Abstract

Aqui nós relatamos que 3′-hydroxypterostilbene (HPSB), um análogo pterostilbene natural, foi mais potente que pterostilbene contra o crescimento de células de cancro humano (COLO 205, HCT-116 e HT-29) com IC medido

50 valores de 9,0, 40,2, e 70,9 uM, respectivamente. Descobrimos que HPSB efetivamente inibiu o crescimento de células cancerígenas do cólon humano através da indução de apoptose e autofagia. Autophagy ocorreu numa fase inicial e foi observado através da formação de organelos vesiculares ácidas e produção de proteína associada a microtúbulos uma cadeia leve de 3-II. Ao nível molecular, os resultados da análise de Western blot mostrou que HPSB fosfatidilinositol significativamente regulada negativamente 3-quinase (PI3K) /Akt e cinases de proteína activada por mitogénio (MAPK) sinalizações incluindo diminuiu a fosforilação do alvo da rapamicina em mamíferos (mTOR). Foram demonstrados efeitos terapêuticos significativos

in vivo

tratando ratinhos nus portadores de COLO 205 xenotransplantes tumorais com HPSB (10 mg /kg

i.p.

). Estes efeitos inibidores foram acompanhadas por mecanicista a sub-regulação dos níveis de proteína de ciclo-oxigenase-2 (COX-2), matriz metalopeptidase-9 (MMP-9), factor de crescimento endotelial vascular (VEGF), e ciclina D1, bem como pela a indução de apoptose em tumores do cólon. Nossos resultados sugerem que HPSB poderia servir como um novo agente promissor para o tratamento do cancro do cólon

Citation:. Cheng T-C, Lai C-S, Chung M-C, Kalyanam N, Majeed M, Ho C-T, et al. (2014) Potent efeito anti-câncer de 3′-Hydroxypterostilbene no cólon humano xenoenxerto tumores. PLoS ONE 9 (11): e111814. doi: 10.1371 /journal.pone.0111814

editor: Ying-Jan Wang, da Universidade Nacional Cheng Kung, Taiwan

Recebido: 08 de agosto de 2014; Aceito: 08 de outubro de 2014; Publicação: 12 de novembro de 2014

Este é um artigo de acesso aberto, livre de todos os direitos autorais e pode ser livremente reproduzido, distribuído, transmitido, modificado, construído em cima, ou de outra maneira usado por qualquer pessoa para qualquer finalidade lícita. O trabalho é feito disponível sob a dedicação de domínio público da Creative Commons CC0

Data Availability:. Os autores confirmam que todos os dados subjacentes às conclusões estão totalmente disponíveis sem restrições. Todos os dados relevantes estão dentro do papel

Financiamento:. Este estudo foi apoiado pelo Conselho Nacional de Ciência NSC 101-2628-B-022-001-MY4, 102-2628-B-002-053-MY3, e NTU-103R7777 (por Dr. Pan) e pela saúde e bem-estar sobretaxa de produtos do tabaco MOHW103-TD-B-111-01 (por Dr. Ho). Sabinsa Corporação forneceu apoio sob a forma de salários para os autores NK MM, mas não tinha nenhum papel adicional no desenho do estudo, coleta de dados e análise, decisão de publicar ou preparação do manuscrito. Os papéis específicos destes autores são articuladas na seção “autor contribuições ‘

Conflito de interesses:. NK e MM são funcionários da Sabinsa Corporation. Não há patentes, produtos em desenvolvimento ou produtos comercializados a declarar. Isto não altera a adesão dos autores para todas as políticas de PLoS One sobre os dados e materiais de compartilhamento.

Introdução

Os estudos epidemiológicos fornecem evidências convincentes de que fatores dietéticos pode modificar os processos de carcinogênese, incluindo a iniciação , promoção e progressão de vários tipos de cancro humano [1]. quimioprevenção do cancro é a utilização de agentes farmacológicos ou naturais para inibir o desenvolvimento de cancro invasivo ou reverter o processo de carcinogénese. Poderia ser o processo mais direto para reduzir a morbidade e mortalidade por doenças cancerosas [2] – [4]. Um grande número de agentes quimioterapêuticos e quimiopreventivos, a partir de produtos naturais, têm sido utilizados como uma estratégia promissora para lutar contra o cancro através da indução de apoptose em células malignas [5], [6].

Pterostilbene (

trans

-3,5-dimetoxi-4′-hydroxystilbene), um análogo de éter dimetílico de resveratrol, é encontrado para ser tão eficaz como o resveratrol na prevenção de lesões pré-neoplásicas induzida por carcinogénico num modelo de cultura de mamar io de ratinho e inibe o crescimento metastático de células de melanoma para o fígado [7], [8]. Nós e outros autores mostraram que pterostilbene exibe efeitos farmacológicos pleiotrópicas incluindo anti-inflamatória, anti-oxidante e anti-proliferativa, anti-cancro, e actividades analgésicas em cultura de células e estudos com animais [9] – [14]. Recentemente, 3′-hydroxypterostilbene (Fig. 1), um novo análogo pterostilbene natural tem sido isolada a partir de

Sphaerophysa salsula

, é marcadamente mais activa do que pterostilbene na indução de apoptose em células sensíveis e resistentes de leucemia [15], [ ,,,0],16]. No entanto, a

In vivo

efeito antitumoral de HPSB permanece obscura.

Autophagy, também conhecida como tipo II, a morte celular programada, é caracterizada pela formação de uma dupla membrana ou isolamento membrana que derivada a partir de uma parte do retículo endoplasmático (ER) [17] ou a partir do conjunto de lípidos cytolplasmic [18]. O formas autophagosome dupla membrana por porções sequestrar do citoplasma e organelas intracelulares [11], [12], [19], [20].

A autofagia é uma resposta das células eucarióticas a várias tensões microambiente, incluindo a fome, a infestação patogénica e quimioterapia. Além disso, há também vários relatórios demonstrou que a indução autofagia parece facilitar a morte induzida pela terapia bem-sucedida de células de tumor [21], e drogas pró-autofágicos tais como temozolomida são candidatos promissores para a morte selectiva de glioblastomas resistentes à apoptose [22].

O sinal de início para a formação autofagia é pouco compreendida, apesar de se ter demonstrado que várias moléculas e vias de sinalização estão implicados na regulação da autofagia, tais como PI3K, AKT-mTOR (fosfatidilinositol 3-quinase /proteína-quinase B /alvo da rapamicina em mamíferos), MAPKs, Raf-1-MEK1 /2-ERK1 /2 e PTEN (fosfatase e tensina homólogo) vias [10], [23]. PTEN e AKT são reguladores a montante da via mTOR que actuam como um indutor ou inibidor de autophage, respectivamente. AKT inibe autophage regulando a jusante molecular 4E-BP1 (4 proteína alongamento-bind 1), p70S6K que resultam na promoção da tradução do mRNA.

Neste estudo, examinamos primeiro os efeitos antiproliferativos de pterostilbene e sua natural 3 ‘derivado hidroxi em células cancerígenas do cólon humano. Os nossos resultados demonstram claramente que HPSB foi mais potente do que pterostilbene na indução de apoptose de um modo dependente da dose em células COLO 205.

ainda avaliados os mecanismos moleculares dos efeitos apoptóticos induzidos pela autofágicos e HPSB. Para elucidar o mecanismo anticancerígeno de HPSB, investigamos as vias de sinalização relacionadas a autofagia induzida HPSB em COLO 205 células cancerígenas do cólon humano.

In vivo

eficácia terapêutica foi ainda examinado por tratamento de ratinhos nus portadores de COLO 205 xenotransplantes tumorais com 10 mg /kg

ip

HPSB. Este estudo fornece evidências de romance que o derivado de hidroxilo de pterostilbene poderia servir como um agente novo e promissor contra o câncer de cólon humano.

Materiais e Métodos

2.1 Reagentes

iodeto de propídio ( PI), laranja de acridina (AO) e cloroquina (CQ) foi adquirido da Sigma Chemical (St. Louis, MO, EUA). 2 ‘, 7′-Dichlorodihydrofluorescein diacetato (DCFH-DA) e iodeto de 3,3’-dihexyloxacarbocyanine (DiOC6) foram adquiridos de Molecular Probes (Eugene, OR, EUA). A PARP, DFF-45, LC-3 I /II, p-mTOR (Ser

2448), mTOR, p-p70S6K (Thr

398), p-p70S6K (Ser

371), p -Akt (Ser473), Akt, PI3K, P-ERK1 /2 (Thr202 /Tyr204), p-JNK1 /2 (Thr183 /Tyr185), JNK1 /2, p-p38 (Thr180 /Tyr182), p38 e MMP-9 Os anticorpos foram adquiridos da Cell Signaling Technology (Beverly, MA). O p85α p-PI3K (Tyr508), ERK1 /2, VEGF e anticorpos ciclina D1 foram adquiridos a partir de Santa Cruz Biotechnology (Santa Cruz, CA). Os 3, 8 e 9 anticorpos caspase foram adquiridos de Imgenex (San Diego, CA, EUA). O anticorpo de COX-2 foi adquirido de Transduction Laboratories (BD Biosciences, Lexington, KY). O anticorpo β-actina foi adquirido de Sigma Chemical Co. (St. Louis, MO). Pterostilbene e HPSB foram obtidos a partir de Sabinsa Corp. (East Windsor, New Jersey). A pureza de pterostilbene e HPSB foi determinada por HPLC tal como superior a 99,2%.

2,2 cultura celular

O cancro do cólon humano Colo linhas de células 205, HCT-116 e HT-29 foram adquiridos a partir de a American Type Culture Collection (Rockville, MD). As linhas celulares foram cultivadas em meio RPMI-1640 suplementado com soro a 10% inactivado pelo calor fetal de bovino (GIBCO BRL, Grand Island, NY), 100 unidades /mL de penicilina, 100 ug /mL de estreptomicina), 2 mM de L-glutamina (GIBCO BRL, Grand Island, NY), e foram mantidos a 37 ° C numa atmosfera humidificada de 5% de CO

2 incubadora. Pterostilbene e HPSB foram dissolvidos em dimetilsulfóxido (DMSO, como a concentração final de 0,05%). As células foram tratadas com 0,05% de DMSO como controlo do veículo.

2.3 Ensaio de Citotoxicidade

A viabilidade celular foi ensaiada por 3- (4,5-dimetiltiazol-2-il) -2,5-difenil brometo de tetrazólio (MTT). Resumidamente, COLO 205, HCT-116 e HT-29 células foram plaqueadas a uma densidade de 2 × 10

5 células /mL em placas de 96 poços. Após crescimento durante a noite, as células foram tratadas com uma série de concentrações de pterostilbene ou 3′-hydroxypterostilbene durante 24 h. As concentrações finais de DMSO no meio de cultura foram 0,05%. No final do tratamento, foi adicionado 0,2% de MTT e as células foram incubadas durante mais 4 h. A viabilidade celular foi determinada por varredura com um leitor de ELISA com um filtro de 570 nm.

2.4 A citometria de fluxo análise da população de células sub-G1, potencial de membrana mitocondrial e ROS

produção

Para sub-G1 análise da população de células, as células COLO 205 (2 × 10

5 células /mL) foram cultivadas em 12 poços e tratamento com várias concentrações de pterostilbene ou 3′-hydroxypterostilbene durante 24 h. As células foram então colhidas, lavadas com PBS, ressuspensas em 200 ul de PBS, e fixado em 800 mL de etanol gelado a 100% a -20 ° C. Depois de ser deixada em repouso durante a noite, os sedimentos celulares foram recolhidos por centrifugação, ressuspensas em 1 ml de tampão hipotónico (0,5% de Triton X-100 em PBS e 0,5 ug /ml de ARNase) com PI (50 ug /ml) e incubou-se a 37 ° C no escuro durante 30 min. A fluorescência emitida a partir do complexo de ADN-PI foi quantificada após excitação do corante fluorescente por citometria de FACScan (Becton Dickinson, San José, CA). No estudo inibidor autofagia, as células foram pré-tratados 25 uM CQ durante 1 h, seguido de incubação com pterostilbene ou HPSB.

Para potencial de membrana mitocondrial e a produção de ROS, células foram tratadas tal como descrito acima durante 15 min, e, em seguida, DiOC6 (40 nM) ou DCFH-dA (20 uM) foi adicionado ao meio durante mais 30 min a 37 ° C. Após lavagem com PBS, a intensidade de fluorescência foi determinada por citometria de FACScan.

2.5 Detecção de autofagia

indução

Autophagy foi detectado por coloração com OA. Após 24 h de tratamento, as células COLO205 foram lavadas com PBS, suspensas em PBS e coradas com 1 ug /mL de AO 20 min. As fotografias foram obtidas com um microscópio de fluorescência (Axioscop, Carl Zeiss, Thomwood, NY), equipado com uma lâmpada de mercúrio de 100 W, 490 nm passa-faixa azul filtros de excitação, um espelho e dicróicas 500 nm uma longa-pass 515-nm filtro de barreira. Para a quantificação da avos por citometria de fluxo, as células foram tratadas como descrito acima e corado com AO durante 15 min e foram analisadas por FACScan do laser de fluxo FACSCalibur e o software CellQuest.

2,6 Western Blotting

As proteínas totais de células COLO 205 foram extraídas por meio de adição de tampão de lise de ouro (Tris-HCl a 50, pH 7,4; NaF 1 mM; NaCl 150 mM; EGTA a 1 mM; fenilmetanossulfonil fluoreto de 1 mM; 1% de NP-40; e 10 ug /mL leupeptina) para as peletes de células em gelo durante 30 minutos, seguido por centrifugação a 10.000 x g durante 30 min a 4 ° C. As proteínas totais foram medidas por Bio-Rad Protein Assay (Bio-Rad Laboratories, Munique, Alemanha). As amostras (50 ug de proteína) foram misturados com tampão 5 × amostra contendo Tris-HCl a 0,3 (pH 6,8), 25% de 2-mercaptoetanol, 12% de sulfato de dodecilo de sódio (SDS), EDTA 25 mM, glicerol a 20%, e 0,1% de azul de bromofenol. As misturas foram cozidos a 100 ° C durante 5 minutos e foram submetidas a 10% minigéis SDS-poliacrilamida com uma corrente constante de 20 mA. A electroforese foi então realizada em géis de SDS-poliacrilamida. As proteínas no gel foram electrotransferidas sobre uma membrana de imobilidade (PVDF; Millipore Corp., Bedford, MA) com tampão de transferência constituído por Tris-HCl 25 (pH 8,9), glicina 192 mM e metanol a 20%. As membranas foram bloqueadas com uma solução contendo Tris-HCl 20 de bloqueio, e, em seguida, imunotransferidas com diferentes anticorpos primários e β-actina. As membranas foram lavadas três vezes com tampão PBST (0,2% de Tween 20 em 1 × tampão de PBS) durante 10 min cada. Em seguida, as manchas foram incubadas com 1:5000 diluição da peroxidase de rábano (HRP) -conjugated anticorpo secundário (Zymed Laboratories, San Francisco, CA) e depois lavou-se novamente três vezes com tampão PBST. As proteínas transferidas foram visualizadas com um kit de detecção de quimioluminescência aumentada (ECL; Amersham Pharmacia Biotech, Buckinghamshire, Reino Unido). As densidades das bandas foram quantificados com um densitômetro computador (AlphaImagerTM 2200 Sistema Alpha densitômetro. Innotech Corporation, San Leandro, CA).

2.7 Atividade de caspases

A caspase 3, 8 e 9 actividade em extracções de proteínas de células COLO 205 foi determinada por um ensaio de fluorogénico (CaspACE Assay System da Promega, Madison, WI). Resumidamente, 50 ug de proteína total, conforme determinado pelo kit de ensaio de proteína Bio-Rad (Bio-Rad Laboratories), foi incubada com o substrato 50 jiM de Ac-Asp-Glu-Val-Asp-metilcumaril-7-amina (caspase-3 substrato específico), Ac-Ile-Glu-Thr-Asp-AMC (Ac-IETD-AMC) (caspase-8 específico substrato), ou Ac-Leu-Glu-His-Asp-AMC (Ac-LEHD-AMC) ( caspase-9 substrato específica) a 30 ° C durante 1 h. A liberação de metilcumaril-7-amina foi medido por excitação a 360 nm e emissão a 460 nm usando um espectrofotômetro de fluorescência (ECLIPSE, Varian, Palo Alto, CA).

2.8 COLO modelo 205 xenotransplante

Homem Balb /c ratos pelados em 3-4 semanas de idade (pesando 16-18 g) foram obtidos a partir do Centro Experimental BioLASCO animal (BioLASCO, Taipei, Taiwan). Todos os animais foram mantidos em isoladores esterilizados e isentos de agentes patogénicos, num ambiente controlado (25 ± 1 ° C em 50% de humidade relativa) e com uma 12 h de luz-escuro de 12 h ciclo de acordo com as orientações institucionais. Os animais foram alimentados com dieta padrão AIN-76 e todos os alimentos, água, enjaulamento, e roupa de cama foram esterilizadas antes do uso. Os animais tiveram livre acesso a comida e água em todos os momentos. copos alimentos foram repostos com dieta fresco todos os dias. Todos protocolo experimental animal utilizado neste estudo foi aprovado pelo Institutional Animal Care e Use Committee da Universidade Nacional Kaohsiung Marine (IACUC, NKMU, # 099-AAA9-02, datas de validade: 08/01 /2009-07 /31/2012) . Após uma semana de aclimatação, as células do cancro do cólon COLO 205 (5 × 10

6) em 0,2 mL de PBS foram injectados por via subcutânea entre as escápulas de cada ratinho nu. Após o transplante, o tamanho do tumor foi medida utilizando compassos de calibre, e o volume do tumor foi estimado de acordo com a seguinte fórmula: Volume do tumor (mm

3) = L x W2 /2, onde L é o comprimento e W é a largura. Uma vez que os tumores atingiram um tamanho médio de 100-200 mm

3, os ratinhos foram divididos ao acaso em três grupos (6 animais /grupo). Os ratos foram

i.p

. injecção com pterostilbene ou 3′-hydroxypterostilbene (10 mg /kg /d, respectivamente) durante 15 dias, enquanto os animais de controlo foram receberam uma injecção de óleo de milho. A ingestão de dieta e o peso corporal de cada animal foi monitorizada diariamente. O volume do tumor foi avaliada e registada a cada 5 dias, utilizando medições de calibre. Após 15 dias, os ratinhos foram sacrificados por CO

2 asfixia e o fígado, rins, baço e tumores sólidos foram excisados ​​e pesados ​​imediatamente. O volume médio do tumor e peso do tumor de cada grupo foram representam a média ± desvio padrão (SD). Os tecidos tumorais foram cortados em vários parcela para análise parafuso ocidental ou armazenadas a -80 ° C.

2.9 estatística A análise

Os dados foram apresentados como médias ± SE para o número indicado de experimentos realizados de forma independente . Comparações de significância estatística entre os grupos foram feitas por análise de teste t ou one-way uma forma de Student de variância (ANOVA). A

P

-valor. 0,05 foi considerado estatisticamente significativo

Resultados

3.1 A inibição da proliferação celular em HPSB-trataram células cancerígenas do cólon humano

em primeiro lugar, comparou os efeitos da pterostilbene e HPSB (Figura 1) sobre o crescimento de células cancerígenas do cólon humano usando o ensaio de exclusão de azul de tripano como descrito anteriormente. Como mostrado na Figura 2, HPSB diminuição do crescimento celular em células de cancro de cólon humano em cultura (COLO 205, HCT-116 e HT-29) de um modo dependente da dose, com IC

50 valores de 9,0, 40,2, e 70,9 ? M, respectivamente (Tabela 1). O efeito inibitório sobre-crescimento de células COLO 205 e células HCT-116 (p53 de tipo selvagem) foi sensível a HPSB em comparação com HT-29 (mutante p53). Estes resultados sugerem que a p53 pode ser um regulador chave em células COLO 205. Em comparação com pterostilbene, HPSB foi um inibidor mais forte do crescimento de células COLO 205. Como resultado, examinámos ainda mais os efeitos citotóxicos da HPSB em células COLO 205.

As células foram tratadas com várias concentrações (5, 10, 25 e 50 uM) de pterostilbene ou 3′-hydroxypterostilbene durante 24 h. (A) A determinação de células sub-G1 em células COLO 205 por citometria de fluxo, após coloração de PI, como descrito nos Materiais e Métodos. (B, C) Após o tratamento, os lisados ​​celulares totais foram preparados a partir de células COLO 205 e a clivagem de PARP, DFF-45, pro-caspase 8 e pró-caspase 9 foram analisados ​​por transferência de Western. (D) Cinética da activação da caspase em células COLO 205. As células foram tratadas com 25 e 50 uM de pterostilbene ou 3′-hydroxypterostilbene durante 24 h. actividades de caspase foram analisadas tal como descrito nos Materiais e Métodos. (E) As células foram tratadas com 50? M de pterostilbene ou 3′-hydroxypterostilbene durante 15 min. potencial de membrana mitocondrial e produção ROS foram coradas com DiOC6 (40 nM) e DCFH-DA (20 mM) e medido por citometria de fluxo. Os valores são expressos como média ± SE de ensaios em triplicado. *

P

. 0,05 indica diferença estatisticamente significativa em relação ao grupo tratado com pterostilbene

3.2 HPSB apoptose induzida em células de carcinoma colorectal humanos

Fluxo citometria foi utilizado para investigar a indução de uma população de células sub-G1, uma característica da apoptose. Para investigar se os efeitos citotóxicos da HPSB observada em células COLO 205 foram devidas a morte celular por apoptose, as células foram tratadas com pterostilbene e HPSB (5-100 uM) durante 24 h e o teor de ADN das células COLO 205 foram realizados por citometria de fluxo (Figura 2A). Como mostrado na Figura 2A, as percentagens de células apoptóticas COLO 205 foi de 6,2, 8,4, 10,2, 14,8, e 7,2 e 9,3, 20,1, e 36,3%, após a incubação com 5, 10, 25, e 50 uM pterostilbene e HPSB, respectivamente. A Figura 2B em comparação com pterostilbene, HPSB marcadamente causar a degradação de PARP 116 kDa em 85 fragmentos kDa e induzir DFF-45 a degradação da proteína. Estas clivagens de proteína foram associados com a activação de caspase-3. Tal como mostrado na Figura 2C, HPSB induziu um aumento dramático na clivagem de caspase-9 que pterostilbene. No entanto, apenas menos efeito sobre a actividade de caspase-8 em células tratadas HPSB. Para monitorizar a actividade enzimática de caspase-3, -8 e -9, actividade de caspase foi medida após o tratamento de células COLO 205 com HPSB 10 e 50 uM. Como se mostra na Figura 2D, HPSB induziu um aumento dramático na actividade da caspase-3 de aproximadamente 2,4 vezes depois de 24 h de tratamento. Recentemente tornou-se claro que a apoptose envolve uma ruptura da integridade da membrana mitocondrial que é decisivo para o processo de morte celular. Portanto, foram avaliados os efeitos de HPSB sobre o potencial transmembranar mitocondrial (ΔΨ

m). Os resultados de medição da intensidade de fluorescência em células COLO 205 expostos para pterostilbene e HPSB em comparação com células de controlo não tratadas encontram-se resumidos na Fig. 2E. O DiOC6 (3) a intensidade de fluorescência deslocado para a esquerda 224-117 e 75 em pterostilbene e HPSB induzida 205cells COLO apoptóticas, respectivamente. Estes resultados confirmaram que HPSB causou uma diminuição no potencial de trans-membrana mitocondrial em células COLO 205. O papel das ROS na indução de apoptose é bem reconhecido. Curiosamente, HPSB diminuiu marcadamente a média da intensidade de fluorescência DCFH-DA 114-38, ao passo que o aumento pterostilbene DCFH-DA a intensidade da fluorescência 114-141 aos 15 min. O desequilíbrio das concentrações de ROS poderia desempenha um papel importante como mediador no início de apoptose induzida por HPSB.

3.3 HPSB mostraram efeitos indutores fortes na autofagia que pterostilbene em células COLO 205

Evidências acumuladas indica claramente pterostilbene que tem a capacidade de anti-tumorigenese através da indução de apoptose e autofagia. A seguir, avaliou se pterostilbene e HPSB autofagia também induziu em células COLO 205. Como mostrado na Figura 3A, o tratamento HPSB resultou no aparecimento acentuado de AVO pterostilbene do que quando as células foram coradas com laranja de acridina, após 24 h de tratamento. Para quantificar a incidência de autofagia induzida HPSB, células com avos observado aumento na fluorescência vermelha analisados ​​por fluxo que aumentou de forma significativa após o tratamento com HPSB de um modo dependente da dose (Figura 3B e 3C). Para confirmar a ocorrência de autofagia induzida por pterostilbene e HPSB, examinou-se o processo de LC3I /II, marcas de autofagia, utilizando imunotransferência de lisados ​​de detectar extraído de células a partir de células COLO 205. Tal como mostrado na Figura 3D, HPSB mais forte aumento das quantidades de proteínas LC3B I /II do que pterostilbene.

As células foram tratadas com 50? M pterostilbene ou 3′-hydroxypterostilbene durante 24 h e coradas com acridina laranja. (A) a fluorescência verde e vermelha nas células manchadas de laranja de acridina foram observadas ao microscópio de fluorescência. (B, C) Detecção e quantificação de autofagia em células COLO 205. As células foram tratadas com 25 e 50 uM de pterostilbene ou 3′-hydroxypterostilbene durante 24 h e coradas com acridina laranja. A medição de fluorescência verde e vermelha nas células coradas com laranja de acridina foi efectuada utilizando citometria de fluxo. (D) Os lisados ​​celulares foram preparados 24 h após o tratamento e a expressão da proteína de LC3 I /II foram analisadas por transferência de Western. Os dados foram apresentados como média ± SD de experiências em triplicado. *

P Art 0,05 indica diferença estatisticamente significativa em relação ao grupo tratado com pterostilbene

3.4 HPSB inibiu a mTOR /p70S6K, PI3K /Akt e MAPKs vias de sinalização em células COLO 205.

Para entender melhor os mecanismos moleculares de HPSB autofagia induzida em 205 células COLO, examinamos a fosforilação de mTOR /p70S6K, PI3K /Akt, e MPAKs em HPSB células tratadas. Os resultados mostraram que a fosforilação de mTOR e p70S6K (Thr389) foi marcadamente reduzida em células tratadas com HPSB (Figura 4A). O acúmulo de evidências suporta que PI3K /Akt e MAPKs vias estão envolvidas na regulação da autofagia, no entanto, o JNK1 /2 nesta via ainda precisa ser esclarecida. Portanto, nós investigamos como estas vias de sinalização funcionava na indução de autofagia por HPSB em células COLO 205. Como mostrado na Figura 4B e 4C, a fosforilação de PI3K, AKT e MAPK p38 diminuiu nas células tratadas com HPSB de um modo dependente do tempo. Pelo contrário, o tratamento com HPSB aumentou a ERK1 /2 e JNK1 /2 eficazmente durante 1 h, em seguida, diminuiu gradualmente a fosforilação de ERK1 /2 e JNK1 /2 a partir de 3 horas a 9 h em comparação com um total de ERK1 /2 e JNK1 /2 proteína em células COLO 205. Tomados em conjunto, estes resultados indicam que HPSB inibe a via PI3K /Akt /mTOR /p70S6K, e vias de p38MAPK e activa os /2, JNK1 /2 MAPK ERK1 e sugere que estas alterações mediar autofagia induzida HPSB em células COLO 205.

células COLO 205 foram tratadas com 50? M 3′-hydroxypterostilbene em momentos diferentes. lyates celulares foram preparados e os níveis de proteína de (A) p-mTOR, p-p70S6K, (B) p-PI3K, P-Akt e (C) P-ERK1 /2, p-JNK1 /2, p-p38 eram analisado por análise de transferência de Western. Todas as análises foram representativas de pelo menos três experiências independentes. Os valores em cada pista indicam densidade relativa da banda normalizada para p-actina usando um densitômetro.

Além disso, utilizou-se cloroquina (CQ), um inibidor da autofagia, para determinar se a inibição da autofagia citotoxicidade induzida por HPSB suprimida. Como mostrado na Figura 5, os resultados indicaram que o tratamento com CQ revelou aumento significativo da citotoxicidade (Fig. 5A) com o aumento da apoptose desencadeada HPSB-(Fig. 5B e 5C). Estes resultados corroboram com a observação de que o tratamento induz a morte celular HPSB autophagic em células COLO 205.

As células foram pré-tratadas com CQ 25 uM durante 1 h antes do tratamento com 50 uM de pterostilbene ou 3′-hydroxypterostilbene durante 24 h. (A) A viabilidade celular foi determinada pelo ensaio de MTT. (B, C) Sub-população de células G1 (%) foi analisada e quantificação após coloração PI seguido por citometria de fluxo. Os dados foram apresentados como média ± SD de experiências em triplicado.

*

P Art 0,05 e

**

P

. 0,01 indica diferença estatisticamente significativa em relação ao grupo tratado com pterostilbene

3,5 HPSB crescimento do tumor inibiu fortemente a

in vivo

Foram examinados ainda mais a eficácia terapêutica do HPSB

in vivo

tratando ratinhos nus portadores de carcinoma colorretal humano COLO 205 xenotransplantes tumorais, utilizando pterostilbene HPSB e a uma concentração de 10 mg /kg. Durante a experiência, todos os ratinhos foram monitorizados para investigar se o tratamento e pterostilbene HPSB causou quaisquer efeitos adversos. Como mostrado na Tabela 2, os pesos corporais e órgãos de cada grupo não apresentaram quaisquer sintomas não saudáveis ​​ao longo do curso do estudo. Estes resultados sugerem que não há efeitos colaterais visíveis ou toxicidade foram causados ​​pela i.p

.

Injeção de pterostilbene e HPSB. Além disso, em ratinhos que receberam esses regimes de tratamento, não foram observados sinais de toxicidade durante brutas inspecções visíveis da aparência geral e exames microscópicos dos órgãos individuais (dados não mostrados). After15 dias, o volume tumoral em HPSB foi significativamente inibido em comparação com os ratinhos tratados com pterostilbene (fig. 6A e 6B). O peso do tumor foi fortemente inibida nos ratos tratados com HPSB (Fig. 6C). Como mostrado na Figura 6D, os níveis de proteína da COX-2, MMP-9, VEGF, ciclina D1, e pró-caspase-3 foram marcadamente diminuída em COLO 205 tumores de xenoenxerto de entre o grupo tratado com HPSB /kg 10 mg em comparação com o grupo pterostilbene. Nossos resultados sugerem que HPSB poderia servir como um novo agente promissor para fins quimioterápicos para câncer.

protocolo de tratamento experimental como descrito em Materiais e Métodos. Ratinhos portadores de COLO 205 xenoenxertos foram

i.p.

Injecção com pterostilbene ou 3′-hydroxypterostilbene por 15 dias onde o grupo controle foi recebido óleo de milho. (A) A fotografia de tumores de xenoenxerto desenvolvidos em cada grupo é apresentado no final de dia15. (B) Os volumes médios de tumor foram registados durante o tratamento e (C) os pesos médios dos tumores foram medidos no final da experiência. Seis amostras foram analisadas em cada grupo e os valores representam a média ± DP.

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P Art 0,05 e

**

P Art 0,01, em comparação com o grupo controle.

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P Art 0,05, em comparação com o grupo tratado com pterostilbene. (D) Total de proteínas de tumores de xenoenxerto em cada grupo foram extraídas para análise de Western blot. COX-2, MMP-9, VEGF, PCNA, ciclina D1 e expressão da proteína clivada da caspase-3 foram detectados usando anticorpos específicos. Resultados semelhantes foram obtidos em três experiências independentes.

Discussão

Neste estudo, pela primeira vez, nós comparamos com o efeito de crescimento de células cancerígenas inibitório do pterostilbene e HPSB (Figura 1) em células de cancro do cólon humano. Os resultados deste estudo mostraram que HPSB mais potente induzida apoptose e autofagia que pterostilbene em células COLO 205. Este estudo indica que a diferença na bioactividade de HPSB comparar com pterostilbene está relacionada com a presença e posição de grupos hidroxilo na estrutura química básica pterostilbene. células de cancro humano colorrectal COLO 205 foram submetidos a apoptose após o tratamento com HPSB, sugerindo que a apoptose é a principal causa para o efeito inibidor do crescimento de HPSB. Estes dados devem fornecer medicamentos químicos com informação nova para a concepção de agentes anti-tumorais, e também informação para apoiar mais estudos biológicos desses grupos funcionais modificados e não modificados no futuro. Como mostrado na Figura 2, HPSB é um forte inibidor da viabilidade das células e provoca a indução rápida e potente da apoptose em células COLO 205. De facto, o tratamento com HPSB provoca redução do potencial de membrana mitocondrial e indução de caspase-3 e caspage-9, que está associada com a degradação de DFF-45 e PARP, precedeu o início da apoptose. O papel das ROS na indução de apoptose é bem reconhecido. Curiosamente, um aumento dos níveis intracelulares de peróxido de hidrogénio em pterostilbene, enquanto diminuem marcadamente os níveis de peróxido de hidrogénio em células COLO 205-tratados HPSB (Fig. 2E). Especulamos que pterostilbene penetra na membrana celular no citosol e afeta mitocôndrias ciclismo dioxygen através do conjunto de transporte de elétrons. No entanto, HPSB poderia eliminar directamente ROS nas células e perturbar ainda mais o equilíbrio redox intracelular.

desenvolvimento do câncer, um processo dinâmico e de longo prazo, envolve muitos fatores complexos, com progressão gradual em última análise, levando a uma descontrolada propagação e crescimento de cancerosa as células do corpo chamado de metástase. Estudos epidemiológicos têm fornecido provas convincentes de que fatores dietéticos podem modificar esse processo [1]. A relação entre a apoptose e autofagia é complexo e varia entre tipos de células e diferentes tensões. Autofagia também é geneticamente programado, promotores de autofagia tem o potencial de benefício clínico no cenário da prevenção do câncer [24]. Como é necessária a autofagia para a gestão eficaz de estresse metabólico, promovendo a autofagia através da inibição via mTOR pode ser esperado para limitar a progressão do tumor [25]. compostos naturais dietéticos oferecem um grande potencial na luta contra o câncer humano inibindo o processo de carcinogênese através defensiva celular e máquinas apoptóticos [10]. evidências acumuladas indicam claramente que a indução de apoptose e autofagia como um mecanismo de prevenção do cancro por compostos naturais alimentares [24]. Nós demonstramos que os efeitos anti-câncer de HPSB são regulados por apoptose e autofagia, e foram identificadas as vias de sinalização que medeiam a autofagia induzida HPSB. Os nossos resultados mostraram que, após incubação com HPSB, as expressões LC3I /II foi notavelmente aumentada em células COLO 205 (Fig. 3D). A via PI3K /Akt e mTOR /p70S6K vias são as principais vias de sinalização que regulam negativamente autofagia [26]. mTOR activa a cinase a jusante p70S6 Thr Ser /que fosforila proteína ribossomal S6, necessária para a biossíntese do aparelho de translação da célula, um componente crítico do crescimento e proliferação de células [27].