Abstract

Mudança na expressão do gene associado ao câncer pancreático pode ser atribuída à variação modificações pós-translacionais das histonas que levam a remodelação posterior do modelo da cromatina durante a transcrição. No entanto, a rede interligada de moléculas envolvidas na regulação de tais processos permanece elusiva. hPaf1 /PD2, uma subunidade do PAF-complexo humana, envolvida na regulação do alongamento da transcrição tem potencial oncogénico. Nosso estudo explora a possibilidade de que a regulação da metilação da histona por hPaf1 pode contribuir para a alteração na expressão gênica por rearranjo nucleosomal. Aqui, mostramos que knockdown de hPaf1 /PD2 leva à diminuição da di- e tri-metilação na histona H3 lisina 4 resíduos em células de cancro do pâncreas. Curiosamente, hPaf1 /PD2 colocaliza com MLL1 (Lineage Leucemia Mixed 1), uma metiltransferase histona que metila resíduos H3K4. Além disso, uma redução no nível hPaf1 resultou em expressão MLL1 reduzida e uma diminuição correspondente no nível de CHD1, uma enzima de remodelação da cromatina dependente da ATPase que se liga especificamente a H3K4 di e trimetil marcas (proteína 1 de ligação a ADN Chromohelicase). hPaf1 /PD2 também foi encontrada para interagir com e colocalize CHD1 em ambos os extractos nucleares e citoplasmáticos de células de cancro do pâncreas. Além disso, redução do nível de CHD1 localização no núcleo das células hPaf1 /PD2 Knockdown poderia ser resgatado pela expressão ectópica de hPaf1 /PD2. digestão de nuclease microcócica mostrou uma estrutura da cromatina em células alterada hPaf1 /PD2-KD. No geral, nossos resultados sugerem que hPaf1 /PD2 em associação com MLL1 regula a metilação de resíduos H3K4, bem como interage e regula vaivém nuclear de proteína cromatina remodelação CHD1, facilitando a sua função em células de câncer de pâncreas

Citation:. Dey P, Ponnusamy MP, Deb S, Batra SK (2011) Human RNA polimerase II-Associação Fator 1 (hPaf1 /PD2) Regulamenta histona metilação e cromatina remodelação no cancro do pâncreas. PLoS ONE 6 (10): e26926. doi: 10.1371 /journal.pone.0026926

editor: Maria Bryk, Texas A M University, Estados Unidos da América

Recebido: 04 de setembro de 2011; Aceito: 05 de outubro de 2011; Publicado: 27 Outubro 2011 |

Direitos de autor: © 2011 Dey et al. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Licença Creative Commons Attribution, que permite uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o autor original ea fonte sejam creditados

Financiamento:. Os autores neste trabalho são apoiados por bolsas de Institutos Nacionais de Saúde (CA78590, CA111294, CA127297, CA133774 e CA131944) e do Departamento de Defesa (BC073541). Os financiadores não tiveram nenhum papel no desenho do estudo, coleta de dados e análise, decisão de publicar ou preparação do manuscrito

CONFLITO DE INTERESSES:.. Os autores declararam que não existem interesses conflitantes

Introdução

modificações pós-tradução de proteínas histona básicos, tais como fosforilação, metilação, acetilação, ubiquitinação ou sumoilação, desempenham um papel importante na regulação da expressão do gene. Uma maneira pela qual função essas modificações das histonas é de recrutamento de proteínas efetoras a jusante que realizam funções independentes específicas no modelo da cromatina. Estes incluem a cromatina remodelação proteínas que “ler” as marcas de histonas modificadas e uso de energia ATP para alterar a posição dos nucleossomos no DNA. Como resultado, o modelo da cromatina é bloqueados ou postos à disposição do mecanismo de transcrição, portanto, que regula a expressão de genes a jusante. metilação de histonas, especificamente a histona H3 lisina 4 resíduo mono, di e trimethylation, é geralmente associada com 5 ‘regiões de genes transcritos ativamente [1]. No entanto, um estudo recente mostra que, em regiões de danos no DNA, proteínas ING recrutar complexos de HDAC para silenciar a transcrição de genes de proliferação celular, através do reconhecimento de resíduos H3K4 trimetilada pelos seus domínios PHD [2]. Este é o primeiro relatório ligando K4 trimethylation a genes reprimidos activamente bem.

Nos mamíferos, a metilação no resíduo H3K4 é realizada por metiltransferase histona MLL1, um domínio conjunto contendo proteína que permanece em um complexo com outras proteínas de subunidade WDR5, RbBP5 ASH2 e [3]. O homólogo de levedura da MLL1, Conjunto1, é uma parte de um complexo macromolecular chamado COMPASSO (complexo de proteínas associado com Conjunto1) que interage com o complexo de PAF de levedura para a metilação das histonas [4]. Postulou-se que alguns genes conservados, a partir de Drosophila para os seres humanos, esta marca suportar exclusivamente a metilação e a expressão destes genes é regulada por factores de pol II alongamento gerais [1]. As marcas de metilação H3K4 histonas pode ser ainda reconhecido por proteínas específicas, o que resulta no recrutamento e subsequente enzimática ou actividade fisiológica no local de recrutamento. CHD1 (Chromodomain DNA helicase da proteína de ligação 1) é uma proteína pertencente à família de ATPase dependente de factores de cromatina remodelação que especificamente associar com H3K4 dimetilada e trimetilada [5], [6]. O CHD1 humana se liga ao resíduo histona H3K4 metilado tanto através de seus chromodomains em tandem, enquanto o fermento CHD1 falha para vincular resíduos H3K4 metilados [7].

desenvolvimento e progressão do câncer é atribuída a expressão genética desregulada, que pode muitas vezes correlacionar a qualquer activação epigenética defeituoso ou silenciamento de genes [8]. padrões de modificação da histona alterados causar mistargeting da cromatina enzimas de remodelação que podem levar à expressão do gene descontrolada e, portanto, causam as células normais para ser transformado em células cancerosas. O câncer de pâncreas é a quarta principal causa de câncer com uma taxa de sobrevivência de prognóstico e cinco anos muito pobre de menos de 5%. Como outras formas de malignidade, cancro pancreático também está correlacionado com alterações epigenética como a metilação do DNA e histonas modificações, que conduz a uma expressão genética alterada, [9].

PD2 é o homólogo humano da polimerase de ARN de levedura II- fator associado 1 (yPaf1) que constitui o núcleo da subunidade do complexo do factor associado humano ARN polimerase II (hPAF). Semelhante ao seu homólogo de levedura, o complexo hPAF é composta de quatro subunidades de outros, ou seja, hLeo1, hCtr9, hSki8 e parafibromina [10] – [12]. As funções principais do complexo hPAF envolve o alongamento da transcrição, processamento de ARNm e maturação, semelhante à do complexo de PAF levedura [12]. modificação e remodelação da cromatina também são algumas das características dos factores de transcrição. Evidentemente, uma série de modificações de histonas têm sido associados ao complexo de transcrição e alongamento PAF bem como [4], [13]. Tanto a levedura e o complexo de PAF humano são considerados necessários para ubiquitinação Rad6 /Bre1-dependente da histona H2B [14]. O monoubiquitylation de H2B por hPAF remove a barreira nucleosomal, que é um pré-requisito para o alongamento eficiente a transcrição na cromatina por RNA Pol II [14]. A presença de H2B ubiquitylated desencadeia ainda H3K4 di e tri-metilação. Em leveduras, a função Paf1C na formação H3K4-Me3 é conferida pela subunidade rtf1 por recrutamento do complexo CONJUNTO1 histona metiltransferase [15], a qual é homóloga ao complexo MLL humano [16]. Levedura estudos também mostram que o complexo Paf1 é necessário para o recrutamento do complexo metiltransferase bússola para RNA polimerase II através da interacção da subunidade. Em células humanas, hCdc73 parece ser necessário para níveis cheio de H3K36-Me3 [17], mas não H3K4-Me3, ao passo que em levedura Cdc73 é necessário para ambas as modificações [18]. Por conseguinte, o papel do complexo de PAF em alongamento da transcrição tem sido estreitamente correlacionada com modificações de histonas.

Para além do seu papel na regulação da transcrição, as subunidades de complexos de PAF humanos têm também sido associados a um fenótipo maligno. Parafibromina (hCdc73) é encontrado para ser mutado em tumores da paratireóide e amplificado em carcinoma de fígado e mama. Leo1, presente no 15q21 lócus, é amplificado em câncer colorretal e histiocitoma fibroso maligno do osso, enquanto o

Ctr9

locus do gene é encontrado para ser apagado no câncer de pâncreas. A subunidade hPaf1 do complexo de PAF humano, também conhecido como PD2, é amplificado e sobre-expresso em cancro do pâncreas e o seu possível papel na tumorigénese é indicada pela indução de um fenótipo transformado em sobreexpressão [19]. Neste estudo, identificamos um papel de hPaf1 /PD2 na regulação da metilação das histonas no resíduo H3K4 em células de cancro do pâncreas por interacção com histona metiltransferase MLL1. Verificou-se também para regular a expressão do factor de cromatina remodelação, CHD1 que se liga especificamente a e di trimetilada H3K4 e facilitar a sua importação nuclear, provavelmente através de interacções directas. Além disso, ensaios de digestão de nuclease Micrococo mostram que knockdown de PD2 leva ao posicionamento nucleosomal alterada em células de câncer de pâncreas.

Materiais e Métodos

cultura celular

Humanos linhas celulares de cancro do pâncreas Panc1 e MiaPaCa foram obtidas a partir de ATCC. As células foram cultivadas em meio DMEM (Sigma) suplementado com 10% de soro fetal bovino (Sigma) e 1% de penicilina-streptamycin solução (Sigma). O meio de cultura foi mudado a cada 2 dias e as células foram subcultivadas por tratamento com tripsina-EDTA.

Isolamento de ARN e qRT-PCR

O ARN celular total foi extraído a partir de células Panc1 utilizando o kit RNAeasy (Qiagen) e processados ​​para a transcrição inversa. O passo inicial de activação por PCR foi a 94 ° C durante quatro minutos, seguido pelo passo de desnaturação a 94 ° C durante um minuto, passo iniciador-hibridação a 58 ° C durante 30 segundos, o passo de extensão a 72 ° C durante um minuto, e o passo de extensão final a 72 ° C durante dez minutos. produtos de reacção de PCR foram em seguida separados por electroforese usando um gel de agarose a 2%. Os géis foram corados com 0,5 ug /ml de brometo de etídio, iluminado com luz UV. ARN celular total foi transcrito reverso e ensaiada por quantitativa PCR em tempo real utilizando SYBR Verde incorporação. A expressão de todos os genes foi normalizada para a do controlo interno β-actina e expressa em relação à amostra de referência indicados (média ± D.P. de reacções em triplicado). As expressões de genes da linhagem específica foram comparados entre as células PD2 knockdown Panc1 mexidos e por teste t de Student de duas caudas. Um valor de p 0,05 foi considerado estatisticamente significativo

RNA Interferência

A região de Paf1 /PD2 foi alvo de siRNA específico (sequência 5′- AACAGGUUCGUCCAGUACAAA-3) ‘.. senso sintético e oligonucleótidos anti-sentido (Dharmacon, Lafayette, CO) foram emparelhados em acetato de potássio 100 mM, 30 mM de HEPES-KOH (pH 7,4), e acetato de magnésio 2 mM durante um minuto a 90 ° C e uma hora a 37 ° C, e congelados. Oligonucleotídeos foram transfectados em células com

Trans

IT-TKO (Mirus, Madison, WI) de acordo com as recomendações do fornecedor.

Immunoblot Assay

linhas celulares

Panc1 e MiaPaCa foram processados ​​para a extracção de proteína e Western blotting utilizando procedimentos padrão. Resumidamente, as células foram lavadas duas vezes em PBS e lisadas em tampão RIPA (Tris 100 mM, EDTA 5 mM, 5% de NP40, pH 8.0) inibidores de protease contendo (1 mM de f enil-metil fluoreto de sulfonilo, 1 ug /mL de aprotinina, 1 ug /mL de leupeptina) e mantido a 4 ° C e os sobrenadantes foram recolhidos. Vinte ug de proteína de lisados ​​foi resolvido em 10% SDS-PAGE. proteínas resolvidas foram transferidas para a membrana de PVDF. Após a lavagem rápida em PBST (fosfato tamponado salino e 0,1% de Tween 20), as membranas foram bloqueadas em 5% de leite em pó magro em PBS durante pelo menos 2 horas e, em seguida, incubadas com anticorpos primários (anti-Paf1 /PD2, anti-Leo1, anti-CDC, anti-Ski8, anti- OCT3 /4, anti-SOX2, anti-β-actina) (diluído em BSA a 3% em PBS) durante a noite a 4 ° C. A membrana foi então lavada (3 x 10 min) em PBST à temperatura ambiente e sondadas com anticorpos anti-ratinho ou anti-coelho conjugados com peroxidase de rábano diluído 1:2000 secundárias durante 1 h à temperatura ambiente e lavou-se 5 x 10 min com PBST . O sinal foi detectado com um kit de quimioluminescência ECL (Amersham Bioscience, Reino Unido). Todas as transferências de Western foram quantificadas utilizando o software ChemiImager 4400. Os gráficos gerados bares show de erro representam os desvios-padrão, calculado a partir de três repetições experimentais independentes. A diferença em cada nível de proteína entre t-teste mexidos e células knockdown PD2 são analisados ​​pelos alunos com um valor de p inferior a 0,05 sendo considerado estatisticamente significativo.

Microscopia Confocal

As células foram plaqueadas sobre tiras estreitas redondas esterilizadas de cobertura (CIR 18-1 Fisher marca 12-545-10) e cultivadas em placas de 12 poços durante 24 h. As células foram fixadas em metanol frio gelo (pré-arrefecido a -20 ° C) e permeabilizadas com 0,1% de Triton X-100 em PBS. Em seguida, as células foram lavadas em PBS e bloqueadas com soro de cabra a 10% durante 30 minutos. Após o bloqueio, incubou-se com primários (monoclonal de ratinho PD2, CHD1 policlonal de coelho) anticorpos durante uma hora e com a etiqueta fluorescente anticorpos secundários (FITC de cabra anti-ratinho, de cabra anti-coelho Texas-Red) durante 30 minutos à temperatura ambiente. Os anticorpos foram diluídos em soro de cabra a 5%. Finalmente, a seguir à incubação do anticorpo secundário, as células foram lavadas com TBST por três vezes e lamelas foram montadas com Vectashield contendo DAPI (VECTOR).

Isolamento de citoplasmática e nuclear extracto

O protocolo para citoplasmático e preparação de extracto nuclear foi adaptado de procedimentos previamente publicados. As células foram lavadas duas vezes em PBS gelado e incubadas em gelo durante 30 minutos em tampão de extracção citoplásmico hipotónico (10 mM de Hepes, pH 7,4, KCl 10 mM, 0,2% de NP-40, EDTA 0,1 mM, glicerol a 10%, MgCl 1,5 mM

2, DTT 1 mM, PMSF 1 mM, 5 mM de Na

3VO

4, NaF 5 mM), suplementado com um cocktail inibidor de protease completo [Roche]. ruptura celular foi realizada por várias passagens através de uma agulha 25G. Os núcleos foram recolhidas por centrifugação a 16.000 g e o sobrenadante centrifugado adicionalmente a 16.000 g para se obter o extracto citoplasmático final. pastilhas nucleares foram lavadas duas vezes com PBS gelado seguido por incubação em tampão de extracção nuclear hipertónico (Hepes 20 mM, [pH 7,6], NaCl 420 mM, EDTA 1 mM, glicerol a 20%, MgCl 1,5 mM

2, 1 mM de DTT , PMSF 1 mM, 5 mM de Na

3VO

4, NaF 5 mM), suplementado com um cocktail inibidor de protease completo [Roche]. A solução foi depois sonicado a 60% da amplitude duas vezes durante 10 segundos cada um. Os materiais insolúveis foram precipitadas por centrifugação. O sobrenadante foi recolhido e utilizado como extracto nuclear.

A análise de imunoprecipitação

Quantidades iguais de proteína A + G grânulos-Sepharose (Oncogene Research, Boston, MA) foram incubadas durante a noite com anti-PD2 (coelho policlonal) e os anticorpos em um volume total de 1 ml de anti-CHD1 (policlonal de coelho). Ele foi, em seguida, lavou-se duas vezes para remover o anticorpo não ligado e 1,5 mg de lisado de proteína foi adicionado à mistura de contas-anticorpo e incubados numa plataforma rotativa durante 5 h a 4 ° C. Após o período de incubação, as misturas foram lavadas cinco vezes com tampão de lise. Os imunoprecipitados ou lisados ​​de células totais foram resolvidos por electroforese em SDS-PAGE (10%). proteínas resolvidas foram transferidas para a membrana de PVDF. Após a lavagem rápida em PBST (solução salina tamponada com fosfato e 0,1% de Tween 20), as membranas foram bloqueadas em 5% de leite em pó magro em PBS durante pelo menos 2 horas e, em seguida, incubadas com os anticorpos primários (anti- Paf1 /PD2, OCT3 /4 e ARN Pol II). As imunotransferências foram lavadas cinco vezes (5 x 10 min), incubado durante 1 h com anticorpos secundários conjugados com peroxidase de rábano, lavou-se cinco vezes (5 x 10 min), feito reagir com reforçada reagente de quimioluminescência ECL (Amarsham Bioscience, Buckinghamshire, Reino Unido), e exposto a filme de raios-X para detectar o sinal.

Micrococo ensaio de nuclease

o ensaio de nuclease microcócica foi realizada como mencionado anteriormente [20], com algumas modificações. Cinquenta × 10

6 células foram sedimentadas a 2000 rpm a 4 ° C durante 10 minutos, seguido por lavagem com 10 ml de PBS gelado e novamente sedimentadas como anteriormente. As células foram então ressuspensas em 5 ml de NP-40 tampão de lise gelado (10 mM Tris-HCl (pH 7,4), NaCl 10 mM, MgCl 3 mM de

2, 0,5% de Nonidet P-40, espermina 0,15 mM e espermidina 0,5 mM), incubado durante 5 minutos em gelo e os núcleos foram sedimentadas. Os núcleos foi lavada com 2,5 ml de tampão de MNase digestão (10 mM de Tris-HCl, NaCl 15 mM, KCl 60 mM, espermina 0,15 mM e espermidina 0,5 mM) e após a centrifugação adicional ressuspensas em 1 ml de tampão de digestão de MNase contendo CaCl 2 mM

2. A partir das soluções ressuspensos, alíquotas de 100 ul foram colhidas e incubadas com quantidades crescentes de enzima nuclease Micrococo (0, 80 e 100 unidades) durante 5 e 10 minutos. A reacção foi parada pela adição de 80 ul de tampão de MNase digestão, 20 ul de tampão de paragem MNase (EDTA 100 mM, EGTA 10 mM), 3 ul de proteinase K (25 mg /ml) e 10 ul de SDS a 20% e incubadas durante a noite a 37 ° C. No dia seguinte, as amostras são extraídas com 200 ml de solução de fenol-clorofórmio. As amostras foram centrifugadas e uma camada aquosa foi recolhida. Dois ul de RNAse A (10 mg /ml) foi adicionado à solução e incubou-se a 37 ° C durante 2 horas e novamente a extracção com fenol-clorofórmio foi realizada. Além disso, o ADN foi precipitado por adição de etanol a 100% e, após a centrifugação, o sedimento de DNA foi ressuspenso em tampão de hidratação de ADN ou água. Cinco ug do ADN isolado foi resolvido num gel de agarose a 1,4% e visualizado por coloração com brometo de etídio. software ImagJ foi usado para análise de densitometria dos padrões de DNA de bandas no controle, mexidos e células PD2 KD PC.

Resultados

hPaf1 /PD2 afeta outras subunidades complexas PAF em células PC

o complexo de PAF humano é composto por cinco subunidades, semelhante ao seu homólogo de levedura, ou seja hPaf1, parafibromina (hCdc73), hCtr9, hLeo1 e a subunidade hSki8, que também é uma parte do complexo ESQUI humano. Relatórios anteriores demonstraram que as subunidades do complexo de PAF humano demonstrar a expressão coordenada de knockdown onde quer hCtr9 ou a subunidade hSki8 conduziu a uma redução dos níveis das outras subunidades tais como hPaf1 hLeo1 e [12]. Isto é consistente com a observação em levedura, em que a eliminação das subunidades individuais conduz a vários graus de redução dos níveis de proteína de outras subunidades [21]. Curiosamente, os dados recentes do nosso laboratório mostrou que, as subunidades de complexos de PAF funcionar de forma independente em células estaminais embrionárias de ratinho, de tal modo que o knockdown da subunidade Paf1 não afecta o nível dos outros subunidades [22]. Para analisar a importância funcional do hPaf1, a grande subunidade do complexo hPAF, no cancro do pâncreas, que transitoriamente derrubado hPaf1 /PD2 nas linhas celulares de cancro do pâncreas e Panc1 MiaPaCa. Corroborando com relatórios anteriores, descobrimos que hPaf1 /PD2 tem uma expressão coordenada com as outras subunidades do complexo hPAF. A análise por Western Blot de hCdc73 (parafibromina), proteínas hLeo1, hSki8 e hCtr9 e quantificação subsequente mostrou uma diminuição dos níveis da subunidade hLeo1, hCdc73 e hCtr9 expressão na hPaf1 knockdown células Panc1 e MiaPaCa em comparação com as células tratadas com siRNA mexidos (Fig. 1) embora não estatisticamente significativo. (P 0,05) No entanto, não houve alteração observável no nível da proteína de subunidade hSki8 mediante a regulação negativa da subunidade hPaf1. Confirmou-se ainda mais os resultados utilizando um grupo diferente de ARNsi (Santa Cruz, CA), dirigidos contra PD2 e observados efeitos semelhantes (Fig. S3). Estes resultados mostram que o knockdown de uma subunidade do complexo hPAF afecta a expressão dos outros membros, a fim de manter uma razão estequiométrica geral do complexo em células de cancro pancreático. Além disso, ele também enfatiza a expressão ea função das unidades individuais do complexo PAF em diferentes carcinomas diferencial.

Panc1 e células de câncer pancreático MiaPaCa foram transfectadas com oligos siRNA mexidos e PD2 específicos e lisados ​​de proteína foram coletadas em 72 horas pós-transfecção. A análise Western blot dos lisados ​​celulares utilizando anticorpos correspondentes mostrou a expressão de hPaf1 /PD2 e outras moléculas complexas PAF (parafibromina, hLeo1, hSki8 e hCtr9) em células Panc1 e MiaPaCa mexidos e Paf1 /PD2 RNAi tratados. A expressão de histona 3 Lisina 4 resíduo mono, di e tri-metilação marcas mostraram um nível reduzido no hPaf1 /PD2 knockdown células Panc1 MiaPaCa e em comparação com as células tratadas de ARNi mexidos. O nível total de histona H3 é a mesma em ambos mexidos e PD2 derrubado células. β-actina serviu como um controlo de carregamento. A quantificação das manchas de Western para cada linha de células é fornecida abaixo dos valores de imunotransferência com barras de erro correspondente. * Representa uma mudança significativa (p 0,05) em nível de proteína entre mexidos e células knockdown PD2

hPaf1 /PD2 influencia histonas metilação em células PC

O complexo levedura PAF tem um poço. papel estabelecido em modificações de histonas, tais como a metilação ubiquitinação e [4], [23] – [25]. Sabe-se para mediar a interacção entre o complexo Rad6-Bre1, COMPASSO histona metiltransferase, e ARN Pol II, que conduz à ubiquitinação de histona H2B na lisina 123 resíduo, o qual é um gatilho posterior para a metilação no resíduo de lisina 4 de Histona H3 [24]. Um estudo anterior demonstrou que a RNAi contra hCtr9 ou hSki8 levou a uma redução no nível celular de mono e trimethylation marcas histona H3K4 mas não dimetilação marcas em células HeLa, indicando um possível papel do complexo de PAF humana na metilação das histonas assim [12 ]. Descobrimos que knockdown transiente de hPaf1 /PD2 ARNi utilizando específica em células de cancro do pâncreas afeta metilação das histonas no resíduo H3K4 (Fig. 1). A análise por Western Blot de mono, di e trimethylation marcas na histona H3 lysine4 resíduo mostraram uma redução significativa (* p 0,05) nos níveis de H3K4 di- e trimetilada em PD2 knockdown células Panc1 e MiaPaCa, em comparação com as células tratadas de ARNi mexidos. No entanto, não havia muita variação nos níveis H3K4 monomethylation devido ao esgotamento PD2 em células de câncer de pâncreas. As experiências foram repetidas com um grupo diferente de siRNAs específicos PD2 em ambas as linhas celulares (Fig. S3). Nós novamente observado downregulation de di- histonas e trimethylation marcas como antes, com pouca ou nenhuma variação nos níveis de histona monometil.

hPaf1 /PD2 regula histona metiltransferase nível de proteína MLL1

Com base na observação de que hPaf1 /PD2 regula histona di e tri-metilação no resíduo H3K4, quisemos investigar o efeito da hPaf1 knockdown em metiltransferases histonas. A proteína MLL1 pertencente à família CONJUNTO1 de metiltransferases de lisina é conhecida para regular especificamente di-trimethylation e na histona H3 lisina 4 resíduos. Portanto, analisamos o efeito de hPaf1 /PD2 knockdown na expressão da proteína MLL1 usando dois conjuntos diferentes de PD2 siRNAs em linhas celulares de cancro pancreático Panc1 e MiaPaCa. A análise por Western blot revelou que uma diminuição no nível hPaf1 /PD2 em células de cancro do pâncreas leva a uma diminuição significativa (* p 0,05) no nível de proteína MLL1 (Fig 2A, S3.). Os gráficos fornecidos abaixo os resultados de imunotransferência representam quantificação das manchas de Western para cada linha celular. Nós ainda olhou para proteínas PD2 e MLL1 em ​​células de câncer de pâncreas por microscopia confocal e descobriu que as duas proteínas colocalize no núcleo, sugerindo assim uma possível interação entre eles (Fig. 2B). No entanto, a quantidade de co-localização das duas proteínas foi relativamente baixo, o que indica uma fraca interacção, possivelmente, e /ou transiente. Estes resultados foram em corroboração com estudos anteriores que mostraram que tanto a levedura e os complexos de PAF humanos interagir com o homólogo da proteína correspondente MLL ou Conjunto1 [4], [26], [27]. Portanto, nossos resultados sugerem que hPaf1 /PD2 regula, e, possivelmente, interage com MLL1, para controlar a metilação H3K4 em células de câncer de pâncreas.

células cancerosas pancreáticas (A) Panc1 e MiaPaCa foram transfectadas com oligos mexidos e PD2 RNAi e Os lisados ​​foram recolhidos a 72 horas após a transfecção. análise de Western Blot, utilizando anticorpos específicos revela uma diminuição na expressão da proteína histona metiltransferase em células MLL1 knockdown em comparação com células mexidos. β-actina serviu como um controlo de carregamento. Quantificação dos dados de Western blot é fornecida a seguir os resultados de imunotransferência correspondentes para as linhas celulares respectivas. As barras de erro representam o erro padrão indicados calculado a partir de três experiências independentes. * Representa a mudança significativa (p 0,05) no nível de proteínas entre mexidos e PD2 células knockdown. Imagens do microscópio (B) ilustram confocais e PD2 MLL1 localização no núcleo das células Panc1. MLL1 colocaliza com PD2 em regiões discretas dentro do núcleo (corado com DAPI) de células Panc1. A inserção representa uma imagem ampliada das manchas co-localização de PD2 e MLL1.

Knockdown de hPaf1 /PD2 diminui o nível CHD1 em células de câncer de pâncreas

A regulamentação da metilação da histona pela hPaf1 /PD2 subunidade do complexo hPAF levanta a possibilidade de que pode afectar várias outras proteínas, tais como factores de remodelação da cromatina, que interagem com histonas modificadas nos locais de transcrição. Um complexo de remodelação da cromatina putativo, DCC-1, foi identificado acidentais como uma proteína de ligação de ADN de mamífero, que contém três motivos de sequências de assinatura (1 Chromodomain helicase das proteínas de ligação ao ADN): o chromodomain ácido 52-amino encontrada na proteína heterocromatina HP- 1 eo Polycomb homeotic repressor, o domínio SNF2 /SWI2 ATPase, e característicos motivos de DNA minor-groove proteínas de ligação [28], [29]. Curiosamente, a proteína de remodelação da cromatina CHD1 é conhecido por se ligar especificamente ao metilado lisina 4 resíduo de histona H3, que é uma característica da transcrição activa. Postula-se que os chromodomains CHD1 humanos são responsáveis ​​pelo reconhecimento e a interacção com as marcas de metilação das histonas [30]. Dado que hPaf1 /PD2 regulada histona metilação no resíduo H3K4, nós investigamos regulação CHD1 por hPaf1 por knockdown transiente de hPaf1 /PD2 em células de cancro do pâncreas e analisada a variação dos níveis da proteína CHD1. A análise Western blot, juntamente com os dados fornecidos abaixo de quantificação dos valores de imunotransferência (Fig. 3A) correspondente que mostra knockdown de hPaf1 /PD2 em células de cancro do pâncreas leva a uma diminuição no nível de CHD1 em comparação com as células de controlo codificados. Regulação negativa do CHD1 como um efeito do knockdown PD2 foi ainda confirmada nas mesmas linhas de células utilizando um conjunto diferente de siRNA contra PD2 (Fig. S3). A fim de validar este efeito, foi utilizada microscopia de imunofluorescência. Consistente com os dados bioquímicos, a análise de imunofluorescência mostrou que o nível CHD1 é diminuída em hPaf1 /PD2 knockdown células Panc1 MiaPaCa e em comparação com as células MiaPaCa ou Panc1 mexidos (Fig. 3B). Em tempo real A análise de PCR quantitativa mostra ainda que, juntamente com o mRNA PD2, há também uma diminuição no nível de ARNm em CHD1 PD2 siARN células tratadas Panc1, indicando que regula a expressão hPaf1 CHD1 tanto nos níveis de transcrição e de tradução (Fig. S1A). Ao mesmo tempo, a superexpressão de PD2 em células de câncer pancreático HPAF /CD18 também aumenta a expressão CHD1 (Fig. S1B). Estes resultados indicam que hPaf1 /PD2 regula a expressão da proteína cromatina remodelação CHD1, sugerindo o seu possível papel na rearranjo da estrutura da cromatina durante o alongamento da transcrição em células de cancro pancreático.

(A) análise de transferência de Western mostra um diminuição do nível da proteína CHD1 em células PC mediante a inibição hPaf1 /PD2 RNAi mediada. β-actina serviu como um controlo de carregamento. O gráfico abaixo de cada figura Western Blot representa os resultados de quantificação de correspondentes linhas de células individuais. (B) Análise por imunofluorescência mostrando um nível hPaf1 /PD2 reduzida (verde), juntamente com uma redução correspondente no nível CHD1 (vermelho) em PD2 siRNA células PC tratados em comparação com as células tratadas siRNA mexidos.

hPaf1 /PD2 interage com CHD1 tanto no citoplasma e núcleo das células de cancro do pâncreas

Cromatina proteína remodelação CHD1 é conhecido por interagir com factores de alongamento e de transcrição localizar a genes transcritos activamente [31]. Em leveduras, funções CHD1 durante o alongamento da transcrição através de interacções com factores de alongamento, Spt4-Spt5 e Spt16-Pob3. Curiosamente, CHD1 também é encontrado para interagir com a subunidade rtf1 do complexo de PAF fermento que associa a ARN polimerase II e regula a transcrição de alongamento [31]. Embora o rtf1 está presente em seres humanos, não é, como parte do complexo hPAF. Portanto, testou-se a possibilidade de que a subunidade hPaf1 /PD2 do complexo de PAF humana interage com CHD1 utilizando estudos de co-imunoprecipitação. A análise Western blot dos co-imunoprecipitados PD2 mostra que interage com CHD1 em ambos citoplasma bem como extractos nucleares de células de cancro do pâncreas, Panc1 e MiaPaCa (Fig. 4). Analisamos ainda mais a interação entre PD2 e CHD1 por estudos de co-localização por meio de microscopia confocal (Fig. 5A). A coloração CHD1 (vermelho) foi encontrado para sobrepor com a coloração PD2 (verde), tanto no citoplasma bem como no núcleo das células de cancro do pâncreas em corroboração com os dados bioquímicos. Estes resultados sugerem que PD2 e CHD1 interagir e participar mais na remodelação estrutura da cromatina em câncer pancreático.

(A) citoplasmática e extrato de fracionamento nuclear foi realizada em células de câncer de pâncreas Panc1 e MiaPaCa seguido por co-imunoprecipitação recíproca de endógeno proteínas nas fracções de células. análise de Western blot mostra que hPaf1 /PD2 interage com CHD1 em ambos os extractos citoplasmáticos e nucleares de células de câncer pancreático Panc1 e MiaPaCa. imunoprecipitados anti-PD2 a partir de extractos de células e Panc1 MiaPaCa foram coradas imunologicamente com um anticorpo anti-CHD1. Da mesma forma, os precipitados anti-CHD1 foram colocados a hibridar com anticorpo anti-PD2. IgG de coelho foi usado como controlo.

e células Panc1 MiaPaCa (A) foram transfectadas com oligos mexidos e PD2 ARNi e 48 horas após a transfecção análise de imunofluorescência foi realizada. imagens confocal mostram que há uma redução na localização de CHD1 no núcleo (azul, corados com DAPI) de células de câncer pancreático PD2 KD (painel do meio) em comparação com as células mexidos (painel superior). As células foram ainda retransfected com pBABE-higrômetro PD2 construção para a expressão ectópica de PD2, 72 horas de transfecção pós intital. imagens confocais ilustrar adição de PD2 exógeno reshuttles CHD1 de volta para o núcleo (painel inferior). A inserção representa PD2 e CHD1 localização no núcleo (corado com DAPI).