Abstract

Fundo

O câncer de pulmão provoca cerca de 1,2 milhões de mortes por ano em todo o mundo, e cancro do pulmão de células não pequenas (NSCLC) representa 85% de todos os cânceres de pulmão. Compreender os eventos moleculares no câncer de pulmão de células não pequenas (NSCLC) é essencial para melhorar o diagnóstico precoce e tratamento para esta doença.

Metodologia e principais conclusões

Em uma tentativa para identificar romance NSCLC relacionada genes, foi realizada uma triagem do genoma do número de cópia cromossômica mudanças que afectam a expressão do gene usando baseados comparativas de hibridação e de expressão gênica matrizes microarrays genómicos em 32 amostras de tumores ressecados radicalmente de fase I e II pacientes com NSCLC. Uma ferramenta de análise integrativa foi aplicada para determinar se o número de cópias do gene cromossómico afecta expressão. Identificamos uma deleção em 14q32.2-33 como uma alteração comum em NSCLC (44%), o que influenciou significativamente a expressão do gene de HSP90, residente em 14q32. Esta deleção foi correlacionada com a melhor sobrevivência global (P = 0,008), sobrevivência também já foi em pacientes cujos tumores tinham níveis baixos de expressão de HSP90. Nós estendemos a análise para três conjuntos de validação independentes de pacientes com NSCLC, e confirmou a baixa expressão HSP90 estar relacionado com a sobrevivência global mais longa (P = 0,003, P = 0,07 e P = 0,04). Além disso, o tratamento in vitro com um inibidor HSP90 teve atividade antiproliferativa potente em linhas celulares de NSCLC.

Conclusões

Nós sugerimos que a segmentação HSP90 terá impacto clínico para pacientes com NSCLC.

citação: Gallegos Ruiz MI, Piso K, Roepman P, Rodriguez JA, Meijer GA, Mooi WJ, et al. (2008) Integração de Gene Dosagem e expressão gênica em não-pequenas células do cancro do pulmão, Identificação de HSP90 como potencial alvo. PLoS ONE 3 (3): e0001722. doi: 10.1371 /journal.pone.0001722

Editor do Academic: Christoph Plass, Universidade do Estado de Ohio, Estados Unidos da América

Recebido: 28 Dezembro, 2007; Aceito: 04 de fevereiro de 2008; Publicação: 05 de março de 2008

Direitos de autor: © 2008 Gallegos Ruiz et al. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Licença Creative Commons Attribution, que permite uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o autor original ea fonte sejam creditados

Financiamento:. Os autores não têm apoio ou financiamento para relatar

Conflito de interesses:. Paul Roepman é empregado por Agendia BV

Introdução

câncer

pulmão é a principal causa de mortes por câncer em todo o mundo [1] , e cancro do pulmão de células não pequenas (NSCLC) representa 85% dos cancros do pulmão. Uma melhor compreensão dos eventos moleculares subjacentes ao desenvolvimento e progressão da doença pode contribuir para melhorar a gestão clínica dos pacientes com NSCLC. Um certo número de genes, por exemplo, P53, RAS, P16 e do EGFR, têm sido mostrados para ser alterado em NSCLC [2]. Dada a natureza heterogênea e complexa deste tipo de tumor, é provável que muitos genes de condução NSCLC tumorigênese ainda têm de ser identificados.

As alterações cromossômicas são pensados ​​para ser eventos críticos na tumorigênese humana, e várias regiões genômicas frequentemente abrigam ganhos de DNA (3T, 5p, 7q, 8q, 11q e 16p) e perdas (3p, 4T, 5q, 6q, 8p 9p e 13q, 17q) foram identificados em pacientes com NSCLC [3]. Usando matriz baseada hibridação comparativa genómico (aCGH) e micromatrizes de expressão génica, do número de cópia de ADN e alterações de expressão de genes pode ser medida ao longo de todo o genoma de células de tumor. Ao combinar os dados a partir destas análises, é possível obter uma visão ampla do genoma integrada de aberrações de dosagem do gene e o seu efeito na expressão do gene, o que pode ajudar na identificação de genes importantes em NSCLC [4].

No presente estudo, realizamos uma análise integradora do número de cópia cromossômica e expressão gênica em amostras de tumores ressecados radicalmente de 32 pacientes com NSCLC. Dois novos algoritmos, ‘CGH chamada’ [5] e ‘ACE-lo “[6], foram aplicados para analisar os dados. Identificamos uma deleção na região cromossômica 14q32.2-33 em 44% dos pacientes com NSCLC. Esta eliminação foi relacionada com a melhoria da sobrevida do paciente, e foi associada com a diminuição da expressão de HSP90, uma chaperona molecular por várias oncoproteínas que está a ser explorados como um novo alvo na terapia anticâncer. baixa expressão HSP90 foi correlacionada com a sobrevivência melhorada nos 32 pacientes com NSCLC analisados ​​inicialmente. Uma análise mais aprofundada dos três conjuntos independentes de pacientes com NSCLC confirmou uma associação significativa entre a sobrevida do paciente e de expressão HSP90. Além disso,

In vitro

experiências mostram linhas celulares de NSCLC ser extremamente sensível ao inibidor de HSP90 17-AAG. Nossos dados sugerem um papel importante para a HSP90 em NSCLC.

Métodos

Pacientes e amostras

O conjunto de teste consistiu em amostras de tumores ressecados radicalmente de 32 pacientes estágio NSCLC início. Três pacientes tiveram um tempo de sobrevivência de menos de 30 dias e foram consideradas mortes pós-operatórias. Por conseguinte, estes três pacientes não estão incluídos nas análises de sobrevivência. Os doentes tinham uma média de acompanhamento de 86 meses (variação de 0,4-135,5). consentimento verbal informado foi obtido de todos os pacientes e manuseio das amostras estava em conformidade com os protocolos aprovados pelo conselho ético “subcommissie voor de ethiek van het mensgebonden onderzoek” a partir do Centro Médico da Universidade VU de Amsterdã.

A primeira conjunto de validação consistiu de 140 pacientes com NSCLC ressecados radicalmente do consórcio europeu câncer de pulmão. Os doentes tinham uma média de acompanhamento de 35 meses. Todos os pacientes incluídos tinham tido nenhuma doença maligna prévia, estágio patológico do tumor 1 ou 2 (T1-2), estágio nó 0 + 1 (N0-1), sem metástases à distância (M0) no momento da operação, e nenhuma doença residual após ressecção ( R0). Nenhum desses doentes receberam (neo) quimioterapia adjuvante ou radioterapia. A segunda validação consistiu de 111 pacientes com NSCLC fase de início de Bild et al. [7]. O terceiro conjunto de validação consistiu dos “conjuntos de dados 1 e 2” disponíveis publicamente de Lu et al. [8] e continha 54 pacientes estágio NSCLC início. Uma descrição completa das características dos pacientes de todos os quatro conjuntos de pacientes é apresentado na Tabela 1.

Isolamento de DNA e variedade genômica Hibridação Genômica Comparativa

Cryo-seções de amostras de tecidos congelados, flanqueando as secções utilizados para isolamento de ADN e ARN, foram verificadas pelo patologista estudo (WM) para conter pelo menos 50% de células tumorais. O DNA genômico foi extraído de cada amostra utilizando Trizol seguindo as instruções do fabricante (Life Technologies, Breda, Holanda). rotulagem DNA e hibridização de microarrays de oligonucleotídeos CGH 30K foi realizada como descrito por van den IJssel et al [9].

isolamento de RNA e expressão gênica micro matrizes

isolamento do RNA e rotulagem cDNA seguidos protocolos padrão . A hibridação foi realizada na plataforma Agilent de acordo com procedimentos padrão descritos pelo fabricante e em outros lugares [10].

A análise dos dados

Para arrayCGH, análise de mancha e de controlo de qualidade foram efectuadas utilizando a versão 3.2 BlueFuse ( BlueGenome, Cambridge, UK). Pontos de parada, ganhos, perdas e amplificações foram detectadas utilizando a chamada algoritmo de CGH. Este algoritmo converte log2ratios matérias para medidas absolutas de “perda”, “normal”, “ganho” ou “amplificação” pela aplicação de um algoritmo de segmentação combinado com um modelo de mistura probabilidade [11]. A fim de testar se a expressão do gene estatisticamente foi afectada pela dosagem de gene que aplicada uma ferramenta de integração expressão de arrayCGH, ACE-lo [6], em que a matriz denominada CGH e rácios log10 normalizados para matrizes de expressão foram usados ​​como dados de entrada. ACE-lo usa os Wilcoxon Rank Sum estatísticas de um lado para testar qual aberrações cromossômicas numéricas cópia afetar recorrentemente expressão do RNA. p-valores calculados são ajustados para testes múltiplos utilizando o método Benjamini Hochberg [12]. ACE-lo testa apenas os genes que satisfazem os critérios de contaminação e de equilíbrio, os quais são controlados através de um limiar para o número de amostras. Aqui, o limiar foi estabelecido em uma configuração padrão fixo de amostras 9, o que significa que apenas as posições cromossómicas foram tidos em conta que tinham, pelo menos, 9 amostras em um CGH estado chamada e não mais do que 9 na outra situação. A matriz inteira CGH conjunto de dados da série de teste (n = 32) estão disponíveis no banco de dados do GEO (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/projects/geo, número de acesso GSE7878). Os dados de expressão de genes de ambos o conjunto de teste (n = 32) e definir uma validação (n = 140) para os 359 genes identificados por ACE-la está disponível no banco de dados de matriz Express (www.ebi.ac.uk/aerep/login, projeto número de acesso de matriz: A-MEXP-749, os dados de Experiência:. E-TABM-270)

Os dados de validação de expressão gênica set 2 foi obtido o uso de chips Affymetrix Hu133plus2 (número de acesso GEO GSE3141). O valor médio das intensidades de sinal MAS5 calculados de quatro sondas de detecção HSP90AA1 foi usada em nossos cálculos.

O terceiro conjunto de validação contidos dados de expressão gênica de Affymetrix Hu95 e batatas fritas Hu133 (número de acesso GEO GSE6253). O chip Hu95 continha um conjunto de sondas de detecção HSP90AA1 eo chip Hu133 continha quatro sondas, sendo que o valor médio das intensidades de sinal RMA calculado foi utilizado em nossos cálculos.

Estatísticas

Uma regressão de Cox univariada a análise foi realizada para investigar a relação entre os valores de expressão de genes com o tempo de sobrevivência. As curvas de sobrevida foram construídas pelo método e as diferenças Kaplan Meier em geral foram avaliados através do teste log-rank. No conjunto de teste, três pacientes com menos de 30 dias o tempo de sobrevida foram excluídos da análise de sobrevivência, como a sua morte foi considerada a mortalidade cirúrgica. Para determinar os efeitos independentes de expressão HSP90, subtipo histológico, estágio do tumor, idade e sexo, foi realizada uma análise de regressão de Cox multivariada. Um valor de p inferior a 0,05 foi considerado estatisticamente significativo.

Multiplex Ligation dependente Probe Amplification (MLPA)

Para Multiplex Ligation dependente Probe Amplification (MLPA), o P070 conjunto de sonda subtelomere (MRC Holland, Amsterdam, Holanda foi utilizada a) contendo uma sonda localizada dentro da banda 14q32.33 (região 104874216-105070384). MLPA foi realizada de acordo com as instruções do fabricante, utilizando ADN de 100 ng como entrada. O ADN isolado a partir de sangue de um grupo de dadores saudáveis ​​foi usado como amostra de referência. sinais da sonda foram normalizados dividindo a área do pico do cromossoma 14q pela área do pico de 14P cromossoma. MLPA gerado 14q /14p rácios são representados graficamente contra as log2ratios normalizados médios dos oligos na área 104787271-105071522 a partir da matriz (total de 11 oligos). Esta região abrange a região da sonda MLPA.

RT-PCR quantitativo

A fim de validar os valores de expressão obtidos através de matrizes de expressão do gene, foi realizada em tempo real quantitativo usando a tecnologia de PCR e Taqman® o instrumento Sequence Detection System ABI Prism 7500 equipado com a versão de software 1.3.0 SDS (Applied Biosystems, Foster City, CA, EUA). Iniciadores directos e inversos e sondas foram concebidos e produzidos pela Applied Biosystems para HSP90AA1 (Hs00743767_sH), e para a GUSB gene controle endógeno (Hs00939626_mi). A PCR foi realizada num volume de reacção de 25 uL que continha 50 ng de ADNc, 1 × TaqMan Universal PCR Master Mix, e os conjuntos de iniciadores e a sonda para HSP90AA1 e GUSB. Cada amostra foi analisada em duplicado, e os valores de ciclo médio de limiar (Ct) de cada amostra para GUSB, foram subtraídos dos valores Ct médios para HSP90AA1. valores ΔCt gerado pelo Taqman foram log transformados em valores de expressão e plotados contra os Δlog2ratios entre GUSB e HSP90AA1 da matriz expressão.

estudos de inibição do crescimento celular

A inibição do crescimento seguinte

in vitro

exposição ao Hsp90 inibidor clinicamente utilizado 17-AAG (Invivogen, San Diego, CA) foi examinada em linhas celulares de tipo selvagem NSCLC 4 EGFR (H460, H157, H441 e A549, obtidas a partir de Drs. P. F. Dennis e Kaye , NCI, Bethesda, MD). Resumidamente, 10

5 as células foram semeadas em placas de 6 poços de cultura de tecidos (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO), deixou-se aderir, e em seguida, continuamente expostas a várias concentrações de 17-AAG (0, 10, 30 , 100, 300, 1000 nM) durante 24, 48 ou 72 horas. Em cada ponto de tempo, as células foram destacadas dos poços, incubaram-se com azul de tripano e o número de células viáveis ​​(exclusão de azul de tripano-) foi determinada em triplicado utilizando um hemacitómetro. O número médio de células com barras de erro padrão é apresentado em cada ponto de tempo. Além disso, o

50 IC (concentração de fármaco à qual a inibição do crescimento de 50% é obtida) de 17-AAG a 72 horas foi determinada para cada linha celular.

Resultados

dosagem de gene alterações de expressão de genes relacionados com NSCLC em

as alterações cromossômicas eram abundantes nos 32 pacientes com NSCLC analisados. A fim de identificar pontos de interrupção de ganhos e perdas, aplicamos o algoritmo CGH chamada [11]. Na Tabela 2, as regiões cromossômicas em que os ganhos ou perdas estavam presentes em pelo menos 20% dos pacientes são listados. O ACE-lo ferramenta estatística [6] foi usada para determinar se o número de cópias do gene afectado a expressão do gene. Um total de 359 transcrições acabou por ser significativamente afectados pelo número de cópias. Na Figura 1, as áreas de genes afetados são indicados para 32 pacientes com NSCLC, mostrado em verde (ganhou regiões) ou vermelha (regiões perdidos).

plot Resumo para chamadas de ganhos e perdas em 32 pacientes com NSCLC ressecados com cópia de DNA mudanças de números indicados em cinza. Os valores positivos indicam a percentagem de amostras encontrada com um ganho. Os valores negativos indicam a percentagem de amostras ancorando uma perda cromossoma no local especificado. Genes em regiões determinadas afetadas pela cópia ganho número são indicados em verde e genes afetados pela perda do número de cópias são indicados em vermelho. A selecção de genes afectados está indicado. A lista completa de 359 transcrições afetadas podem ser encontrados na tabela S1 suplementar.

Uma análise de sobrevivência de regressão de Cox univariada foi realizada para a expressão de todos os 359 genes que foram identificados a ser influenciado por número de cópias (ver tabela S1 suplementar). Após a correção testes múltiplos (usando o método Benjamini Hochberg) nenhum dos 359 genes permaneceu significativa para a sobrevivência neste pequeno conjunto paciente (n = 32). O topo da lista de genes correlacionados com a sobrevivência (classificado em p-valores brutos) contidas principalmente genes localizados nos cromossomos 3 e 5 regiões ganharam. Observou-se também um gene na lista de topo-20, HSP90AA1, localizado no cromossoma 14. O gene HSP90AA1 (geralmente referido como HSP90), localizado em 14q32.2, era o único gene nesta região com expressão significativamente reduzida em pacientes afectados por perda desta região (P = 0,05). Estas observações levaram-nos a investigar neste locus com mais detalhes.

aberrações cromossômicas em 14q e gene HSP90AA1 correlação expressão com a sobrevivência

Nós investigamos a correlação da deleção apertado recorrente na região 14q32.2- 33, com a sobrevivência. Curiosamente, os doentes em quem esta região foi suprimido teve uma melhoria na sobrevivência global (OS) em comparação com pacientes que albergam um gene normal de dosagem neste locus (5 anos OS 69% versus 41%, P = 0,004, Figura 2A).

curvas (a) de Kaplan-Meier para a sobrevida global são mostradas para 29 pacientes em relação à dosagem do gene na região cromossomo 14q32.33. (B) A sobrevida global de 29 pacientes em relação à expressão HSP90. Baixa expressão foi definida como a menor expressão do que a mediana do total das 32 amostras, a expressão “normal” foi definido como maior do que a mediana de 32 amostras. Três dos 32 pacientes incluídos na análise de dosagem e expressão de genes foram excluídos da análise de sobrevivência devido a um tempo de sobrevivência de menos do que 30 dias.

A fim de investigar a expressão de HSP90 em relação com a sobrevivência, dividimos os 32 pacientes em dois grupos com base em seu status de sobrevivência de dois anos após a ressecção do tumor. Cerca de metade dos pacientes foram classificados como “alto risco” e metade como “baixo risco”. Para identificar se ambos os grupos de risco puderam ser discriminados usando expressão gênica de HSP90, construímos estimativas de sobrevivência de Kaplan-Meier para dois igualmente grandes grupos com “baixo” e “normal”, com base na expressão HSP90 mediana. Baixa expressão de HSP90 foi associada com uma melhor sobrevivência global (OS 5 anos de 70% versus 40%, P = 0,13 Figura 2B), embora as diferenças entre os dois grupos eram inicialmente não significativo devido, provavelmente, a uma combinação de uma baixa magnitude da diferença e um baixo número de pacientes analisados.

validação técnica de 14q supressão e expressão HSP90

Para validar a supressão observada na região 14q32.2-33 realizamos MLPA [13] (MLPA) a análise utilizando um conjunto de sondas subtelomere contendo uma sonda na região 14q32.33. O coeficiente de correlação (R ​​

2) entre a perda desta área detectada pela matriz CGH e por MLPA foi 0,439.

Para validar os dados de expressão de HSP90 obtidos com microarrays que realizamos RT PCR usando o Taqman® tecnologia. Observou-se uma boa correlação entre a expressão de HSP90 medida com as duas técnicas diferentes (R

2 = 0,6431).

Validação de expressão HSP90 e sua relação com a sobrevivência no independente série de pacientes

para investigar mais a associação entre baixa expressão HSP90 e NSCLC prognóstico do paciente, foram utilizados três conjuntos de validação independentes de pacientes com NSCLC. Em todos os três conjuntos de pacientes, o “baixo risco” /”de alto risco” distribuição dos pacientes em toda a grupos de pacientes foi de aproximadamente dois terços versus um terço. Por isso, foi utilizada a 33 percentil de expressão HSP90 como corte para a separação de pacientes com (ou seja, de alto risco) “normal” e a expressão “baixo” (ou seja, de baixo risco). Para todos os três conjuntos de validação, baixa expressão de HSP90 foi correlacionada com sobrevida global melhorada. Esta correlação foi significativa para os primeiro e terceiro conjuntos de validação (P = 0,003 e P = 0,04), e no limite de significância para o segundo conjunto (P = 0,07) (Figura 3). A análise multivariada revelou que HSP90 valor prognóstico era independente do palco, subtipo histológico, idade e sexo dos pacientes (Tabela 3).

A sobrevida global para (A) 140 pacientes com NSCLC, validação set 1 (B) 111 pacientes com NSCLC, validação definido 2 e (C) 54 pacientes com NSCLC, validação definido 3. o corte para distinção entre baixa expressão e “normal” foi baseado no de 33 percentual de valores de expressão.

Validação de Hsp90 como um alvo molecular viável num painel de linhas celulares de NSCLC

Hsp90 é uma chaperona molecular que estabiliza várias oncoproteínas, incluindo o EGFR, e constitui um novo alvo potencial para a terapia anti-cancro. Os dados acima descritos demonstraram que o nível de expressão de Hsp90 é um indicador de prognóstico de sobrevivência a longo prazo de uma grande série de doentes com NSCLC, e sugerem que os inibidores de Hsp90 podem ter uma utilidade mais ampla nesta doença do que anteriormente reconhecido. Para examinar esta possibilidade, testamos se a inibição farmacológica da função Hsp90 teria impacto na

in vitro o crescimento de células

de um painel de linhas celulares de NSCLC. O crescimento destas linhas de células, tendo todos os EGFR de tipo selvagem, foi profundamente inibida, em uma dose e modo dependente do tempo, por concentrações sub-micromolares de 17-AAG, um inibidor de Hsp90 [14], actualmente em ensaios clínicos de fase II (Figura 4). Às 72 horas, o IC50 era inferior a 50 nM de 17-AAG em todos os casos, e concentrações de droga mais elevadas consistentemente resultou em citotoxicidade marcada.

(A-D) tempo e a inibição dependente da dose do crescimento in vitro de H460, H157, H441 e A549 linhas de células NSCLC após a exposição a 17-AAG. As células foram semeadas a 105 /cavidade, e o número de células viáveis ​​foi determinado nos dias subsequentes como descrito nos Métodos. 17-AAG em concentrações (H441) ou superior (A549, H460 H157) 30 nM uniformemente resultou na perda dependente do tempo da viabilidade celular. O valor de IC50 de 17-AAG (exposição contínua durante 72 horas) para cada linha de células é a seguinte:. = 30 nM H460, H157 = 15 nM, H441 = 8 nM e 20 nM A549 =

Discussão

com base em dados array CGH em NSCLC, demonstrou-se a existência de múltiplas vias de carcinogênese moleculares que são mais relacionados aos hábitos de sexo e tabagismo [15]. Além disso, foi demonstrado que existe uma grande sobreposição entre as aberrações observadas no adenocarcinoma e carcinoma de células escamosas subtipo, excepto para ganhos 3q que parecem ser mais específico para o subtipo de carcinoma de células escamosas [16]. Vários assinaturas de expressão de genes têm sido correlacionado com a sobrevivência de doentes com NSCLC [17] – [19]. Além disso, os estudos moleculares têm permitido o desenvolvimento de abordagens de tratamento personalizado em vários tipos de tumores [20] – [22]. No entanto, é provável que muitos genes alvo relacionados com o cancro não foram ainda identificados. A este respeito, o genoma grande rastreio integrado de alterações no número de cópias e a expressão de genes utilizando microarrays tem sido recentemente realizado em vários tipos de tumores para identificar genes cuja expressão é afectada pela dosagem de gene [4], [23] – [26]. Estes estudos visam identificar novos genes relacionados com o cancro e para definir novos biomarcadores para resposta ou assinaturas prognósticos. Em ambos NSCLC e câncer pancreático ductal, duas amplificações focais de 8p12 e 20q11 foram estudados em detalhe levando a dois genes candidatos (WHSC1L1 e TPX2) importantes nestas doenças [16]

Nós aqui realizado um genoma integrada ampla rastreio de alterações no número de cópias do gene e a expressão do gene em 32 ressecado radicalmente pacientes com NSCLC, a fim de identificar novos genes relacionados com NSCLC. Ao usar ACE-lo, uma ferramenta informática romance para a integração da dosagem do gene e dados de expressão gênica, identificamos 359 transcritos a ser significativamente afectado pelo número de cópias. A análise de sobrevivência cox em todos os 359 genes não revelaram qualquer relação significativa após o teste múltiplo. O topo da lista de genes relacionados com a sobrevivência incluiu essencialmente genes que residem no 3T regiões adquirida e 5p. Estas regiões abrangem muitos genes e para identificar o gene de maior importância é uma tarefa desafiadora. Novas investigações devem elucidar a importância destes genes em relação aos NSCLC, em particular dos que estão no topo da lista de correlação com a sobrevivência, como SLC45A2, WDR70 e NIPBL (ver tabela S1 suplementar). Neste trabalho, focado na eliminação recorrente no cromossomo 14 e a HSP90 gene, que também estava no topo da lista de relação com a sobrevivência e não previamente investigados em detalhe. A deleção da região 14q32.2-33 foi correlacionada com a sobrevivência melhorada, sugerindo ainda que ele pode conter um ou mais genes relacionados com a progressão NSCLC. A supressão desta região foi anteriormente descrito por um grupo de relatório aberrações genómicos em NSCLC, mas não foi investigada em maior detalhe [27]. Fora do mapeamento de 109 genes para a região 14q32.2-33, HSP90 era o único gene com expressão significativamente mais baixa em pacientes portadores da deleção 14q32.2-33. Na série inicial de 29 pacientes (3 pacientes excluídos da análise de sobrevivência), observou-se melhora da sobrevida em pacientes com baixos níveis de HSP90. A associação entre os níveis de expressão de HSP90 e NSCLC prognóstico do paciente foi confirmado para ser significativa em três conjuntos de validação independentes de pacientes com NSCLC. A análise multivariada incluindo estágio, histologia, idade e sexo mostraram que HSP90 permaneceu independentemente relacionado à sobrevivência.

Uma questão crítica na definição de “baixo” e “normal” expressão é a escolha de um adequado cortado valor. Nas análises iniciais foi utilizada a média dos rácios de expressão como cortar entre “baixo” e “normal” de expressão, uma vez que o baixo risco e separação de alto risco dos pacientes foi igual. No entanto, na validação define a baixo risco e grupos de sobrevivência de alto risco não foram igualmente equilibrado (dois terços contra um terço). Por conseguinte, os valores de corte utilizados nestes conjuntos de dados não era o valor mediano, mas a 33-percentil.

Neste estudo, usando um genoma ampla análise integradora do número de cópias do gene e expressão, fomos capazes de identificar expressão de HSP90 como um gene importante em doentes com NSCLC fase inicial. A HSP90 é uma proteína de chaperona envolvidos na estabilização de várias oncoproteínas, tais como EGFR, Her-2 e AKT [28]. Um trabalho recente demonstrou que a HSP90 desempenha um papel na manutenção da conformação activa de EGFR e em particular os mutantes de EGFR [29], [30]. Mostramos aqui que várias linhas celulares de NSCLC rolamento EGFR de tipo selvagem são sensíveis à inibição da HSP90, o que indica que o efeito inibidor de 17-AAG não pode ser unicamente atribuída ao EGFR mutante. A HSP90 foi recentemente reconhecido como um alvo terapêutico potencial do cancro e investigações de inibidores de HSP90 estão em curso [31], [32]. A este respeito, as células de glioblastoma que sobre-expressam o EGFR, mas resistente à inibição por inibidores de EGFR-quinase, eram sensíveis à inibição de HSP90 [33]. Portanto, enquanto que a Hsp90 pode ser necessária para estabilizar o EGFR sobre-expresso ou mutada, os nossos dados suportam um papel mais vasto e complexo para a Hsp90 na mediação do crescimento e sobrevivência NSCLC. A sensibilidade nanomolar baixa observada nas linhas celulares testadas 4 nas nossas experiências, está de acordo com outros relatórios publicados de linhas de células de tumor altamente 17-AAG sensíveis [34] – [36]. Estas concentrações são facilmente alcançáveis ​​em pacientes por períodos de tempo prolongados usando programação atual e regimes de dosagem [37].

Em resumo, a observação de que nível de expressão HSP90 é um fator prognóstico para a sobrevida do paciente NSCLC (independente do estado mutacional EGFR ), juntamente com a extrema sensibilidade das células NSCLC tipo selvagem de EGFR para a Hsp90 inibidor de 17-AAG, sugere que os inibidores de Hsp90 pode ter maior utilidade clínica em NSCLC do que foi anteriormente considerado e garante uma investigação mais aprofundada da dependência de outras proto-oncogenes em esta proteína chaperona em NSCLC.

Informações de Apoio

Tabela S1.

doi: 10.1371 /journal.pone.0001722.s001

(0,03 MB PDF)

Reconhecimentos

Agradecemos ao consórcio europeu câncer de pulmão para fornecer dados da expressão gênica por microarrays 140 pacientes com NSCLC independentes; Netherlands Cancer Institute: Sjaak Burgers, Tony van de Velde; Universidade Médica de Gdansk: Jacek Jassem, Amelia Szymanowska, Marcin Skrzypski, Barbara Szostakiewicz, Witold Rzyman; Medical University of Bialystok: Jerzy Laudanski, Miroslaw Kozlowski, Lech Chyczewski; Thoraxklinik Heidelberg: Michael Meister, Philipp A. Schnabel, Henrik Dienemann e Hans Hoffman. Também damos nossos agradecimentos especiais para Sjoerd Vosse (Departamento de Patologia da VU University Medical Center, Amsterdão, Países Baixos) para as discussões de bioinformática votos e Hans Gille (Departamento de Genética Clínica, VU University Medical Center, Amsterdão, Países Baixos) para a realização de análise MLPA.