Abstract

Fundo

sinal do transdutor e ativador de transcrição 3 (STAT3) é uma oncogene, que promove a sobrevivência celular, a proliferação, a motilidade e progressão em células cancerosas. Segmentação de sinalização STAT3 pode levar ao desenvolvimento de novas abordagens terapêuticas para cancros humanos. Aqui, foram examinados os efeitos de galato epigallocathechin (EGCG) sobre STAT3 sinalização em células de cancro do pâncreas, e avaliado o potencial terapêutico de EGCG com gemcitabina ou JAK3 CP690550 inibidor (Tasocitinib) para o tratamento e /ou prevenção do cancro do pâncreas.

Metodologia /Principais achados

A viabilidade celular e apoptose foram medidos por ensaio XTT e coloração TUNEL, respectivamente. expressões de genes e de proteínas foram medidas por qRT-PCR e análise de transferência de Western, respectivamente. Os resultados revelaram que EGCG inibiu a expressão de fosfo e JAK3 total e STAT3, transcrição STAT3 e activação, e a expressão de genes regulados por STAT3, resultando na inibição da motilidade celular, a migração e a invasão, e a indução de caspase-3 e clivagem PARP. A inibição da STAT3 aumentou os efeitos inibidores de EGCG sobre a motilidade celular e a viabilidade. Além disso, gemcitabina e CP690550 sozinho inibiu genes alvo STAT3 e sinergia com EGCG para inibir a viabilidade celular e induzir a apoptose em células de cancro pancreático.

Conclusões /Significado

No geral, estes resultados sugerem que suprime a EGCG crescimento, invasão e migração de células de cancro do pâncreas, e induz a apoptose, interferindo com a via de sinalização da STAT3. Além disso, EGCG melhorada ainda mais o potencial terapêutico de gemcitabina e CP690550 contra o cancro pancreático

citação:. Tang SN, J Fu, Shankar S, RK Srivastava (2012) EGCG aumenta o potencial terapêutico de gemcitabina e CP690550 por inibição da STAT3 via de sinalização em câncer pancreático humano. PLoS ONE 7 (2): e31067. doi: 10.1371 /journal.pone.0031067

editor: Hana algul, Technische Universität München, Alemanha |

Recebido: 11 de maio de 2011; Aceito: 01 de janeiro de 2012; Publicação: 13 de fevereiro de 2012

Direitos de autor: © 2012 Tang et al. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Licença Creative Commons Attribution, que permite uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o autor original ea fonte sejam creditados

Financiamento:. Este trabalho foi apoiado em parte pelas bolsas de Institutos Nacionais de Saúde (R01CA125262, RO1CA114469 e RO1CA125262-02S1) e da Autoridade Kansas Bioscience. Os financiadores não tiveram nenhum papel no desenho do estudo, coleta de dados e análise, decisão de publicar ou preparação do manuscrito

CONFLITO DE INTERESSES:.. Os autores declararam que não existem interesses conflitantes

Introdução

transdução de sinal e activadores da transcrição (STAT) proteínas é uma família de factores de transcrição citoplasmáticos que são inicialmente presente em formas inactivas [1], [2]. Eles são estimulados pela ligação de péptidos de sinalização, tais como citoquinas, factores de crescimento e hormona, o que resulta na dimerização dos seus receptores cognatos e activação de tirosina-cinases, tais como Janus quinase (JAK). As tirosina-cinases activadas fosforilam poderia subsequentemente os domínios citoplasmáticos dos receptores para proporcionar locais de reconhecimento para STATs monómeros não-fosforilados. Uma vez estatísticas são fosforiladas por cinases de tirosina activados após a ligação, eles formam homo ou hetero-dímeros através do seu 2 (SH2) de domínio Src homologia e migram rapidamente para o núcleo, onde os dimeros ligam-se a sequências de ADN para a transcrição do gene específico activa [1] , [2].

Numerosas experiências demonstraram que as funções físicas normais de estatísticas são críticas em muitos aspectos regulação da proliferação celular, diferenciação, migração, sobrevivência e. Entre todos os membros da família STAT, STAT3 é o mais intimamente ligada à sobrevivência e proliferação celular e a tumorigénese [3], [4]. É amplamente expressa na maioria dos tecidos e é considerado como um potencial oncogene. STAT3 é muitas vezes constitutivamente ativo em muitas células cancerosas humanas, incluindo mieloma múltiplo, glioblastoma, leucemia, linfoma, câncer de mama, câncer de próstata, câncer de pulmão e câncer de garganta [5], [6], [7]. STAT3 pode ser activada por várias citoquinas, incluindo IL-6, IL-11, factor neurotrófico ciliar, e factor inibidor de leucemia, que todos utilizam receptores do tipo gp130. Curiosamente, a STAT3 pode contribuir para a sobrevivência ou apoptose, quer em diferentes órgãos e tipos de células. Ele pode promover a proliferação de hepatócitos [8], células neuronais [9], e células T [10], mas é indispensável para a apoptose em mamária [11] e células mielóides [12].

STAT3 é latente um factor de transcrição que reside no citoplasma. Após a activação pela fosforilação da tirosina, dimeriza STAT3, se transloca para o núcleo e se liga ao ADN nuclear para modular a transcrição de genes alvo. STAT3 fosforilação é mediada principalmente através da activação do receptor de tirosina não-proteína da família da cinase de JAK, os quais incluem muitos membros JAK1, JAK2, JAK3 e tirosina quinase 2 [13], [14]. Além disso, a fosforilação da STAT3 pode também ser mediada por interferência com c-Src quinase [13], [14], [15]. Os principais locais de fosforilação em resíduos de tirosina de STAT3 incluem e serina nas posições Tyr

705 e Ser

727, respectivamente, localizados no domínio de transactivação. A activação da STAT3 resultados na expressão de muitos genes alvo necessárias para a sobrevivência de células de tumor (por exemplo, Bcl-X

L, Mcl-1 e survivina), de proliferação (por exemplo, ciclina D1 e c-myc) e angiogénese [e.g. factor de crescimento endotelial vascular (VEGF)], bem como metástase [16]. Assim, via de sinalização STAT3 tem sido um alvo terapêutico favorito para o desenvolvimento de drogas [17], [18].

A gemcitabina (um análogo de nucleosídeo) mostraram benefícios clínicos mais em pacientes com câncer pancreático em comparação com os medicamentos convencionais [19 ]. Alguns inibidores de JAK3 potentes e selectivos, v.g. CP690550, demonstrou uma actividade clínica significativa em cancro [20], [21]. CP690550 representa apenas um ponto de partida para a procura de uma pequena molécula imunossupressora mais seguro, e que um inibidor de JAK3 selectivos de isozima identificado por desenho racional de drogas podem ser substancialmente mais seguro. Nos últimos anos, muitas novas descobertas têm sido adquirida na investigação sobre uma variedade de compostos purificados a partir de produtos naturais. Por exemplo, EGCG é a principal catequina de chá verde e tem sido reconhecida como um importante agente quimiopreventivo e como moduladores da resposta de células de tumor à quimioterapia [22], [23], [24]. Tem sido demonstrado inibir a proliferação de células [25], induzir a apoptose [26], em células tumorais, prevenir a angiogénese [27], modular a invasão e migração de tipos de cancro, e interferir com múltiplas vias de sinalização, incluindo a via de sinalização do factor nuclear-kB [28], via mediada pelo factor de crescimento epidérmico [29], semelhante a insulina-I de crescimento factor de sinalização via de [30], via mitogen-activated proteína quinase dependente de [31], e proteassoma via de degradação [32].

neste trabalho, examinamos os efeitos da EGCG sobre a sinalização STAT3 em células de cancro pancreático humano, e também avaliou os efeitos interativos de EGCG com gemcitabina ou CP690550 inibidor de JAK3 em seu potencial terapêutico. Descobrimos que EGCG inibiu a expressão de JAK3 e STAT3 (fosfo e total), transcrição STAT e de activação, e a expressão de genes regulados por STAT3, resultando na inibição da motilidade celular, a migração e a invasão, e a indução de caspase-3 e clivagens PARP. Inibição de STAT3 por shRNA em células de cancro do pâncreas aumenta os efeitos inibitórios de EGCG sobre a migração celular e a motilidade. Os nossos resultados demonstram que a activação da via de sinalização da STAT3 é crítico para o crescimento de células de cancro do pâncreas e sugerem que EGCG segmentação sinalização STAT3 pode ser uma potencial intervenção terapêutica para o cancro pancreático. Além disso, a combinação de EGCG com gemcitabina ou CP690550 teve efeitos aditivos /sinérgicos sobre a viabilidade celular e a apoptose.

Materiais e Métodos

linhas de células e condições de cultura

o cancro pancreático humano linhas celulares AsPC-1 e PANC-1 foram adquiridos a partir da American Type Culture Collection (Manassas, VA) e cultivadas em RPMI 1640 suplementado com 10% de soro fetal de bovino (Thermo Scientific) e 1% de antibiótico-antimicótico (Invitrogen) a 37 ° C numa atmosfera humidificada de 95% de ar e 5% de CO

2.

transfecção celular

shRNAs STAT3 foram concebidos utilizando BLOCK-iT ™ RNAi Designer (Invitrogen) .O número de acesso foi obtido a partir do banco de genes. As sequências da STAT3 shRNAs (número de acesso: NM_139276) são correspondentes às regiões de codificação 398-416 (5′-CCA CTT TGG TGT TTC ATA A-3 ‘), 1070-1088 (5′-CCCGTCAACAAATTAAGAA-3′), 1448 (A-3 5′-GCC TCT CTG CAG AAT TCA) e 1935-1953 (5’-GGA CAA TAT CAT TGA CCT T-3 ‘) nucleotídeos -1466. células AsPC-1 e PANC-1 foram transfectadas com uma mistura de shRNAs usando Lipofetamine 2000 (Invitrogen). Após 24 horas da transfecção, as células foram tratadas com EGCG. As células foram usadas para a detecção de viabilidade de células, o ensaio de zero, de qRT-PCR e transferência de Western.

Ensaio XTT

As células (1 x 10

4 em 200 ul de meio de cultura por poço) foram semeadas em placa de 96 poços (fundo plano), tratou-se com ou sem drogas e incubou-se durante vários intervalos de tempo a 37 ° C e 5% de CO

2. Antes do fim da experiência, 50 ul mistura de rotulagem de XTT (concentração final, sal interno de 125 ^ M de XTT (hidróxido de sódio 2,3-Bis (2-metoxi-4-nitro-5-sulfofenil) -2H-tetrazólio-5-carboxanilida) e 25 um TPM (fenazina metosulfato) por poço foram adicionados e as placas foram incubadas durante mais 4 h a 37 ° C e 5% de CO

2. a absorvância espectrofotométrica da amostra foi medida utilizando uma placa de microtitulação leitor (ELISA). o comprimento de onda para medir a absorção do produto formazon foi de 450 nm, eo comprimento de onda de referência foi de 650 nm.

/7 Ensaio

as células (3 × 10

4 3 Caspase-por poço ) foram semeadas numa placa de 96 poços com 200 ul de meio de cultura. Aproximadamente 16 horas mais tarde, as células foram tratadas com várias doses de Casapse-3/7 actividade de EGCG. mediu-se de acordo com as instruções do fabricante (Invitrogen).

arranhões ensaio

AsPC-1 e células mexidos STAT3 shRNA foram semeadas em pratos de 6 poços. Quando todas as culturas estavam 50% confluentes, uma cruz foi marcado no centro de cada prato usando uma ponta de 10 ul. As células foram lavadas com PBS e cultivadas em meio fresco. As imagens scratch foram levados sob um microscópio de fluorescência em 0, 24 e 48 horas para as mesmas posições após as células foram tratadas com EGCG.

Transwell ensaio de migração

Para determinar o efeito de EGCG em migração celular, AsPC-1 e células PANC-1 foram plaqueadas em parte superior da câmara para a membrana não revestida (24 cavidades de inserção; tamanho de poro, 8 uM; Corning Costar) a uma densidade de 1 × 10

4 células /bem em meio de RPMI contendo 1% de FBS e deixadas migrar para meio RPMI contendo 10% de FBS na câmara inferior. EGCG foi adicionado às duas câmaras para alcançar a concentração de 0, 20, 40, 60 ^ M, respectivamente. Após 24 h de incubação, as células foram fixadas com paraformaldeído a 4% e coradas com violeta de cristal. As células migradas foram contadas sob um microscópio de luz (quatro campos aleatórios por poço).

Transwell ensaio de invasão

Para determinar o efeito de EGCG na invasão celular, AsPC-1 e células PANC-1

foram plaqueadas no topo da câmara para o Matrigel da membrana revestida (24 cavidades de inserção; tamanho de poro, 8 uM; Corning Costar) a uma densidade de 1 x 10

4 células /poço em meio RPMI contendo 1% de FBS, e permitido invadir para meio RPMI contendo 10% de FBS na câmara inferior. EGCG foi adicionado às duas câmaras para alcançar a concentração de 0, 20, 40, 60 ^ M, respectivamente. Após 48 h de incubação de células não invadidos foram removidos por cotonete de algodão, e invadiram as células foram fixadas com paraformaldeído a 4% e coradas com violeta de cristal. As células invadidas foram contadas sob um microscópio de luz (quatro campos aleatórios por poço).

transfecção transiente e STAT3 repórter

AsPC-1 e células PANC-1 foram cultivadas em placas de 100 mm e transfectadas a 70% confluentes com o plasmídeo repórter pGreenfire1-STAT3 usando Lipofetamine 2000 (Invitrogen). Após 24 h, as células foram tratadas com EGCG (0-80 uM). Após a incubação de 24 h, a actividade da luciferase foi determinada utilizando o Sistema de Ensaio Repórter Dual-Luciferase (Promega), de acordo com as instruções do fabricante num leitor de placas Wallac Victor (multilabel, Perkin-Elmer).

Isolamento de ARN e real -tempo de RT-PCR

O ARN total foi isolado a partir AsPC-1 e células PANC-1, utilizando o reagente TRIzol (Invitrogen). A concentração de RNA foi determinada utilizando Nano Gota 2000 espectrofotômetro. O ADNc foi sintetizado e reacções de RT-PCR foram realizadas utilizando Superscript II (Invitrogen) de acordo com as instruções do fabricante. PCR em tempo real foi realizada no Applied Biosystems 7300 Real-time PCR System, utilizando o seguinte programa: 50 ° C durante 2 min, 95 ° C durante 10 min, e depois 40 ciclos de 95 ° C durante 15 s e 60 ° C durante 1 min. Os iniciadores de PCR foram adquiridos a Realtimeprimers.com. Todas as reacções foram realizadas em triplicado, e a expressão relativa de ARNm alvo em cada amostra foi normalizada com a da média GAPDH

iniciadores de PCR sequências:. GAPDH, iniciador de sentido directo 5′-GAG TCA ACG TTG GAT GTC GT – 3 ‘; iniciador inverso 5’-TTG ATT TTG GAG GGA TCT CG-3 ‘; STAT3, iniciador directo 5’- CCT TTG ACA TGG AGT TGA CC -3 ‘; iniciador inverso 5’-TAA AAG TGC CCA GAT TGC TC -3 ‘; Ciclina D1, iniciador directo 5’- TTC AAA TGT GTG CAG AAG GA -3 ‘, iniciador 5′- GGG ATG GTC TCC TTC ATC TT reverter -3′; c-Myc, iniciador directo 5’- CGA CGA GAC CTT CAT CAA AA -3 ‘, iniciador inverso 5’TGC TGT CGT TGA GAG GGT AG -3′; Survivin, iniciador directo 5’- TCC CTG GCT CCT CTA CTG TT -3 ‘, o iniciador inverso 5′-TGT CTC CTC ATC CAC CTG AA -3′; VEGF, iniciador directo 5’-AGA CAC ACC CAC CCA CAT AC -3 ‘, primer 5’ TGC CAG AGT CTC TCA TCT CC reverter -3 ‘; BclX

L iniciador directo 5′- GCT CTC ACT CCC AGT CCA AA -3 ‘, reverso 5′-GCT GAG GCC ATA AAC AGC TC -3’.

coloração de imunofluorescência

células AsPC-1 e PANC-1 foram cultivadas em meio RPMI contendo FBS a 10% e tratou-se com EGCG (0, 40, 60 uM) durante 24 h. As células foram então fixadas com paraformaldeído a 4% e coradas com anticorpos contra a STAT3 (monoclonal de ratinho IgG1; Cell Signaling) a 4 ° C durante a noite. As células foram lavadas e de novo incubadas com o anticorpo secundário anti-ratinho FITC (Sigma) juntamente com DAPI (0,5 ug /ml). lâminas coradas foram montadas com meio de montagem e visualizados sob um microscópio de fluorescência. Para melhor visualidade, a cor de DAPI foi mudada de azul para vermelho. A cor verde representa a expressão da STAT3.

Western análise de transferência

Para detectar proteínas diferentes, ASPC-1 e células PANC-1 tratadas com EGCG (0-60 M) foram lavadas com PBS e lisadas em tampão RIPA contendo mistura de inibidores de protease 1 ×. Os lisados ​​foram centrifugados e o sobrenadante foi recolhido. As concentrações de proteína foram determinadas usando o ensaio de proteína Bio-Rad (Bio-Rad). Os extractos de proteína (40 ug) foram separados em 12.5% ​​SDS-PAGE. membranas transferidas foram bloqueadas com 5% de leite em pó desnatado e incubadas durante a noite com anticorpos primários em 1:1,000 diluições em TBS, seguido de anticorpos secundários conjugados com peroxidase de rábano em 1:5,000 diluições em TBS-Tween 20 durante 1 hora à temperatura ambiente. As membranas foram desenvolvidas utilizando ECL substrato. As bandas de proteína foram visualizados no filme de raios X usando um sistema de quimioluminescência aumentada.

A análise estatística

A média e o desvio padrão foram calculadas para cada grupo experimental. As diferenças entre os grupos foram analisadas por um ou dois ANOVA utilizando o software Prism análise estatística (GrafPad software Inc., San Diego, CA). diferenças significativas entre os grupos foram calculados em P . 0,05

Resultados

EGCG inibe a migração e invasão de células de câncer de pâncreas, e induz a atividade caspase3

Tem sido demonstrado que a STAT3 desempenha um papel importante na regulação do movimento celular, controlando reorganização do citoesqueleto e propriedades de adesão celular [33]. Devido à correlação entre STAT3 e o movimento celular, foram examinados os efeitos de EGCG sobre a migração e a invasão de AsPC-1 e PANC-1. As células foram plaqueadas no topo da câmara para a membrana não revestida e o revestimento de Matrigel da membrana para a migração e invasão de detecção, respectivamente. Após os tratamentos de EGCG, as células que migraram e invadiram foram coradas e contadas. Os resultados mostram que as células pancreáticas e migraram invadiram reduzido de uma maneira dependente da dose (Fig. 1A e B). Estes dados sugerem que EGCG pode inibir a migração e a invasão de células de cancro do pâncreas.

(A), o ensaio de migração Transwell. células AsPC-1 e PANC-1 foram plaqueadas na câmara superior do Transwell e tratou-se com EGCG (0-60 uM), durante 24 h. As células migraram para o inferior câmaras foram fixadas com metanol, coradas com violeta de cristal e contadas. Os dados representam SD ± média. * Ou ** = significativamente diferente a partir dos respectivos controlos, P 0,05. ensaio de invasão (B) Matrigel. células AsPC-1 e PANC-1 foram plaqueadas em Matrigel da membrana revestida na câmara superior do Transwell e tratou-se com EGCG (0-60 uM) durante 48 h. Células invadidas para a câmara inferior foram fixadas com metanol, coradas com violeta de cristal e contadas. Os dados representam SD ± média. * Ou ** = significativamente diferente a partir dos respectivos controlos, P 0,05. (C), a actividade da caspase-3. AsPC-1 e células PANC-1 foram tratadas com EGCG (0-40 uM) durante 48 h, e a actividade da caspase-3 foi medida de acordo com as instruções do fabricante (Invitrogen). Os dados representam SD ± média. * = Significativamente diferente a partir dos respectivos controlos, P 0,05. (D), células AsPC-1 e PANC-1 foram tratadas com EGCG (0-60 | iM), com ou sem gemcitabina (0,5 uM) durante 48 h. As células foram colhidas e a análise por Western blot foi realizada para examinar a expressão de PARP e caspase-3. β-actina foi utilizado como um controlo de carga. PARP anticorpo reconhece PARP clivada e anticorpo caspase-3 reconhece clivado /caspase-3 activa.

Caspase-3 é um membro da cisteína-protease aspártica ácido (caspase) e a família activado no apoptótica celular tanto por extrínseca (ligando de morte) e vias intrínseca (mitocondrial) [34]. EGCG induziu a actividade da caspase-3 de um modo dependente da dose em ambas as células AsPC-1 e PANC-1, como medido pelo ensaio fluorimétrico (Fig. 1C). Estes dados sugerem que EGCG pode induzir apoptose por activação da caspase-3.

EGCG aumenta a clivagem induzida por gemcitabina de caspase3 e PARP em células de cancro do pâncreas

PARP está normalmente envolvido na reparação do ADN, a estabilidade do DNA , e outros eventos celulares, e clivado por membros da família de caspases durante a apoptose precoce; Por conseguinte, é um substrato para a actividade da caspase e um marcador fiável da apoptose [35]. A seguir, examinar se EGCG e gemcitabina interagir em conjunto para clivar a caspase-3 e PARP em células AsPC-1 e PANC-1. EGCG e gemcitabina sozinha induziu a clivagem de caspase-3 em ambas as linhas celulares. Além disso, a combinação de EGCG com gemcitabina induzida significativamente mais clivagem de caspase-3 que único agente sozinho (Fig. 1D). EGCG e gemcitabina sozinha mostraram clivagem de PARP em AsPC-1 e células PANC-1. Em comparação, a combinação de EGCG com gemcitabina resultou numa clivagem de PARP aumentada. Estes dados sugerem que EGCG pode induzir a apoptose pela ativação da caspase-3 e clivagem PARP.

EGCG inibe JAK3 /via de STAT3 em

câncer pancreático

A seguir, examinou os efeitos da EGCG na expressão de STAT3, fosforilação da STAT3 e JAK3, e expressão nuclear de fosfo-STAT3 em células AsPC-1 e PANC-1. Para examinar os efeitos de EGCG sobre a expressão de STAT3, foi realizada a análise qRT-PCR (Fig. 2A).

(A), células AsPC-1 e PANC-1 foram tratadas com EGCG (0-60 uM) durante 48 h, e a expressão da STAT3 foi medida por Q-RT-PCR. Os dados representam SD ± média. * Ou ** = significativamente diferente a partir dos respectivos controlos, P 0,05. (B), células AsPC-1 e PANC-1 foram tratadas com EGCG (0-60 uM) durante 48 h. A expressão da STAT3, p-STAT3, JAK3 e p-JAK3 foi medido por análise de Western blot. β-actina foi utilizado como um controlo de carga. (C), a expressão de STAT3 em AsPC-1 e células PANC-1. As células foram tratadas com EGCG (0-60 uM) durante 48 h. Após a incubação, a expressão da STAT3 foi medida por immunoflurescence. DAPI foi utilizado para corar núcleos. Para melhor visualidade, a cor de DAPI foi mudada de azul para vermelho. A cor verde representa a expressão da STAT3. A cor vermelha = núcleos.

EGCG inibiu a expressão de mRNA STAT3 em ambas as células AsPC-1 e PANC-1. A seguir, mediu a expressão de JAK3 total e fosforilada e STAT3 por análise de transferência de Western (Fig. 2B). EGCG inibiu a fosforilação de ambos JAK3 e STAT3 de um modo dependente da dose na AsPC-1 e células PANC-1. Surpreendentemente, a expressão de ambos JAK3 e STAT3 foi também inibida por EGCG. Estes dados sugerem que EGCG pode inibir a expressão de JAK3 e STAT3, bem como a sua modificação pós-tradução.

Uma vez que a STAT3 é constitutivamente activa nas células de cancro do pâncreas, que examinaram a próxima EGCG efeitos sobre a expressão de STAT3 por imunofluorescência . Como mostrado na Fig. 2C, EGCG inibiu a expressão da STAT3 (presença da cor verde) de uma forma dependente da dose em ambas as linhas celulares. Estes dados sugerem que a inibição da apoptose por EGCG está associada com a supressão da via JAK3 /STAT3.

EGCG inibe a transcrição STAT3 e expressão de genes regulados por STAT3

STAT3 é considerado como um oncogene porque está correlacionada com a tumorigénese [7]. Portanto, é necessário determinar o efeito de EGCG sobre a actividade de transcrição STAT. células de cancro pancreático foram transfectadas com o plasmídeo repórter pGreen fire1-STAT3 e tratou-se com EGCG (0-80 uM). Após a incubação de 24 h, a actividade de luciferase foi determinada por ensaio de repórter. Como mostrado na Fig. 3A, EGCG inibiu a actividade transcricional da STAT3 de uma maneira dependente da dose nas células do cancro do pâncreas AsPC-1 e PANC-1.

(A), a actividade da STAT3. AsPC-1 e células PANC-1 foram transfectadas com pGreenfire1-STAT3 plasmídeo repórter. As células foram tratadas com EGCG (0-80 uM). Após a incubação de 24 horas, a actividade da luciferase foi determinada usando o Repórter Dual-Luciferase Assay System, de acordo com as instruções do fabricante num leitor de placas multilabel. Os dados representam SD ± média. * = Significativamente diferente a partir dos respectivos controlos, P 0,05. (B), VEGF, Bcl-X

G, c-Myc, survivina e Ciclina D1 foram detectados por qRT-PCR. Os dados representam SD ± média. * = Significativamente diferente a partir dos respectivos controlos, P . 0,05

Estudos anteriores têm demonstrado que a STAT3 pode regular a expressão de muitos produtos de genes envolvidos na proliferação, sobrevivência celular, angiogénese e anti-apoptose [7] . Por exemplo, o VEGF, Bcl-X

G, c-Myc, survivina e Ciclina D1 são reguladas por activação da STAT3 [17], [36]. Como ilustrado na Fig. genes 3B, STAT3-regulados, c-myc, survivina e Ciclina D1 foram inibidas por EGCG no AsPC-1 e células PANC-1. EGCG também diminuiu a expressão de VEGF em células AsPC-1 e Bcl-X

L em células PANC-1. Estes dados demonstram que o EGCG pode inibir a expressão de genes regulados por STAT3 em células de cancro pancreático. Estes genes alvo STAT-3 foram mostrados para regular a proliferação de células, do ciclo celular, apoptose e angiogese.

A inibição da STAT3 aumenta os efeitos inibitórios de EGCG sobre a motilidade celular e a viabilidade em células de cancro do pâncreas

neste trabalho, STAT3 shRNA foi usada para silenciar a expressão do gene STAT3 em AsPC-1 e células PANC-1. STAT3 shRNA inibiu a expressão da STAT3 em ambas as células AsPC-1 e PANC-1, como demonstrado por análise de Western blot (Fig. 4A). Para examinar os efeitos do EGCG em células de câncer de pâncreas, scratch e ensaios de viabilidade celular foram realizados usando ambas as células mexidos e STAT3 shRNA. No ensaio de zero, os efeitos inibidores de EGCG sobre a migração de células AsPC-1 foram melhorada pela inibição da expressão do gene da STAT3 (Fig. 4B). EGCG e STAT3 shRNA sozinho reduzida por cento de AsPC-1 viáveis ​​e células PANC-1 de um modo dependente da dose (Fig. 4C). Curiosamente, os efeitos inibidores de EGCG sobre a viabilidade das células foram ainda reforçadas por STAT3 shRNA em ambas as linhas celulares.

(A), AsPC-1 e PANC-1 foram transfectadas com STAT3 shRNA. A expressão da STAT3 foi realizada por Western blotting. (B), AsPC-1 ensaio de zero. AsPC-1 e células mexidos STAT3 shRNA foram cultivadas em pratos de 6 cavidades. O zero foi marcada quando os pratos foram 50% confluentes. Fotos foram tiradas depois as células foram tratadas com EGCG e incubou-se durante 0, 24 e 48 h. (C), o ensaio de viabilidade celular. células AsPC-1 e PANC-1 (mexidos e STAT3 shRNA) foram semeadas e tratadas com EGCG (0, 20, 40, 60 uM). Depois de 72 h de tratamento, a viabilidade celular foi realizada por ensaio de XTT. Os dados representam SD ± média. * Ou ** = significativamente diferente de seus respectivos controles, P . 0,05

A seguir, examinou os efeitos da STAT3 shRNA sobre a regulação de genes STAT3-alvo por EGCG. EGCG inibiu a expressão de genes regulados por STAT3 ciclina D1 em ambos AsPC-1 /mexidos e PANC-1 /células mexidos (Fig. 5 e B). STAT3 shRNA inibiu completamente a expressão de ciclina D1 em ambas as linhas de células de cancro do pâncreas, na presença ou ausência de EGCG. EGCG ele também inibiu a expressão de Bcl-X

L, e c-Myc em células mexidos /PANC-1. Bcl-X

L, e c-Myc foram também inibidas em PANC-1 /células STAT3 shRNA em comparação com células /mexidos PANC-1. No entanto, EGCG foi incapaz de inibir ainda mais a expressão de Bcl-X

L, e c-Myc em PANC-1 /células STAT3 shRNA. Estes dados sugerem que EGCG pode regular a motilidade das células de cancro do pâncreas e viabilidade que estão associados com a via de STAT3.

(A), AsPC-1 /mexidos e AsPC-1 células /STAT3 shRNA foram tratados com ou sem EGCG ( 60 uM) durante 48 h. A expressão de ciclina D1 foi medida pela Q-RT-PCR. Os dados representam SD ± média. * = Significativamente diferente a partir dos respectivos controlos, P 0,05. (B), PANC-1 /mexidos e PANC-1 /células STAT3 shRNA foram tratados com ou sem EGCG (60 uM) durante 48 h. A expressão de ciclina D1 foi medida pela Q-RT-PCR. Os dados representam SD ± média. * = Significativamente diferente a partir dos respectivos controlos, P 0,05. (C), PANC-1 /mexidos e células PANC 1 /STAT3 shRNA foram tratados com ou sem EGCG (60 uM) durante 48 h. A expressão de Bcl-X

G foi medida por qRT-PCR. Os dados representam SD ± média. * = Significativamente diferente a partir dos respectivos controlos, P 0,05. (D), PANC-1 /mexidos e PANC-1 /células STAT3 shRNA foram tratados com ou sem EGCG (60 uM) durante 48 h. A expressão de c-Myc foi medida por Q-RT-PCR. Os dados representam SD ± média. * = Significativamente diferente de seus respectivos controles, P . 0,05

gemcitabina synergizes com EGCG para inibir a viabilidade celular e induzir a apoptose em células de cancro do pâncreas

A gemcitabina emergiu como um agente quimioterapêutico populares no tratamento de câncer pancreático avançado e metastático, e os benefícios deste agente único é pequeno, mas significativo na melhoria da sobrevida global média [19]. Para testar os efeitos de gemcitabina com EGCG sobre a viabilidade celular, as células cancerígenas pancreáticas foram tratadas com gemcitabina (0,5 | iM), com ou sem concentrações crescentes de EGCG (0-60 uM), durante 72 horas. Como mostrado na Fig. 5A, a viabilidade celular foi inibida por EGCG e gemcitabina sozinha, e os efeitos inibidores de gemcitabina sobre a viabilidade das células foram ainda reforçadas por EGCG nestas duas linhas celulares (Fig. 6A).

(A), AsPC-1 e células PANC-1 foram tratadas com EGCG (0, 20, 40, 60 | iM), com ou sem gemcitabina (0,5 uM) durante 72 h. A viabilidade celular foi medida por ensaio de XTT. Os dados representam SD ± média. * Ou ** = significativamente diferente a partir dos respectivos controlos, P 0,05. (B), células AsPC-1 e PANC-1 foram tratadas com EGCG (0, 20, 40, 60 | iM), com ou sem gemcitabina (0,5 uM) durante 72 h. A apoptose foi medida por ensaio de TUNEL. Os dados representam SD ± média. * Ou ** = significativamente diferente a partir dos respectivos controlos, P 0,05. (C), a inibição da STAT3 genes alvo por EGCG e gemcitabina. células AsPC-1 e PANC-1 foram tratadas com EGCG (20 uM) ou gemcitabina (0,5 uM) durante 48 h. A expressão do VEGF, c-Myc, survivina e ciclina D1was foi medida por qRT-PCR. Os dados representam SD ± média. * = Significativamente diferente de seus respectivos controles, P . 0,05

A seguir, examinou os efeitos interativos de EGCG com gemcitabina na apoptose em linhas celulares de AsPC-1 e PANC-1 (Fig 6B.). EGCG apoptose induzida em ambas as linhas celulares de um modo dependente da dose. Da mesma forma, gemcitabina induzida apoptose em ambas as células AsPC-1 e PANC-1. Todas as doses de EGCG melhorado ainda mais o efeito de gemcitabina na apoptose. Estes dados sugerem que EGCG pode ser combinado com gemcitabina no tratamento de doentes com cancro pancreático.

próxima examinados os efeitos de EGCG e gemcitabina na expressão de c-Myc e ciclina D1 em AsPC-1 e células PANC-1

(Fig. 6C). EGCG e gemcitabina sozinho inibiu a expressão de VEGF, c-Myc, survivina e ciclina D1was em ambas as linhas celulares. A combinação de EGCG e gemcitabina teve efeitos aditivos sobre estes genes alvo. Estes dados sugerem que EGCG pode aumentar o potencial terapêutico de gemcitabina em células de cancro do pâncreas por inibição da STAT3.

CP690550 inibidor de JAK3 inibe a viabilidade das células em células de cancro do pâncreas

CP690550 é um novo inibidor de JAK3 e esperado para segmentar JAK3, que é expressa geralmente apenas em células do sistema imunológico e só é ligado por receptores de citocinas de cadeia gama de suporte envolvidas na via de sinalização de JAK /STAT [37]. A seguir, examinou os efeitos de CP690550 na viabilidade celular em AsPC-1 e células PANC-1 (Fig. 7). CP690550 inibiu a viabilidade celular em ambas as linhas celulares de um modo dependente da dose. Estes dados sugerem que CP690550 pode ser um potencial medicamento anti-cancro para o tratamento de cancro pancreático.

(A), células AsPC-1 foram semeadas em placas de 96 poços a 4 x 10

4 culas por po e tratada com CP690550 (0-15 uM) durante 72 h. A viabilidade celular foi medida por ensaio de XTT. Os dados representam SD ± média. * = Significativamente diferente do controlo, P 0,05. (B), células PANC-1 foram semeadas em placas de 96 poços a 4 x 10

4 células por poço e tratadas com CP690550 (0-15 uM) durante 72 h. A viabilidade celular foi medida por ensaio de XTT. Os dados representam SD ± média. * = Significativamente diferente do controle, P . 0,05

CP690550 synergizes com EGCG para inibir a viabilidade celular em células de câncer de pâncreas

Desde CP690550 apoptose induzida em células de câncer de pâncreas, o próximo procurados para examinar os efeitos interativos de CP690550 e EGCG na viabilidade celular e apoptose das células de câncer de pâncreas (Fig. 8). Como mostrado na Fig.