foram mantidas em 50% v /v de meio 199 e 50% v /v MCDB (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO), 15% de FBS, 1% de L-glutamina, 1% de penicilina /estreptomicina, e factor de 0,055% de crescimento epitelial (EGF, Pepro Tech Inc, Rocky Hill, NJ) [25]. trompa de Falópio humana células epiteliais secretoras normais (FTSEC) foram uma oferta do Dr. Ronny Drapkin na Universidade de Harvard e foram mantidas em 50% v /v DMEM e 50% v /v F-12 (Mediatech, Manassas, VA), 1% L-glutamina, 1% de penicilina /estreptomicina, e 2% Ultroser G (Pall Corporation, Port Washington, NY) [26]. Mouse células epiteliais da superfície do ovário (MOSE) foram isoladas a partir de ratinhos C57BL /6 e as células epiteliais do rato tubária (MTEC) foram isoladas a partir de ratinhos CD1 como previamente descrito [27]. As células cultivadas foram mantidas a 37 ° C em 5% de CO

2 incubadora.

Luciferase Assay

As células foram plaqueadas a uma densidade de 25.000 por poço em placas de 24 poços e incubadas durante a noite. As células foram transfectadas com 0,05 ug /poço de uma construção de expressão contendo o promotor de elemento de ligação de Smad a montante do gene da luciferase usando Mirus TransIT LT1 (Mirus Bio LLC, Madison, WI) de acordo com as instruções do fabricante. O Smad elemento responsivo plasmídeo contém uma sequência CAGA repetido doze vezes a montante do gene luciferase (oferta do Dr. Aris Moustakas no Instituto Ludwig de Pesquisa sobre o Câncer, Uppsala, Suécia). Os plasmídeos para a expressão de p53 do tipo selvagem ou mutantes de p53 R273H plasmídeos foram transfectados em células em 0,05 ug /mL. As células foram transfectadas durante 24 horas em meio suplementado com soro. As células foram então lavadas com PBS e tratados com TGF-p1 a 10 ng /ml (Sigma Aldrich), durante 24 h. SB-431542 (Selleck Chemicals, Houston, TX) foi utilizado a uma concentração de 5 uM para todos os ensaios de luciferase. O protocolo e eficiências de transfecção SBE-luciferase foram normalizados e correr como descrito anteriormente [28]. atividade luciferase célula normal foi medida usando um Synergy Mx (BioTek, Winooski, VT).

ensaio Proliferação

Sulforodamina B (SRB) Os ensaios foram usados ​​para determinar a densidade celular. As células foram tratadas durante 48 h com o TGF-p (20 ng /mL), seguido por ensaio colorimétrico tal como previamente descrito [29]. A sobrevivência das células foi calculada comparando os valores de absorvância entre poços tratados e de controlo. Fundo foi subtraída pela medição da absorvância de 0,1 mM de base Tris sozinho.

A citometria de fluxo

OVCA 420, OVCA 432, e SKOV3 células foram plaqueadas em frascos T25 24 h antes do tratamento. Foi adicionado meio contendo TGF-p (20 ng /ml) ou controlo de solvente e incubou-se durante 48 h. Após o tratamento, as células foram tripsinizadas, lavadas com PBS, ressuspensas em 500 ul de PBS, depois fixadas em 4 mL de etanol a 70%, e armazenado a -20 ° C durante a noite. As células fixadas foram lavadas com PBS e coradas com 500 iodeto uL de propídio (PI) solução [50 ug /mL de PI, 90 unidades de ARNase A, 0,1% de Triton X-100, /L tampão citrato 4 mmol, 10 mM de polietileno glicol (PEG ) 4000]. As células foram incubadas na solução de PI durante 20 min a 37 ° C antes de ser tratada com 500 solução salina mL de PI (1 mg /mL de PI, 0,1 ml de 10% Triton X-100, solução de NaCl 4 M, PEG 10 mM de 4000) . A análise de citometria de fluxo foi realizada num Beckman Coulter Elite ESP (Miami, FL) com, pelo menos, 30000 eventos individuais por reacção. Os dados foram analisados ​​com o software de ajuste Mod-(Verity Software House Inc., Topsham, ME).

análise Western blot

As células foram colocadas em placas a 50.000 células por poço em placas de seis poços, transfectadas com os plasmídeos adequados, 0,05 ug /mL, e tratou-se com TGF-p1 (10 ng /mL) durante 24 h. Para induzir a express de p53, o tratamento com cisplatina (Fisher Scientific, NC9343338) foi realizada em 125 | iM durante duas horas. A concentração de proteína foi determinada pelo ensaio BCA (Pierce, Rockford, IL). O lisado celular (30 ug) foi analisada por 10% SDS-PAGE e transferidos para nitrocelulose. As manchas foram então bloqueados com leite a 5% em TBS-T, e sondadas durante a noite com anticorpos primários. Os anticorpos utilizados foram o p53 humano (# 9282), p21 (# 9247), maspina (# 9117), CDC2 (# 9112) (Cell Signaling Technology, Inc., Beverly, MA) a uma concentração de 1:1000; DKK1 (H-120) e p21 de ratinho (F-5) (Tecnologia de Santa Cruz, Inc, Santa Cruz, CA) foi utilizado a uma concentração de 1:200; TMEPAI 2A12 (Abnova, Taipei, Tiawan) foi utilizado a uma concentração de 1:500; e actina (Sigma-Aldrich) a uma concentração de 1:1000. Anti-ratinho e de coelho ligado a HRP secundário (Cell Signaling Technology, Inc.) foi usado para todas as manchas a uma concentração de 1:1000.

cicatrização de feridas ensaio

As células foram plaqueadas a 50.000 células por cavidade em uma placa de 24 poços e incubadas durante a noite. Uma ferida uniforme foi criado através da monocamada celular utilizando uma ponta de pipeta. As células foram lavadas e tratadas com TGF-p1 (20 ng /mL) imediatamente depois de coçar. Fotos foram tiradas às 0, 24, e 48 horas após a arranhar, e a área do zero foi analisada com o software ImageJ (National Institutes of Health, Bethesda, MD). fechamento por cento foi medido em comparação com 0 hr e dobre mudança foi determinada a partir cento fechamento de tratados em comparação com não tratada.

Animals, cultura de órgãos e imuno-histoquímica (IHQ)

foram obtidos animais, tratados e alojado como previamente descrito [27]. Os ovários e ovidutos foram dissecados e cultivados como descrito anteriormente [30], [31]. O meio de crescimento consistia de alfa-MEM (Invitrogen), e 1% de penicilina /estreptomicina (Invitrogen) com 0,1% de DMSO, 20 ng /mL TGF-p, 5 uM SB431542 (inibidor de TGF-p), ou 20 ng /mL TGF-p, mais 5 | iM SB431542 adicionado como as condições de tratamento. TGFp foi dissolvido em água, mas 0,1% de DMSO foi adicionada à condição por si só para controlar o TGF-p para SB431542 solvente. Bromodesoxiuridina (BrdU, Sigma; 10? M) foi adicionado ao meio de crescimento 24 h antes da fixação do tecido. Os tecidos foram preparados para seccionamento de parafina e imuno-histoquímica foi concluída como descrito anteriormente [27].

imaging Proliferação

Imagem foi realizada utilizando uma Nikon E600 microscópio com uma câmera DS-Ri1 Digital e NIS Elements Software (Nikon Instruments, Melville, Nova Iorque). ImageJ foi utilizado para quantificar a proliferação de células. proliferação percentual foi calculado dividindo-se o número de células epiteliais coloração positiva para BrdU pelo número total de células epiteliais.

declaração Ética

Todos os animais foram tratados de acordo com os Institutos Nacionais de Saúde Diretrizes para o Cuidado e Uso de Animais de laboratório e estabeleceu institucional Uso de Animais e protocolo de atendimento na Universidade de Illinois em Chicago. O protocolo foi aprovado pela Comissão de Cuidados com Animais da Universidade de Illinois em Chicago (número de protocolo: A08-250). Os animais foram alojados num ambiente de temperatura e luz ambiente controlado (12 horas de luz, 12 horas de escuro) e foram fornecidos alimentos e água ad libitum. Todos os ratos foram sacrificados por CO

2 inalação seguido por deslocamento cervical.

Análise estatística

Todos os valores são apresentados como a média ± o erro padrão. ANOVA seguido por testes de comparações múltiplas de Tukey foram utilizados para avaliar diferenças entre os grupos experimental e controle. Para o ensaio de cicatrização da ferida, um teste t emparelhado foi utilizado para analisar o controlo e tratados em cada linha celular, enquanto um teste t desemparelhado foi utilizado para comparar os grupos tratados entre as duas linhas de células diferentes. p 0,05 foi considerado estatisticamente significativo

Resultados

TGF induz a paragem do crescimento em células de câncer de ovário expressam a p53 selvagem

Para melhor compreender o papel da p53 no cancro do ovário. , seis linhas celulares de cancro do ovário conhecidos foram analisadas quanto à expressão de p53 (Fig. 1a). OVCA 420 e 429 células expressam níveis baixos de proteína p53, consistentes com relatos de que eles têm p53 de tipo selvagem [32]. Devido a estes níveis baixos, o tratamento com cisplatina foi usada para induzir e confirmar a expressão de p53 em OVCA 429 (Fig. S1). SKOV3 e OVCAR5 não demonstrou qualquer expressão da proteína p53, como é consistente com a constatação anterior que os classificados como nulos p53 [7]. Em contraste, OVCA 432, e OVCAR3 exibiram expressão da proteína p53 abundante devido às mutações R277H e R248Q, respectivamente (Tabela S1) [7].

(a) a análise Western blot de linhas celulares de cancro do ovário demonstrando a sua p53 estado. Actina utilizada como um controlo de carga. (B) Seis linhas ovarianos de células de câncer (OVCA 420, 429, SKOV3, OVCAR 5, OVCA 432 e OVCAR 3), juntamente com quatro, linhas primárias não-cancerosas celulares (Mose MTEC, IOSE80 e FTSEC) foram tratados com ou sem TGF-p (10 ng /ml), utilizando o plasmídeo SBE-luc. ANOVA foi realizada separadamente para a indução de dobragem (TGF-p) e dobra a repressão (inibidor e TGFp + inibidor) para analisar significado em comparação com não tratada. Dados representados como a média ± SEM, * p £ 0,05.

Para avaliar a expressão de p53 como modula a capacidade das células para responder à sinalização de Smad, um ensaio de luciferase foi empregue para determinar quais as células foram responsivos à TGFp induzida por transcrição Smad (Fig. 1b). Todas as linhas celulares testadas, excepto OVCAR5, demonstraram a transcrição mediada por TGF-p que podem ser bloqueados por SB431542, um inibidor de TGF-p (dados não mostrados).

Em seguida, o efeito de TGF-p em células progenitoras não-cancerosas foi investigada. Desde epitélio do ovário superfície (OSE) e epitélio das trompas de Falópio (TCE) pode dar origem a cancro do ovário [33], a resposta destas células normais para o TGF-p foi investigada. A fim de monitorar a jusante de sinalização de TGF-p, ensaios de SBE-luciferase foram realizados em OSE 2D normal de murino (MOSE) e células de murino TCE (MTEC), bem como humanas imortalizadas OSE (IOSE80) e Falópio humana epitélio tubo (FTSEC). células OSE e TEC responderam significativamente a transcrição mediada por Smad induzida por TGF-p, tanto do rato e linhas celulares humanas (Fig. 1b). células MOSE respondeu com uma activação vezes maior (21 vezes) do que as células repórter MTEC (7 vezes). expressão da p53 em MOSE era anterior confirmados como sendo do tipo selvagem [27], [34]. células MTEC comportaram-se como do tipo selvagem, em resposta a cisplatina (Fig. S2), enquanto que o IOSE80 e FTSEC eram funcionalmente nula para p53 devido à imortalização com SV40.

Com base nestes resultados, três linhas de células (OVCA 420 , OVCA 432, e SKOV3) foram escolhidos para analisar melhor o impacto da TGF na proliferação. Estas linhas celulares foram tratadas com TGFp (20 ng /mL) durante 48 h e a progressão do ciclo celular foi analisada por citometria de fluxo. tratamento TGF induzida G

0 /G

1 célula parada do ciclo em OVCA 420 (Fig. 2a). OVCA células 432, que expressam a p53 mutante, que não eram interrupção do crescimento por meio do tratamento TGF-p (Fig. 2b). Por último, o TGF-p não induz a paragem do ciclo celular em células SKOV3, mas reduziu o número de células em G

0 /L

1 (Fig. 2c).

(a-c) OVCA 420, OVCA 432, e linhas de células SKOV3 foram tratados com 20 ng /mL de TGF-p durante 24 horas e submetidos a análise de citometria de fluxo. As distribuições de células nas três fases do ciclo celular são representados por percentagens médias +/- SEM. A significância estatística representa uma diferença entre o número de células em cada ciclo entre tratados e não tratados e representada como * por um aumento das células tratadas, em comparação com não tratada;

#represents diminuição das células tratadas, em comparação com não tratada; p £ 0,05 (d) análise Western blot das três linhas de células de cancro do ovário sondadas para proteínas do ciclo celular de p21 e CDC2. Actina foi utilizado como um controlo de carga. (E-F) Ensaio de Proliferação realizada utilizando incorporação de BrdU em cultura de órgãos 3D de ovários de ratinho e tubos. foi realizada ANOVA one-way. Dados representados como média ± SEM * p ≤ 0,05.

Para confirmar ainda mais o mecanismo para a regulação do ciclo celular p53-Smad, expressão da p21 e CDC2 foram avaliados em OVCA 420, OVCA 432, e SKOV3 células tratadas com TGFp (Fig. 2D). p21 é um inibidor da quinase dependente de ciclina, que é regulada por ambas p53 e Smads, e se correlaciona com a prisão TGFp-ciclo celular mediada [4]. CDC2 (ou CDK1) é uma cinase dependente de ciclina e a sua expressão é consistente com a progressão do ciclo celular [35]. tratamento TGFp em OVCA 420 aumentou a expressão da proteína p21 (Fig. 2a e d), o que não foi observado nas células OVCA 432 e SKOV3 (Fig. 2d). As células OVCA 432 e SKOV3 expressa níveis elevados de CDC2, em comparação com OVCA 420 (Fig. 2d). Em seguida, imuno-histoquímica foi realizada para monitorizar a proliferação do epitélio do ovário do rato superfície normal e epitélio oviductal utilizando um sistema de cultura de órgãos 3D [30] tratadas com TGFp. Após 48 horas, a proliferação OSE era diminuíram com o tratamento TGF relação ao controle DMSO (Fig. 2e) significativamente. Apesar de ser transcricionalmente responsivo, a proliferação não era inibida pelo tratamento com TGF-p em células em cultura 3D oviductal (fig. 2f). Imortalização de IOSE80 e FTSEC com antigénio SV40T inactiva p53 [25], [26], por conseguinte, ensaios de crescimento com TGFp não foram realizados com estas células.

paragem do ciclo celular induzida por TGF-p seja revogada no mutante p53 e células nulas

Variantes de OVCA 420 foram criadas para investigar o papel da p53 em paragem do ciclo celular induzida por TGF-p (Tabela S1 e S2). Usando shRNA, endógeno do tipo selvagem p53 efetivamente foi derrubado na OVCA 420 (OVCA 420 p53 shRNA) células, em comparação com o controle shRNA mexidos (OVCA 420 SCR) (Fig. 3a). Além disso, as células SKOV3 foram transfectadas de forma estável para expressar o p53 mutante R273H (Fig. 3a). P53 de tipo selvagem não podiam ser transfectado estavelmente em células SKOV3 porque as células sofreram senescência e não podia ser propagada como descrito anteriormente [36]. transfecção transiente de p53 de tipo selvagem em células SKOV3 não induziu imediatamente a senescência, o que permitiu a recolha de dados a pontos de tempo mais curtos.

(a) a análise Western blot de linhas celulares estáveis ​​de knockdown de p53 pelo plasmídeo shRNA ou expressão R273H de p53 mutante. C = controle, tratados T = TGF. (B) SB-431542 (5 ^ M) foi usada para inibir a sinalização de TGF-p. Para cada painel, os dados representam a média de aumento ± SEM p≤0.05 mais sem tratamento por grupos marcados com um, ou entre grupos tratados marcadas com b. (C) A sobrevivência celular. Percentagem de sobrevivência das células tratadas com TGFp em comparação com não tratada. Os dados representam a média ± SEM, * p £ 0,05.

Primeiro, a capacidade das linhas celulares variantes para responder a TGF-p foi investigada. Todas as linhas celulares estáveis ​​mantiveram a capacidade para induzir a transcrição de Smad-mediada de um plasmídeo SBE-luciferase independentemente do estado de p53 (Fig. 3b). indução de luciferase permaneceu a mesma na OVCA 420 shRNA p53 e OVCA 420 Scr quando em comparação com as células parentais OVCA 420 (Fig. 3b). Da mesma forma, os mutantes de p53 R273H estável células SKOV3 não alterou induzida por TGF-Smad transcrição mediada do gene da luciferase (Fig. 3b). A expressão transiente de p53 de tipo selvagem nas células SKOV3 Smad diminuição da transcrição mediada, em comparação com as células R273H mutante p53 SKOV3, mas não apresentaram nenhuma diferença significativa em comparação com a linha de células progenitoras SKOV3 (Fig. 3b).

a fim de avaliar a proliferação em resposta a TGF-p (20 ng /mL), ensaios de crescimento celular foram realizadas após 48 horas de incubação. Como esperado, OVCA 420 Scr crescimento celular foi reprimida em resposta a TGF-p, o que foi semelhante para a linha parental (Fig. 3c). inibição do crescimento induzida TGF foi perdido no OVCA 420 p53 shRNA. Da mesma forma, TGF fez proliferação não é lento em ambos os pais SKOV3 ou a linha de células R273H mutante p53 SKOV3 (Fig. 3c).

Mutant expressão da p53 R273H impede a migração induzida por TGF de células SKOV3

Além de afectar a proliferação, TGFp e p53 também têm sido mostrados para influenciar a migração de células tumorais a partir da mama e pulmão [8], [9], [37]. literatura anterior sugere que a p53 mutante pode funcionar como um disparador molecular permitindo que o TGF-p para induzir a estímulos pró-migratórias [38]. Portanto, a regulação da migração de células TGF-p na presença do tipo selvagem, mutante e p53 nulo foi investigada utilizando um ensaio de ferida cura. TGF induzida migração em ambos os OVCA 420 RCS e OVCA 420 p53 células shRNA entre 0 e 24 horas e 24 e 48 horas (Fig. 4a). OVCA 420 Scr (p53 de tipo selvagem) as células tratadas com TGFp migrou significativamente mais do que o controlo não-tratado entre 0 e 24 horas, mas não entre 24 horas e 48 horas, enquanto que OVCA 420 p53 células shRNA tratadas com TGFp migraram significativamente mais do que o controle entre 0 e 24 horas e entre 24 e 48 horas (Fig. 4a). taxas migratórias foram comparados entre os tratados OVCA 420 Scr e p53 OVCA shRNA. Knockdown de p53 permitiu um aumento da migração em comparação com as células de tipo selvagem (Fig. 4b).

(a) ensaios para tratamento de feridas foram realizadas em linhas celulares estáveis ​​e SKOV3 OVCA 420. As monocamadas de células foram riscados e tratou-se com ou sem TGF-p a 20 ng /ml durante 48 horas. o fechamento da ferida foi medida como um aumento ou diminuição de dobragem em comparação com o controlo sem tratamento. Teste t pareado foi utilizado com um p ≤ 0,05. (B) comparação do aumento vezes de amostras de TGF-p a partir de 5 (a). Teste t não emparelhado foi utilizado para analisar significado. Significado é representado por * e significa uma diferença estatística entre as linhas celulares. Dados representados como média ± SEM, * p ≤ 0,05.

A capacidade das células mutante p53 R273H nulos e SKOV3 SKOV3 para migrar em resposta a TGF foi também analisado. TGFp migração induzida em células SKOV3 nulos p53 em comparação com células não tratadas entre ambos 0 e 24 horas e entre 24 e 48 horas (Fig. 4a). No entanto, a expressão de p53 mutante R273H em células SKOV3 inibiram a migração de TGFp-induzida, sem alteração entre 0 e 24 horas, ou 24 e 48 horas, quando comparado com o controlo (Fig. 4a). células SKOV3 expressando p53 mutante R273H demonstraram menor migração induzida por TGF que SKOV3 células nulas (Figura 4b).

A expressão de R273H p53 mutante altera TGF-induzida expressão de TMEPAI e DKK1

A fim de elucidar possíveis mecanismos pelos quais p53 e TGFp pode regular a migração, alvos pró-invasivos se sabe serem reguladas por qualquer p53 ou TGF-p em células de cancro do ovário foram investigados. Maspina é um inibidor da protease de serina que bloqueia a metástase [20] e é conhecido por ser co-regulado por p53 e Smads em células epiteliais mamárias [20]. Além disso, a expressão maspina é declaradamente perdido em cancros do ovário, e isto foi associado com taxas de sobrevivência e de prognóstico pobre [39]. Maspina foi minimamente induzida com tratamento TGFp em OVCA420 e OVCA432 células (Fig. 5a), e não foi induzida em SKOV3. Surpreendentemente, maspina não demonstrar uma dependência tratamento TGF-p ou a expressão de p53 em OVCA420 p53 shRNA ou linhas de células mutante p53 SKOV3 R273H (dados não mostrados), em comparação com células-mãe, sugerindo que as vias adicionais modificar p53 e regulação Smad de maspina em células de cancro do ovário.

(a) OVCA 420 (p53 de tipo selvagem), OVCA 432 (mutante p53), e SKOV3 (null p53) as células foram tratadas com 10 ng /mL de TGF-p durante 24 horas e analisadas por western blotting. As membranas foram sondadas com Maspin, TMEPAI anticorpos primários e DKK1. Actina foi utilizado como um controlo de carga interna. (B) As linhas celulares OVCA 420 foram analisadas por Western blot e sondadas para factores pró-metastáticos TMEPAI, e DKK1. Actina foi utilizado como um controlo de carga interna. (C) Linhas de células SKOV3 foram analisadas por Western blot e sondadas para factores pró-metastáticos TMEPAI e DKK1. SKOV3 p53 WT foi transitoriamente transfectadas com 100 ng /ml de p53 de tipo selvagem plasmídeo. Actina foi utilizado como um controlo de carga interna.

TMEPAI é uma proteína induzida por TGF-p que é conhecido para converter o TGF-p a partir de um supressor de tumor em um promotor de tumores em cancro da mama, e está associada com o aumento da migração no próstata e carcinomas renais [18], [40], [41]. A sobre-expressão de TMEPAI tem sido associada com muitos cancros, incluindo cancro do ovário [42]. TGFp aumentou a expressão de p53 em TMEPAI de tipo selvagem OVCA 420 células e células SKOV3 nulos (Fig. 5A). Mutante p53 R277H OVCA 432 células demonstrou uma indução de expressão reduzida TMEPAI. TMEPAI expressão induzida por TGF-p em OVCA 420 mutante p53 R273H células transientes foi reduzida em comparação com o tipo selvagem e as células p53 nulos (Fig. 5b). Da mesma forma, a indução TMEPAI por TGF-p em células p53 mutante R273H SKOV3 foi menor do que a de SKOV3 do tipo selvagem e células p53 nulos (Fig. 5c).

Finalmente DKK1, um inibidor da sinalização de Wnt-, foi seleccionado, uma vez que é diferencialmente regulada pelo tipo selvagem e p53 mutante, e também é sobre-expresso em cancros do ovário estágio metastático final [19]. TGFp expressão induzida de DKK1 em células p53 nulo SKOV3 (Fig. 5a). Este aumento não foi observado no tipo selvagem OVCA 420 ou R277H mutante p53 OVCA 432 células. Em OVCA 420 células, os níveis globais de DKK1 foram maiores no OVCA 420 p53 shRNA, com uma ligeira indução após tratamento TGF (Fig. 5b). OVCA 420 p53 mutante R273H teve a menor quantidade de DKK1, sem indução após tratamento TGF (Fig. 5b).