Abstract

Neste trabalho, foi elaborado um modelo quantitativo de membranas biológicas pela deposição de planar lipídico membranas em substratos sólidos (chamados membranas suportadas), e imobilizada biotinilados oligómeros de ácido hialurónico (HA-oligo, 6-8 unidades de dissacárido de comprimento) para a superfície da membrana por meio de neutravidina reticuladores. Ao controlar a auto-montagem de âncoras de lípidos biotinilados, a distância média entre as moléculas de oligo-HA na membrana podia ser controlada a precisão nm. A adesão e a motilidade das células de adenocarcinoma do pâncreas que expressam diferentes variantes de processamento do receptor da superfície celular CD44 de ligação ao AH nestas superfícies foram investigados quantitativamente. A combinação de livre-label, imagens de lapso de tempo de células vivas e análise estatística sugere que a morfologia estática (forma global e remodelação do citoesqueleto) de células, as suas dinâmicas morfológicas estocásticos, ea probabilidade de movimento dirigido refletem o comportamento metastático do câncer células

Citation:. Kaindl T, Rieger H, Kaschel LM, Engel U, Schmaus A, Sleeman J, et al. Patterns (2012) espaço-temporal das células do cancro do pâncreas que expressam CD44 isoformas em membranas suportadas Resultados hialurônico oligômeros de ácido matrizes. PLoS ONE 7 (8): e42991. doi: 10.1371 /journal.pone.0042991

Autor: David Holowka, Universidade de Cornell, Estados Unidos da América

Recebido: 07 de maio de 2012; Aceito: 17 de julho de 2012; Publicação: 14 de agosto de 2012

Direitos de autor: © Kaindl et al. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Licença Creative Commons Attribution, que permite uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o autor original ea fonte sejam creditados

Financiamento:. Este trabalho foi suportada por Helmholtz no âmbito do programa “BioInterface”. Os financiadores não tiveram nenhum papel no desenho do estudo, coleta de dados e análise, decisão de publicar ou preparação do manuscrito

CONFLITO DE INTERESSES:.. Os autores declararam que não existem interesses conflitantes

Introdução

Nos últimos anos, CD44 emergiu como um importante mediador de interacções célula-matriz que integra a actividade de sinalização dos receptores do factor de crescimento através da sua função do co-receptor [1]. A expressão do gene de CD44 dá origem a uma família de glicoproteínas transmembranares, cujo peso molecular é extremamente heterogénea (PM 80-200 kDa), devido a N- e variável de glicosilação ligada a O splicing alternativo e [2], [3], [4] . Em particular, a inserção de até 10 exões durante variantes de processamento alternativo do transcrito de CD44 apresenta grande variabilidade na membrana extracelular da região proximal da proteína [5], [6], [7]. Estas isoformas contendo exão variantes são denominados CD44v, em contraste com CD44s que não contêm estes exões variantes.

A interacção de CD44 com o glicosaminoglicano hialuronano matriz extracelular (HA) é uma interacção mais intensivamente estudados do CD44 proteína [8]. Esta interacção é regulada a um número de níveis, incluindo glicosilação [4] e o agrupamento de CD44 que é promovida pela inclusão de sequências codificadas pelo exão variantes [9]. HA é sintetizada na forma de um polímero de elevado peso molecular composto por subunidades alternada de N-acetilglucosamina e ácido glucurónico [10]. Durante o crescimento do tumor e inflamação, degradação do HA pode ser aumentada, resultando na acumulação de pequenos oligossacáridos HA que exercem actividades biológicas não exibidas por alto peso molecular de HA [11]. Dois motivos de ligação de HA na porção extracelular da proteína CD44 medeiam a sua interacção com HA [12]. CD44 liga-se a um mínimo de um hexassacárido HA [13], e a sinalização através de CD44 pode ser regulado pelo tamanho de HA [1].

HA e CD44 foram ambos implicados na regulação do crescimento tumoral e metástase [4], [14], [15]. A acumulação de HA está associada com mau prognóstico do paciente e tem sido sugerida para aumentar a proliferação do tumor, invasão e angiogénese, entre outras [8]. Além disso, a expressão de diferentes isoformas de CD44 tem sido relacionada com prognóstico pobre em um número de diferentes tipos de tumores [14], e estudos em modelos animais mostraram evidência para um papel funcional das isoformas de CD44 nas metástases [16]. Importante, a interacção entre CD44 e HA tem sido associada com o crescimento de tumores e metástase [17], [18]. No entanto, dados contraditórios também existem. Em alguns contextos acumulação de HA diminui tumorigenicidade [19], [20], [21], [22], enquanto que a expressão de hialuronidases, enzimas que degradam HA, podem correlacionar-se com a progressão tumoral [23]. De modo semelhante a expressão de algumas isoformas de CD44 em determinados tipos de cancro pode correlacionar-se com bom prognóstico [15], e suprimir a metástase em modelos animais [24]. Em conjunto, estas observações sugerem que uma melhor compreensão de como CD44 interage com HA é necessária para explicar a relevância destas interacções complexas para a progressão do tumor e metástases, que por sua vez irá identificar novas rotas para a intervenção terapêutica.

O pâncreas de rato modelo de carcinoma BSp73 [25] fornece um modelo útil para analisar tanto as funções de promoção da metástase do CD44, bem como a interacção entre CD44 e HA. A linha de células BSp73AS (chamado 1AS no texto que se segue) é fracamente metastática, expressa CD44s mas apenas muito baixos níveis endógenos de variantes de CD44, e liga-se fracamente ao HA imobilizado [26]. A transfecção destas células com CD44v4-V7, uma variante de splicing encontrada em células altamente metastáticas, a linha celular produziu ASpSV14 que é altamente metastático em modelos de rato [16]. Expressão da proteína de CD44v4-V7 também promove a ligação de células a HA ASpSV14 através regulada agrupamento da proteína de CD44v4-V7 [9]. Uma mutação pontual R44L no motivo de N-terminal de ligação a HA da proteína CD44v4-V7 torna a proteína incapaz de se ligar ao HA, enquanto que um K162A, mutação de ponto duplo R166A no outro motivo de ligação de HA de resultados CD44v4-V7 num HA reduzida capacidade de ligação em comparação com a proteína de tipo selvagem CD44v4-V7 [26]. Assim, as células 1AS ectopicamente que expressam a proteína R44L CD44v4-v7 (AS-R44 células) não se ligam HA, enquanto as células 1AS ectopicamente expressar a K162A, proteína R166A CD44v4-v7 (AS-K162R166 células) mostram reduzida ligação a HA em comparação com ASpSV14 células [26].

Usando estas quatro linhas celulares, nós projetamos experimentos para examinar a interação de CD44 com HA precisamente espacialmente ordenada de comprimento definido (6-8 unidades de dissacarídeo). Especificamente, a adesão e motilidade das células cancerosas pancreáticas de rato que expressam diferentes isoformas CD44 foram estudados em densidades laterais definidas de HA. Em vez de não específico fisiossorção ou enxerto covalente de moléculas de oligo-Ha em substratos de plástico, que ancorado biotinilados moléculas oligo-HA via neutravidina reticuladores para a superfície de membranas lipídicas planas (os chamados “membranas suportadas” [27], [ ,,,0],28]), que incorporou âncoras de lípidos biotinilados. Isto permitiu que a aderência não específica de células, por meio de longo alcance de Van der Waals atracção para ser minimizado, e a distância média entre as moléculas de HA ancorados ao ser precisamente controlada dentro precisão nm [29]. Empregando uma combinação de imagens de lapso de tempo das células com micro-interferometria livre-label (RICM) [30], [31] e análise estatística [32], poderíamos avaliar quantitativamente a força de adesão celular, dinâmica estocástica de celular morfologia e persistência e velocidade da motilidade celular.

Materiais e Métodos

Materiais

1,2-dioleo�-sn-glicero-3-fosfocolina (DOPC) e 1 , 2-dioleoil-sn-glicero-fosfo-etanolamina 3-N- (biotinil tampão) (biotina-DOPE) foram adquiridos a Avanti Polar Lipids (Alabaster, AL, EUA), e neutravidina desglicosilada da Invitrogen (Karlsruhe, Alemanha) . A fluorescência de DRAQ5 corante de ADN vermelha distante de Biostatus limitado (Leicestershire, Reino Unido) foi utilizado para corar os núcleos das células, e Alexa Fluor 488 faloidina (Invitrogen, Karlsruhe, Alemanha) foi utilizado para a visualização do citoesqueleto de actina. ensaios de adesão foram realizados em canais de plástico sem fundo fluídicos (μ-slide I) de Ibidi (Munique, Alemanha) selados com o grau microscópica 25 × 75 milímetros

2 lâminas de vidro de Menzel (Braunschweig, Alemanha). Todos os outros produtos químicos de P.A. qualidade foram adquiridos da Sigma-Aldrich (Neu-Ulm, Alemanha), se não for especificado de outra forma. Ao longo deste estudo, a água deionizada ultrapura (GenPure, TKA Niederelbern, Alemanha) foi utilizada para a preparação de todas as soluções tampão.

imagens Micro-interferometria de células 1AS nas membranas suportadas exibindo (A) poli-HA e (B) de oligo-HA a uma distância média de

d

~ 5,5 nm em

t

= 2 h. Barra de escala: 8 um

A fracção de células 1aS aderidas às membranas suportadas indicados representados graficamente em função do tempo.. Os três membranas estudadas foram membranas pura DOPC (linha preta) e membranas exibindo oligo-HA at

d Art ~ 11 nm (linha verde) e

d Art ~ 5,5 nm (linha azul).

HA Preparação de amostras

polímero de ácido hialurônico (poli-HA) foi adquirido de Sigma-Aldrich (Neu-Ulm, Alemanha). oligómero de ácido hialurónico (HA-oligo, GE Healthcare, Heidelberg, Alemanha) foi preparado por degradação enzimática com hialuronidase bovina testículo [33] e fraccionamento com um purificador de ÄKTA (GE Healthcare, Heidelberg, Alemanha) para se obter oligómeros de 6-8 unidades de dissacárido em comprimento. Para a imobilização à superfície da membrana, tanto poli- e oligo-HAS foram modificados por acoplamento com (+) -. Hidrazida de biotina (Sigma-Aldrich, Neu-Ulm, Alemanha) [34], [35]

HA Preparação de Superfície

Antes de colagem, substratos de vidro foram limpos usando um protocolo RCA modificado [36]. Especificamente, os substratos foram sonicadas durante 5 min em acetona, etanol, metanol, e água, em seguida imersa numa solução de H

2O

2 (30%) /NH

4Oh (30%) /H

2O (01:01: 5 em volume) e sonicada durante 5 min à temperatura ambiente antes de imersão-los durante mais 30 min a 60 ° C. Depois disso, eles foram intensamente lavadas com água, secou-se a 70 ° C, e armazenado numa câmara de vácuo. misturas de lipidos com diferentes proporções molares de biotina-DOPE foram primeiro expostas a uma corrente de azoto, e depois mantidas numa câmara de vácuo a 25 ° C durante 12 h. Depois de suspender as películas de lípidos secos em água de s ionizada, vesículas unilamelares pequenas (SUVs) foram preparadas por sonicação com um sonicador de ponta (Misonix, Nova Iorque, EUA) durante 30 minutos a 1,0 W. membranas suportado foram preparados por deposição de suspensões SUV em substratos limpos. Após 20 min de incubação, as câmaras foram intensamente lavadas com água desionizada para remover os restantes vesículas. A distância média entre âncoras lipídicas (biotina-DOPE) e, portanto, a distância entre moléculas de HA pode ser estimada a partir da fração molar de biotina-DOPE χ

b-DOPE e a superfície por lipídios (

A

lipídico ~ 60 Å

2 [37]), como. No passo seguinte, a membrana foi incubada em solução de neutravidina (1 ug /ml, em água desionizada) durante 20 min. Após lavagem intensiva, uma solução aquosa de HA biotinilado (0,4 mg /ml) foi injectada em cada câmara de as lâminas de vidro e incubadas durante 20 min. Finalmente, as amostras foram lavadas com meio de cultura de células pré-aquecida e mantida a 37 ° C antes das experiências de adesão.

imagens RICM (esquerda) e imagens confocais de fluorescência (meio e direita) de ( a) As células 1AS (B) AS-K162R166 (células C) ASpSV14, e (d) AS-R44 células incubadas em membranas suportadas exibindo oligo-HA at

d Art ~ 5,5 nM durante 4 h. Após a fixação, DNA e actina foram coradas com DAPI e Alexa 488 faloidina.

Experiências de adesao celular

1AS, as células ASpSV14, AS-R44 e AS-K162R166 foram cultivadas como descrito anteriormente [26], [38]. As células foram colhidas por trypsination e, subsequentemente, re-suspenso em RPMI pré-aquecido 1640 a uma densidade de 1,75 x 10

7 células /ml. Uma porção da suspensão de células de 0,2 ml foi injectada em cada uma das câmaras das lâminas de vidro, e mantida a 37 ° C e 5% de CO

2. imagens de células vivas não-invasiva foi realizada usando microscopia de contraste de reflexão interferência (RICM) em um Axiovert 200 microscópio invertido (Carl Zeiss, Göttingen, Alemanha) equipado com um Antiflex objectiva de imersão em óleo PlanNeofluar 63 × /1,25. Para calcular a área de contato da membrana celular, imagens foram gravadas com uma câmera Orca ER CCD (Hamamatsu Photonics, Herrsching, Alemanha). Após a subtracção do fundo, as imagens foram binarizada para determinar o limite da zona de adesão. A fracção de células aderentes foi determinada através da normalização da células observadas por RICM (células aderidas) com células totais nas imagens de contraste de fase correspondente. As células para a aquisição de dados dependentes do tempo foram também incubadas em meio de células RPMI 1640 a 37 ° C e 5% de CO

2. As imagens foram tiradas com uma posição fixa, com intervalos de tempo de 10 min e 15 min durante 20 h. Após extracção da linha de contorno de células a partir de cada imagem binária, o centro de massa foi extraída e utilizada para a documentação de deslocamento de células e análise linha de contorno. Ambos os valores, a área de adesão

Um comprimento

e do contorno celular linha

L

, foram utilizados para o cálculo da circularidade dimensão. O factor de alongamento foi ainda deduzida pela relação da menor perpendicular ao eixos principais, e portanto, também resulta em uma gama adimensional entre 1 e 0.

(A) um instantâneo de uma célula ASpSV14 sobre uma coluna de oligo-HA membrana -functionalized (

d Art ~ 5,5 nm,

t

= 9 h) capturado por RICM. O bordo periférico da célula foi determinado por o contraste de intensidade de pixel. (B) A amplitude da amplitude de oscilação representada graficamente como uma função de

θ

. é a distância radial médio ao longo de

θ

= 0-360 °. (C) O mapa de amplitude em função do ângulo de

θ

ao longo do tempo (

t

= 140-1000 min). (D) A autocorrelação correspondente ao mapa amplitude no painel (C).

Resultados

A adesão dos 1AS a poli- e Oligo-HA amarrada a membranas suportadas

para comparar a HA características de células 1AS e seus derivados ligação, temos primeiro examinaram a capacidade de 1AS a aderir a HA tethered às membranas suportadas. A Figura 1 mostra imagens representativas de células RICM 1aS ligação durante 2 h para poli-HA e o oligo-HA amarrado a uma distância intermolecular média de

d

~ 5,5 nM. Neste estudo, a distância

d Art pode ser controlada pela concentração molar de moléculas de ancoragem difusivos livremente na membrana suportada. Como apresentado na Figura 1, as células mostraram uma pronunciada 1aS espalhando em ambas as superfícies. A média projetada áreas de células aderidas nas membranas funcionalizadas com poli-HA e oligo-HA calculados a partir da Figura 2A e figura 2B foram comparáveis,

A

poli = 480 mm

2 e

A

oligo = 560 mm

2, respectivamente. Em experiências de controlo, as células 1aS mostrou quase nenhum sinal de adesão às membranas DOPC puros (Figura 1C), confirmando a especificidade de adesão às superfícies HA

.

mapas de amplitude representativos de (A) 1AS e (B) ASpSV14 células plotadas em função da

θ

gravada durante a fase inicial de adesão celular (

t

= 0-200 min). As correspondentes funções de autocorrelação para 1AS e ASpSV14 são apresentados no painel (C) e (D), respectivamente.

A análise da área de adesão, o factor de alongamento e circularidade calculado a partir de nove células (Tabela 1) sugere que as células 1aS espalhar isotrópico em ambas as superfícies de oligo-HA-HA e poli. Na verdade, as regiões de aderência apertada identificado por intensidades de pixel de baixo (tipicamente, a distância de separação abaixo de 10 nm [39]) foram encontrados perto da periferia da célula. Concluímos, portanto, que o oligo-HA, bem como poli-HA podem agir como ligandos específicos para células 1as. Como observamos nenhuma diferença na ligação de células 1AS a superfícies poli-HA e oligo-HA, nos experimentos posteriores usamos oligo-HA exclusivamente com uma distribuição de tamanho estreita (6-8 unidades de dissacarídeo de repetição).

(a) mapa Amplitude de 1AS representativa e células ASpSV14 (B) plotados em função do

θ

registrados após o estabelecimento da adesão estável (

t

= 600-1000 min). A autocorrelação correspondente de células 1as e ASpSV14 são apresentados no painel (C) e (D), respectivamente. Três imagens matérias RICM são apresentados para as células (E) 1as e (F) ASpSV14 em diferentes pontos de tempo. Barras de escala:.. 10 um

grau de deformação de uma única célula (linha preta), células 1AS representativa e uma célula ASpSV14 (linha azul) com relação à direcção de motilidade celular

Em seguida, analisou como o espaçamento de oligossacáridos HA tethered influencia a ligação de células 1aS a estas superfícies. A proporção de células que aderiram ao 1aS oligo-HA suportado membranas para várias distâncias médias entre moléculas de oligo-HA foi avaliada como uma função de tempo. Surpreendentemente, apenas uma ligeira alteração no

d Art de 5,5 nm a 11 nm resultou em uma diferença significativa em ambas as cinéticas e a eficiência de adesão celular (Figura 2). At

d Art ~ 11 nm, as células 1AS necessários 90-120 min para atingir níveis de saturação de adesão (40-50%), enquanto a AT

d Art ~ 5,5 nM para as mesmas células única de 30-60 min foi muito necessários para atingir um nível mais elevado de saturação de aderência ( 80%). Estes resultados sugerem que a adesão de células específicas para 1aS oligo-HA é altamente sensível à apresentação espacial das moléculas de oligo-HA em membranas suportadas no nível de precisão nm.

Em seguida, examinaram a capacidade de células 1aS expressam diferentes isoformas de CD44 de se ligar ao oligo-HA amarrados a membranas suportadas em

d

~ 5,5 nM durante 4 h. Sob estas condições, RICM e imagens de fluorescência confocal foram obtidos para células 1aS, AS-K162R166 células, células ASpsV14, e como células-R44 (Figura 3). Em paralelo, foram realizadas experiências de controlo para todos os quatro tipos de células para examinar a sua adesão às membranas DOPC puros, e confirmou que a adesão não específica é insignificantemente pequena ( 10%) para todos os tipos de células (dados não apresentados). Antes da imagiologia, as células foram fixadas, e actina e ADN foram marcadas com Alexa 488-faloidina e DRAQ5, respectivamente. Para cada linha celular, entre 30 a 90 células foram analisados, e foi seleccionado um período mínimo de cinco células para microscopia confocal. Exemplos representativos são mostrados na Figura 3. As células tomam-se 1AS uma forma pentagonal ou heptagonal, e exibem uma mais isotrópica do que espalhando-as células como K162R166 e ASpsV14 (Figura 3A). Em contraste, as células AS-R44 permaneceu quase esférica (Figura 3D), e a imagem RICM mostraram nenhum sinal de adesão significativa por estas células para a membrana (Figura 3D, coluna da esquerda).

A presença de um malha densa de actina periférica e a formação de fibras de stress como observado para as células parentais 1aS tem sido associada com as células que não são móveis [40]. Por outro lado, como-K162R166 células (Figura 3B) e as células ASpSV14 células (Figura 3C) mostram características de altamente móvel, células que migram, como a actina lamellipodial denso na parte da frente espalhamento (indicado pelas setas), e fibras de stress, juntamente o eixo maior das células. Deve notar-se que a área de adesão é comparável entre 1AS, AS-K162R166 células e ASpSV14, apesar das diferenças significativas na morfologia celular entre as células 1as e seus-expressando v7 CD44v4 AS-K162R166 e ASpSV14 derivados (Figura S1).

morfológicas Dynamics de 1as e ASpSV14 Cells

para destacar a evolução temporal da morfologia das células em resposta a oligo-HA superfícies, primeiro extraído da borda periférica de células a partir das imagens RICM de lapso de tempo. Um total de cinco e sete 1AS ASpSV14 células foram analisadas deste modo. A Figura 4A mostra um exemplo representativo de uma célula ASpSV14 sobre uma membrana suportada funcionalizado com oligo-HA (

d

~ 5,5 nm,

t

= 9 h). Após a delimitação do bordo periférico da célula utilizando o contraste nos valores de pixel, a distância radial

R

entre a borda do (linha amarela) de células e o centro de massa foi representada graficamente como uma coordenada polar (

R

,

θ

), como mostrado na Figura 4B. Aqui,

θ

= 0 é definido como direção vertical no sistema de laboratório. Isto permitiu-nos para controlar a direcção do movimento celular e para identificar a anisotropia morfológica de uma célula no ponto de tempo

t

. A amplitude da flutuação forma é definida como, se é a distância radial médio ao longo de

θ

= 0-360 °. Ao traçar marcado com um código de cor em função do ângulo

θ

ao longo do tempo

t

(Figura 4C), as alterações morfológicas dinâmicas na célula alvo pode ser representada. Além disso, os padrões espaço-temporais escondidos por trás do ruído estocástico da dinâmica morfológicas podem ser extraídos pela análise de suas funções de correlação [32]. A função de autocorrelação do mapa de amplitude pode ser calculado pela fórmula: (10)

Como mostrado na Figura 4D, a função de autocorrelação calculado a partir do mapa de amplitude (Figura 4C) sugere que a célula é linearmente esticado até Δ

t ~

± 200 min, os contratos de uma linha de contorno rodada em Δ

t ~

± 300 min, e, posteriormente, é linearmente esticada em uma direção perpendicular após Δ

t ~

± 400 min, o que pode ser identificado por uma mudança de posições de pico por ~ 90 °.

as Figuras 5A e 5B representam os mapas de amplitude de células representativas 1as e ASpSV14 representados graficamente como uma função de

θ

e

t

durante a fase anterior de aderência (

t

= 0-200 min) para membranas de oligo-HA-funcionalizado a

d

~ 5,5 nM. Como apresentado na figura, ambas as células mostram muito pouco desvio da distância radial significativo a partir do centro de massa. As autocorrelações correspondentes para (C) 1AS e (D) ASpSV14 também não mostram nenhuma característica, sugerindo que tanto as células não metastáticas e metastático espalhado isotrópica quando eles estão inicialmente em contacto com as membranas de oligo-HA-funcionalizados. Este achado experimental é consistente com os relatórios anteriores sobre a propagação de condrócitos [41] e fibroblastos [42] inicial.

Por outro lado, observou-se uma transição clara na morfologia celular dinâmica após o estável células cancerosas estabelecida adesão. A transição foi observada em torno de

t

= 300 min para ambos metastático ASpSV14 e células metastáticas 1AS mal. Após a transição, as células apresentaram diferenças distintas em amplitudes e autocorrelações. As células 1aS exibiu mais de 3 máximos distintos com amplitudes comparáveis ​​de cerca de 20 ^ M em t = 750 minutos (Figura 6A), o que implica que a célula adere desenvolveu-se uma forma hexagonal. Como a Figura 6A e 6E mostram, é muito difícil de distinguir padrões característicos apenas a partir dos mapas de amplitude em bruto, devido a dinâmica morfológicas das células biológicas são altamente estocástica. estocástica ruído intrínseco dos sistemas dinâmicos foi superada através do cálculo da função de autocorrelação (Equação 1). Como mostrado na Figura 6C, três picos de autocorrelação estáveis ​​e pronunciado para simetria rotacional em Δ

θ

max = -120 °, 0 °, 120 ° e foram identificados. A intensidade autocorrelação temporal, rapidamente deteriorado para Dt ≠ 0 min, sugerindo que a célula 1AS gira sem alterar a sua forma.

Em contraste, o mapa de amplitude de células metastáticas ASpSV14 mostrou dois máximos acentuado até as

R

max ~ 11 pM (Figura 6B). A autocorrelação correspondente exibe duas correlações positivas separados por ~ 180 ° (Δ

θ

max = 0 ° e ± 180 °), que são estáveis ​​ao longo do tempo Δ

t

(Figura 6D ). Isto indica que a célula foi linearmente esticada e movida por mais do que 2 h, no mesmo sentido. RICM imagens de células em locais ASpSV14 imagens fixas (Figura 6F) ilustram o movimento e o alongamento da célula antes de alterar a sua orientação. Este resultado está em contraste com a isotrópico espalhamento observado em pontos de tempo anteriores (Figura 5C e 5D).

Motilidade das células cancerosas que expressam CD44s e CD44v4-v7

Na próxima etapa, estudamos a motilidade das células ASpSV14 e 1aS seguindo o deslocamento do centro de massa, determinada a partir da área projectada de aderência. Aqui, a velocidade média da célula foi definido como o deslocamento da célula

dx

amostrados dentro de um intervalo de tempo de cada

dt = 30 min durante nove células ASpSV14 e quatro 1AS células. A velocidade média permaneceu quase constante para ambos os tipos de células mais de 20 h. A velocidade média das células ASpSV14,

v

psV14 = 5 ± 0,2 m /h, foi apenas ligeiramente maior do que a de células 1aS,

v

1AS = 4 ± 0,2 m /h, em que os erros representam o desvio padrão dos valores médios.

Para deduzir a relação entre a direcção de motilidade e a alteração morfológica, que também calculada a função de distribuição de probabilidade de o grau de célula deformação e a direcção da motilidade celular: (14)

Note-se que

θ

= 0 é definido como o sentido da motilidade celular. A velocidade e mudança deformational das células cancerosas foi avaliada por seis 1AS e quatro células ASpSV14. Como apresentado na Figura 7, um sinal claro do intervalo de simetria de uma única, representativa ASpSV14 célula pode ser identificada como um sub-pico distinto que se desvia do centro de 8 mm na direcção da motilidade celular. Isto está em contraste com a das células que possuem o 1aS pico perto do centro, que corresponde ao movimento aleatório, isotrópico. Para ambas as linhas celulares, o histograma foi calculado por mais de 55 linhas de contorno celular.

Discussão

Embora a interacção de CD44 com HA é claramente importante no contexto de cancro [4], o papel dessas moléculas no crescimento de tumores e metástases precisa de mais investigação para compreender os resultados por vezes contraditórios sobre a natureza dessa interação. Em particular, a análise utilizando espaçamento definido de HA de um tamanho homogéneo tem faltado até à data. Aqui temos utilizado HA tethered às membranas suportadas para investigar parâmetros biofísicos associados com a ligação celular para HA. Verificou-se que, enquanto as células que expressam 1aS CD44s-ligados igualmente bem para superfícies de oligo-HA poli-HA e, a ligação era extremamente sensível à distribuição espacial da HA. Ao nível da célula única, a expressão ectópica de CD44v4-V7 nestas células não alteram a ligação inicial para as superfícies de oligo-HA, mas mais tarde induziu morfologia celular alterada e migração direccional melhorada.

Anteriormente já demonstrado que, em contraste com as células ASpSV14, células 1aS ligam muito fracamente ao HA superfícies imobilizados [26]. Nestes ensaios de ligação de células, foi empregue a absorção de HA a superfícies de plástico, em que nenhum controle sobre a densidade ou a distribuição espacial das moléculas de HA era possível [26]. No entanto, no presente estudo, ambos os tipos de células ligadas a oligo-HA tethered membranas, embora as células ASpSV14 responderam de forma diferente em termos de morfologia e motilidade após a ligação inicial para as superfícies. Nós também descobrimos que a superfície de ligação de células 1aS a oligo-HA foi fortemente influenciado pelo espaçamento das moléculas de HA. Por conseguinte, é possível que a distribuição espacial da HA em ensaios anteriores não era óptima para a ligação de células 1aS, mas suficiente para a ligação de células que expressam ASpSV14 Além disso, a proteína CD44v4-V7. Os trabalhos irão ser necessários para determinar se as células ASpSV14 são menos sensíveis à distribuição espacial da HA do que as células 1as. Isto parece provável, devido à aglomeração de CD44 na superfície das células que leva a melhores propriedades de ligação de HA [9].

O derivado de 1AS AS-R44 ectopicamente expressa uma forma mutante de CD44v4-V7 que não se pode ligar a HA [26]. Surpreendentemente, apesar de AS-R44 células expressam CD44s semelhantes às células parentais 1aS que se podem ligar a superfícies de oligo-HA, as células AS-R44 não foram capazes de interagir com estas superfícies (Figura 3). Estes dados sugerem, portanto, que a forma mutante não-HA de ligação de CD44v4-v7 pode afectar a actividade de ligação da proteína HA CD44s endógena. Consistente com esta noção, as células AS-K162R166 que expressam uma forma mutada do CD44v4-V7 que mostra apenas uma capacidade de ligação parcialmente reduzida para HA [26] comportou-se de modo semelhante nos ensaios de ligação para as células que expressam o ASpSV14 de tipo selvagem CD44v4- proteína V7

de acordo com a distribuição espacial das oligo-HA empregue neste estudo, a velocidade de translocação significativo de células ASpSV14 ( .

v

psV14 = 5,0 ± 0,2 m /h) foi comparável à das células 1aS (

v

1AS = 4,4 ± 0,2 m /h) ao longo de 20 h, apesar de uma diferença significativa na sua dinâmica morfológicas (Figura 6). No entanto, a análise da deformação celular dirigida (Figura 7) sugere que enquanto as células 1aS só migram aleatoriamente sobre a superfície do oligo-HA, as células apresentam uma melhor motilidade ASpSV14 direccional. Estas diferenças podem reflectir o comportamento altamente metastático de células ASpSV14

in vivo

em comparação com o comportamento metastático fraco de células 1AS [7], [16]. Além disso, embora 1AS citoesqueleto células exibem características anteriormente associado com as células imóveis [40], o facto de a sua velocidade foi observada a ser semelhante a células ASpSV14 sugere que estas características em vez reflectir as características morfológicas das células dinâmicas.

neste estudo, utilizou-se quantitativamente funcionalizado membranas apoiadas e estudou a adesão, padrões morfológicos, e motilidade de células de adenocarcinoma do pâncreas que expressam diferentes isoformas CD44. Para discriminar os padrões espaço-temporais característicos do ruído estocástica de sistemas de células dinâmicas, introduzimos uma análise de imagem estatística relativamente simples, mas simples, como funções de autocorrelação. Anteriormente, Maeda et al. investigou a morfologia e correlação de orientação do molde de limo

Dictyostelium discoideum

em substratos de vidro [32], os relatórios que

D. discoideum

sofre transições estocásticos dentro de uma janela de tempo de 10-20 min. Os nossos resultados sugerem que a dinâmica morfológicas das células de cancro do pâncreas é muito mais lenta, com janelas de tempo características de várias horas. Isto pode ser atribuído, em parte, para o espalhamento proeminente e a adesão de células cancerosas mediadas através de interacções específicas de HA-CD44, e pode requerer tanto a adesão à superfície (aderência) e clivagem sucessiva de CD44 (libertação) durante a migração celular, tal como sugerido por uma prévia estudo [43].

a dinâmica das partículas “auto-propulsão” está atraindo cada vez mais atenção no campo da física estatística longe do equilíbrio.