Abstract

Os níveis de expressão e regulamentar papéis de miR-497 em câncer de pâncreas não são claras. O valor clínico do receptor do factor de crescimento 1 semelhante à insulina no plasma (IGF-1R) em cancros pancreáticos não foi investigada. No presente estudo, demonstramos que miR-497 foi significativamente regulada negativamente em tecidos de cancro do pâncreas. A sobre-regulação de miR-497 em BxPC-3 e AsPC-1 linhas de células do cancro do pâncreas inibiu a proliferação, apoptose aumentada, as células de gemcitabina re-sensibilizados e suprimiu IGF-1R e a expressão de p-AKT através downregulation directo da expressão da proteína IGF-1R. Foram observados efeitos opostos após a regulação baixa de miR-497. Os níveis plasmáticos de IGF-1R em pacientes com câncer pancreático aumentou significativamente, em comparação com que, em pacientes com pancreatite crônica, outros tumores pancreáticos e tumores neuroendócrinos do pâncreas (

P = 0,006

,

P = 0,018 Comprar e

P = 0,004

, respectivamente), e exibidos valores potenciais para distinguir lesões pancreáticas. No entanto, os níveis em pacientes com câncer pancreático foram comparáveis ​​aos que, em voluntários saudáveis ​​(

P = 0,095

). O estágio locais tumorais e TNM foram associados com os níveis de IGF-1R de plasma (

P = 0,013 Comprar e

P = 0,01

, respectivamente). Não houve diferença significativa da sobrevivência global entre os grupos de alta e baixa expressão de IGF-1R. Em conclusão, foi demonstrado que o miR-497 atenuou a malignidade das células de cancro do pâncreas e promoveu a sensibilidade de células a gemcitabina por directamente regulação negativa da expressão de IGF-1R. Plasma IGF-1R exibido um valor potencial para distinguir lesões pancreáticas e poderia ser um novo biomarcador para orientar estágio TNM de câncer pancreático

Citation:. Xu JW, Wang TX, Você L, Zheng LF, Shu H, Zhang TP, et ai. Fator de Crescimento (2014) Insulin-Like 1 Receptor (IGF-1R) como um alvo de miR-497 e Plasma IGF-1R níveis associados com TNM fase de cancro do pâncreas. PLoS ONE 9 (3): e92847. doi: 10.1371 /journal.pone.0092847

Autor: Lucia R. Languino, Thomas Jefferson University, Estados Unidos da América

Recebido: 19 Agosto, 2013; Aceito: 27 de fevereiro de 2014; Publicação: 25 de março de 2014

Direitos de autor: © 2014 Xu et al. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Licença Creative Commons Attribution, que permite uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o autor original ea fonte sejam creditados

Financiamento:. Este estudo foi apoiada por doações do National Science Foundation Natural da China (No. 81272484, 81141027), Pequim Natural Science Foundation (No. 7.132.179), Pequim Municipal Natural Science Foundation (7.100.003) e o Fundo especial de Investigação para Pública Indústria do Bem-Estar da Saúde ( 201202007). Os financiadores não tiveram nenhum papel no desenho do estudo, coleta de dados e análise, decisão de publicar ou preparação do manuscrito

CONFLITO DE INTERESSES:.. Os autores declararam que não existem interesses conflitantes

Introdução

adenocarcinoma ductal pancreático (PDAC) é uma doença agressiva e devastadora. PDAC tem um extremamente pobre prognóstico, com uma taxa de sobrevida em 5 anos inferior a 5% [1]. Embora os mecanismos da carcinogénese do pâncreas, os novos marcadores para a detecção precoce e as novas estratégias terapêuticas têm sido amplamente investigados [2], [3], [4], a sobrevivência global não foi melhorada nos últimos 80 anos [5] . Os mecanismos moleculares da progressão da PDAC, incluindo a proliferação, a apoptose, a resistência aos medicamentos, permanecem obscuros.

MiRNAs são curtos não codificante ARN, que pode inibir a tradução do ARN mensageiro (ARNm) na proteína através da ligação à região 3 ‘não traduzida (3’-UTR). MiRNAs pode agir como oncogenes ou supressores tumorais na regulação da carcinogénese, da capacidade metastática e resistência às drogas [6]. Regulação negativa de miR-497 foi observada em cancros da mama, colo-rectal e os cancros cervicais [7], [8], [9]. No entanto, não há nenhum relatório sobre os níveis de expressão de miR-497 em câncer pancreático no presente. Insulin-like growth factor 1 receptor (IGF-1R) foi identificado como um alvo de miR-497. Regulação baixa de miR-497 contribui para a malignidade do cancro colo-rectal e cancro do colo do útero por upregulating IGF-1R [8], [9]. No entanto, os papéis e mecanismos de regulação de miR-497 em cancro do pâncreas ainda não são claras.

IGF-1R é um receptor tirosina-quinase, que envolve na regulação da proliferação, apoptose, diferenciação e transformação maligna de células cancerosas [10]. Regulação positiva de IGF-1R em tecidos PDAC humanos tem sido relatada [11] e associados com maior grau tumoral e pobres sobrevivência [12]. No entanto, os níveis de plasma de IGF-1R em doentes com cancro pancreático não foram detectados em estudos anteriores. Os valores clínicos de plasma IGF-1R em câncer de pâncreas são desconhecidos.

No presente estudo, descobrimos que miR-497 foi significativamente regulada negativamente em tecidos de cancro do pâncreas. Regulação positiva de miR-497 inibiu a proliferação, apoptose aumentada e promovida sensibilidade à gemcitabina através downregulating diretamente a expressão de IGF-1R em células cancerosas PDAC

in vitro

. Também mostrou que os níveis de plasma de IGF-1R em doentes com cancro pancreático foram comparáveis ​​aos que em voluntários saudáveis, mas maior do que em pacientes com pancreatite crónica, outros tumores pancreáticos e de tumores neuroendócrinos pancreáticos, e os valores apresentados para distinguir lesões pancreáticas. A fase locais tumorais e TNM foram associados com os níveis de IGF-1R de plasma. Não houve diferença significativa de tempo de sobrevida global entre os grupos de alta e baixa expressão IGF-1R.

Métodos

declaração Ética

Os estudos foram realizados em conformidade com a aprovação ética do Institutional Review Boards of College Hospital Peking Union Medical. consentimento informado por escrito foi obtido de todos os assuntos.

A detecção da expressão de miR-497 por hibridização in situ (ISH)

10, as amostras de câncer de pâncreas embebidos em parafina fixadas em formalina e combinados tumor- tecidos adjacentes foram obtidos e transformados em microarrays de tecido. Os níveis de expressão de miR-497 em tecidos foram detectadas utilizando sonda de detecção miRCURY LNA para miR-497 (Exiqon, Vedbaek, Dinamarca, número do produto: 38256-15). A ISH foi executada como descrição seguinte. Resumidamente, as lâminas foram incubadas a 37 ° C durante 30 minutos, desparafinados em xileno e re-hidratadas com álcool graduado lavagens. Em seguida, as lâminas foram colocadas em 4% de paraformaldeído durante 20 min num exaustor de fumos, e em seguida, lavou-se com solução salina tamponada com fosfato (PBS) três vezes. As lâminas foram então tratadas com 15 ug /ml de proteinase K durante 15 minutos a temperatura ambiente. Em seguida, lavou-se as lâminas com PBS e fixou-os em 4% de paraformaldeído durante 15 min após o que. Após lavagem, as lâminas foram pré-hibridados com tampão de hibridação durante 1 hora a 50 ° C, quarto e, em seguida, hibridados durante a noite a 4 ° C em tampão de hibridação contendo a sonda. lavagens de restringência foram realizadas a 50 ° C durante 20 minutos, e, em seguida, as lâminas foram incubadas numa solução de bloqueio durante 1 hora à temperatura ambiente. Posteriormente, as lâminas foram incubadas em solução com fosfatase alcalina conjugada anti-DIG fragmento Fab de bloqueio durante a noite a 4 ° C. A reacção de detecção colorimétrica foi realizada utilizando o kit de NBT /BCIP (ThermoFisher Scientific) de acordo com o protocolo do fabricante. Os resultados ISH foram registrados como a percentagem de células positivas.

cultura de células e reagentes

BxPC-3 e AsPC-1 linhas celulares PDAC foram gentilmente cedidas pelo Professor Helmut Freiss (Universidade de Heidelberg, Alemanha ), que obtido a partir da American Type Tissue Culture Colecção (ATCC, Rockville, MD) [13], [14], [15]. PDAC células foram cultivadas numa incubadora humidificada com 5% de CO2 a 37 ° C em meio RPMI-1640 suplementado com 10% de plasma de bovino fetal (FBS, Hyclone). Os anticorpos primários foram comprados a partir de Cell Signaling Technology, incluindo IGF-I receptor β (D23H3) XP coelho mAb (# 9750), β-actina (13E5) Coelho mAb (# 4970), fosfo-Akt (Ser473) (D9E) XPRabbit mAb (# 4060), Akt (pan) (11E7) Rabbit mAb (# 4685), caspase-3 Antibody (# 9662) e PARP Antibody (# 9542).

Mirna transfecção

miR-497 (5′- imita CAGCAGCACACUGUGGUUUGU-3 ‘, 5′-AAACCACAGUGUGCUGCUGUU-3′), o controlo imita (5’-UUCUCCGAACGUGUCACGUTT-3 ‘, 5′-ACGUGACACGUUCGGAGAATT-3′), inibidor de miR-497 (5’- ACAAACCACAGUGUGCUGCUG-3 ‘) e inibidor de controlo (5′-CAGUACUUUUGUGUAGUACAA-3’) foram sintetizados por Genepharma (Xangai, China). MiRNAs a 50-100 nM foram transfectadas utilizando Lipofectamine 2000 de reagente de transfecção (Invitrogen, Carlsbad, CA) de acordo com o protocolo do fabricante.

extracção de RNA celular e RT-PCR quantitativo (qRT-PCR)

As células foram transfectadas em placas de 6 poços. Após 48 horas de transfeco, o ARN total foi extraído utilizando TRIzol (Invitrogen, Carlsbad, CA) de acordo com o protocolo do fabricante. Para o ensaio quantitativo de IGF-1R, o ARN total foi transcrito de forma inversa utilizando o kit de transcrição reversa (Promega, Madison, WI) de acordo com as instruções do fabricante. PCR em tempo real foi realizado utilizando o SYBR Green Mistura de PCR (Takara, Japão). GAPDH foram servidos como controle endógeno

IGF-1R Atacante primário:. 5′-TCTGGCTTGATTGGTCTGGC-3 ‘

Iniciador inverso

: 5′-AACCATTGGCTGTGCAGTCA-3′

GAPDH iniciador directo: 5′-CGGAGTCAACGGATTTGGTCGTAT-3 ‘,

iniciador inverso: 5′-AGCCTTCTCCATGGTGGTGAAGAC-3′

para o miR-497 ensaio quantitativo, miARN ensaio TaqMan foram utilizados de acordo

com o protocolo do fabricante (Applied Biosystems). U6 foi usado como um controle endógeno. Dobram mudanças foram calculados utilizando a 2

-ΔΔCT método.

análise Proliferação

In vitro

proliferação foi analisada utilizando um kit de contagem de células (CCK-8). BxPC-3 e células AsPC-1 foram transfectadas em placas de 6 poços (5 x 10

5cells /poço). Após 24 horas, as células foram tripsinizadas e re-semeadas em placas de 96 poços (1000 células /poço). 10 ul /poço de CCK-8 de reagente foi adicionada a 0, 24, 48, 72 horas, respectivamente, e incubou-se durante 2,5 horas a 37 ° C. A densidade óptica (OD) foi medida a 450 nm e 630 nm por um leitor de microplacas (Wellscan MK3, Thermo /Labsystems, Finlândia).

análise Chemosensitivity

BxPC-3 e AsPC-1 células foram transfectadas durante 24 horas, plaqueadas em placas de 96 poços (4000 células /poço), e tratou-se com gemcitabina diluídas em série (Eli Lilly and Company) em triplicado. Após 48 horas de incubação, foram adicionados 10 ul /poço de reagente de CCK-8 e foram incubadas durante 2,5 horas a 37 ° C. A densidade óptica (OD) foi medida a 450 nm e 630 nm utilizando um leitor de microplacas.

Western blotting

Depois de 48 horas de transfecção em placas de 6 poços, as células foram digeridas com solução de tripsina e lisadas com tampão RIPA (Applygen, Pequim). As proteínas totais foram separadas por electroforese em dodecil sulfato de sódio em gel de poliacrilamida (SDS-PAGE) e transferidos para um difluoreto de polivinilideno (PVDF) de membrana (Millipore, Billerica, MA). Após o bloqueio com leite seco não gordo a 5% à temperatura ambiente durante 1 hora, as membranas foram incubadas durante a noite a 4 ° C com os anticorpos primários. As membranas foram então lavadas e incubadas com um anticorpo conjugado com peroxidase de rábano secundário (Applygen, Pequim) à temperatura ambiente durante 1 hora. As bandas de proteína foram visualizadas com o sistema de detecção echochemiluminescence (ECL), e os níveis de expressão destas proteínas foram avaliadas usando o programa Image-Pro Plus 6.0 (Media Cybernetics, EUA).

ensaio de repórter de luciferase dupla

Os vetores PMIR-RB-Report-IGF-1R-3′-UTR contendo tipo selvagem ou sequência alvo mutado foram construídas por RiboBio Co., Ltd. (Guangzhou, China). células BxPC-3 foram plaqueadas em placas de 12 poços (1 × 10

5 células /poço) e co-transfectada com o miR-497 imita e vectores que expressam sequência alvo mutada, ou co-transfectadas com mímicas e vectores que expressam alvo do tipo selvagem sequência utilizando Lipofectamine 2000. Após a transfecção, durante 48 horas, a actividade da luciferase foi medida utilizando o Sistema de Ensaio Repórter dual-luciferase (Promega) de acordo com o protocolo do fabricante.

pacientes e no plasma de IGF-1R expressão

As amostras de plasma foram coletadas de 42 pacientes com câncer pancreático. Plasma amostras de pacientes com outros tumores pancreáticos (29 pacientes, incluindo cystadenoma serosa (7 casos), cystadenoma mucinoso (8 casos), tumor sólido pseudopapilar (10 casos) e neoplasia mucinoso papilar intra-ductal (4 casos)), pancreatite crônica ( CP, 19 pacientes), tumor neuroendócrino pancreático (PNET, 19 pacientes) e em voluntários saudáveis ​​(30 casos) foram coletadas como controle. O câncer de pâncreas, PNET e outros tumores pancreáticos foram diagnosticados através do exame patológico. CP foi diagnosticada de acordo com os critérios de diagnóstico clínico. As amostras de sangue foram centrifugadas a 3000 revoluções por minuto (rpm) durante 10 minutos. O plasma foi recolhido e armazenado a -80 ° C antes da utilização. Os níveis de IGF-1R de plasma foram detectados utilizando IGF-1R ELISA Kit (número de catálogo: CSB-E13766h, CUSABIO, China). Seguindo o protocolo do fabricante

A análise estatística

SPSS v.13.0 (SPSS, Inc, Chicago, IL) foi utilizado para as análises estatísticas. Os dados contínuos foram apresentados como média desvio ± padrão (SD) e comparados por análise de variância (ANOVA), do estudante

t

teste ou o teste de Mann-Whitney

U

teste. Os dados categóricos foram apresentados como porcentagem e comparados usando uma Pearson χ

2 ou teste exato de Fisher quando as contagens de células foram 5. O método de Kaplan-Meier foi utilizado para a análise de sobrevivência utilizando o teste de log-rank. A significância estatística foi definida como

P 0,05

.

Resultados

miR-497 foi regulada negativamente em tecidos de câncer de pâncreas

MIR-497 níveis em 10 amostras de cancro do pâncreas e tecidos tumorais adjacentes combinados foram detectados usando ISH. A percentagem média de células positivas em tecidos de cancro do pâncreas foi de 30,0% ± 35,4%, que foi significativamente menor do que em tecidos de tumor adjacentes (93.5.0% ± 2,4%) (

P = 0,000

). ( Figura 1)

MIR-497 níveis em tecidos pancreáticos foram detectadas utilizando ISH (200 ×). (A) Controlo negativo. (B) ISH para miR-497 no tecido do cancro do pâncreas. (C) A ISH para miR-497 no tecido tumoral adjacente. (D) A percentagem média de células positivas em tecidos de cancro do pâncreas foi de 30,0% ± 35,4%, que foi significativamente menor do que em tecidos de tumor adjacentes (93.5.0% ± 2,4%). Os dados foram apresentados como média ± SD.

miR-497 inibiu a proliferação

Depois de 48 horas de transfecção com miR-497 imita ou inibidor, miR-497 níveis foram significativamente regulada ou downregulated (Figura S1 A, B). Além disso, a regulação positiva de miR-497 inibiu a proliferação de células significativamente PDAC (Figura 2 A, B). Em contraste, o miR-497 downregulation promoveu a proliferação (Figura 2 C, D).

A proliferação foi analisada por CCK-8 de ensaio. (A, B) Transfecção com miR-497 imita suprimida PDAC células em proliferação e AsPC-1 BxPC-3 de células, respectivamente. (C, D) A transfecção com miR-497 inibidor promovido PDAC a proliferação das células. (*

P Art

0,05

)

miR-497 promoveu sensibilidade à gemcitabina

Após o tratamento gemcitabina, durante 48 horas, a. as taxas de inibição de células transfectadas com PDAC miR-497 imita foram significativamente maiores do que as células transfectadas com o controlo imita (Figura 3 A, B). As células transfectadas com o miR-497 inibidor eram mais resistentes ao tratamento com gemcitabina do que as células transfectadas com o controlo inibidor. (Figura 3 A, C).

células (A) AsPC-1 foram transfectadas durante 24 horas, e, em seguida, tratada com 100 nM de gemcitabina durante 48 horas. A sobre-regulação de miR-497 por transfecção de células imita re-sensibilizados a gemcitabina. Regulação negativa de miR-497 por transfecção de inibidor diminuiu a sensibilidade de células a gemcitabina. (B) As células BxPC-3 foram transfectadas durante 24 horas, e tratou-se com gemcitabina diluídas em série (1 nM, 10 nM, 30 nM, 100 nM). As células transfectadas com o miR-497 imita foram mais sensíveis a gemcitabina. (C) As células transfectadas com o miR-497 inibidor eram mais resistentes a gemcitabina. (*

P Art

0,05

).

miR-497 aumento da expressão de caspase-3 clivada e PARP activada por gemcitabina

a caspase-3 e poli (ADP-ribose) polimerase (PARP) é essencial para a apoptose. As células transfectadas foram tratadas com gemcitabina durante 48 horas, e, em seguida, os níveis de caspase-3 clivada e PARP foram detectadas por Western blotting. Descobrimos que a regulação positiva de miR-497 aumentou os níveis de caspase-3 clivada e PARP clivada (Figura 4 A, B, Figura S2). Por outro lado, a regulação negativa de miR-497 diminuiu os níveis de caspase-3 clivada e PARP clivada. (Figura 4 A, B, Figura S2).

As células foram transfectadas em placas de 6 poços. Ao fim de 24 horas após a transfecção, as células AsPC-1 e BxPC-3 foram tratadas com 10? M e 10 nM de gemcitabina, respectivamente. Após 48 horas adicionais, as células foram colhidas e a proteína total foi extraída. (A) A sobre-regulação de miR-497 por transfecção de imita em AsPC-1 células o aumento da expressão da caspase-3 clivada e PARP, enquanto que a inibição de miR-497 por transfecção de inibidor a diminuição da expressão da caspase-3 clivada e PARP, sem qualquer efeito sobre os níveis totais de caspase-3 e PARP. (B) Resultados Os mesmos foram observados em células BxPC-3.

miR-497 suprimiram a expressão da proteína IGF-1R por ligação ao 3′-UTR

De acordo com a previsão de bases de dados de acesso aberto (TargetScan, Metas miRBase, PicTarget, microRNA.org), IGF-1R foi considerado como um alvo candidato do miR-497. Para confirmar esta previsão, foi realizado um ensaio de repórter luciferase. Encontrámos actividade de luciferase foi significativamente diminuída após a co-transfecção de miR-497 imita e vectores que expressam sequência alvo do tipo selvagem em BxPC-3 de células, em comparação com o que, em células co-transfectadas com mímicas e vectores que expressam sequência alvo mutada (

P 0,05

) (Figura 5A). Estes resultados indicaram que o IGF-1R era um alvo direto de miR-497.

(A) atividade luciferase Relativa diminuiu significativamente após a co-transfecção de miR-497 imita e vetores que expressam sequência tipo de destino selvagem em BxPC- 3 células, em comparação com o que, em células co-transfectadas com vectores que expressam e imita sequência alvo mutado. (*

P Art

0,05

). (B) Os níveis de ARNm de IGF-1R foram detectados por qRT-PCR. GAPDH foi servido como um controlo interno. A transfecção com imita em células BxPC-3 não suprimiu a expressão de ARNm de IGF-1R. Os níveis de IGF-1R, p-AKT e AKT expressão (C) foram detectados. β-actina foi utilizado como um controlo interno. A sobre-regulação de miR-497 por transfecção de imita em ASPC-1cells inibiu significativamente os níveis de IGF-1R e p-AKT, enquanto que a regulação negativa de miR-497 por transfecção de inibidor aumentou os níveis de IGF-1R e p-AKT, sem qualquer efeito sobre os níveis de AKT total. (D) resultados de Same foram exibidos em células BxPC-3.

Para confirmar ainda mais, western blot foi realizada. Descobrimos que a regulação positiva de miR-497 suprimiram a expressão da proteína IGF-1R, sem qualquer alteração na expressão de ARNm de IGF-1R (Figura 5 B, C, D, Figura S3). Em contraste, a regulação negativa de miR-497 aumentou a expressão da proteína IGF-1R (Figura 5 C, D, Figura S3). Além disso, investigou-se a nível de p-AKT mediada pelo IGF-1R. Observou-se que o nível de p-AKT diminuiu significativamente após a sobre-regulação de miR-497. Pelo contrário, a inibição de miR-497 aumentou o nível de p-AKT (

P 0,05

). (Figura 5 C, D, Figura S3)

Os níveis de plasma de IGF-1R em pacientes com câncer de pâncreas

Os níveis plasmáticos de IGF-1R foram detectados por ELISA. Os níveis de plasma de IGF-1R em pacientes com cancro pancreático, pancreatite crónica, outros tumores pancreáticos, PNET e voluntários saudáveis ​​foram 0,823 ± 0,57 ng /ml, 0,472 ± 0,42 ng /ml, 0,562 ± 0,3 ng /ml, 0,460 ± 0,21 ng /ml, 1,004 ± 0,50 ng /ml, respectivamente. Os níveis em pacientes com câncer pancreático aumentou significativamente, em comparação com que, em pacientes com pancreatite crônica, outros tumores pancreáticos e PNET (

P = 0,006

,

P = 0,018

, e

P = 0,004, respectivamente.

). Não houve diferença significativa dos níveis de IGF-1R de plasma entre os pacientes com câncer de pâncreas e voluntários saudáveis ​​(

P = 0,095

). (Figura 6).

os níveis de plasma de IGF-1R foram detectadas por ELISA. Os níveis de plasma de IGF-1R em doentes com cancro pancreático foram comparáveis ​​aos que em voluntários saudáveis, mas maior do que em pacientes com pancreatite crónica, outros tumores pancreáticos e PNET. Outros tumores pancreáticos incluídos cystadenoma serosa, cystadenoma mucinoso, tumor sólido pseudopapilar e intra-ductal neoplasia mucinoso papilar. PNET, tumores neuroendócrinos do pâncreas.

O valor diagnóstico do plasma IGF-1R

O valor diagnóstico do plasma IGF-1R foi avaliada utilizando curva ROC. Nós mostramos que o plasma IGF-1R exibido um valor para distinguir o cancro do pâncreas de pancreatite crônica e PNET (AUC = 0,713, IC 95%: 0,564-0,862,

P = 0,008

; AUC = 0,711, IC 95%: 0,581-0,840,

P = 0,009

, respectivamente). Quando o valor de corte definido em 0,257 ng /ml, a sensibilidade e especificidade para distinguir o cancro do pâncreas de pancreatite crônica foram 95,2% e 47,3%. Quando o valor de corte definido em 0,699 ng /ml, a sensibilidade e especificidade para distinguir o cancro do pâncreas de PNET foram 47,6% e 89,5%. Plasma IGF-1R também pode ser usado para diferenciar o cancro do pâncreas de outros tumores pancreáticos (AUC = 0,634, IC 95%: 0.504-0.763,

P = 0,057

). Quando o valor de corte definido em 0,925 ng /ml, a sensibilidade e especificidade para diferenciar o cancro do pâncreas de tumores benignos pancreáticas foram 33,3% e 89,7%.

A correlação entre os níveis plasmáticos de IGF-1R e os parâmetros clínico e sobrevivência análise

os pacientes foram divididos em grupos de alta e baixa expressão usando o 75

percentil de níveis de IGF-1R de plasma. locais de tumor e estágio TNM foram associados com os níveis de IGF-1R de plasma (

P = 0,013

,

P = 0,01

, respectivamente. Tabela 1). O tempo médio de sobrevivência foi de 18 meses, e as de 1, 3 anos as taxas de sobrevivência foram de 64% e 23,1%, respectivamente. Os tempos médios de sobrevivência em grupos de expressão alta e baixa foram 11 e 18 meses, respectivamente. Não foi observada diferença significativa de tempo de sobrevida global entre os grupos de expressão altos e baixos (

P = 0,366

).

Discussão

Diminuição do miR-497 expressão tem sido demonstrada em cancros da mama, colo-rectal e os cancros cervicais [7], [8], [9]. No entanto, não existe qualquer relato sobre os níveis de expressão de miR-497 em tecidos de cancro do pâncreas. Regulação positiva de miR-497 pode suprimir câncer de células de proliferação, promover a apoptose, diminuir capacidades de migração e invasão e aumentar a quimio-sensibilidade [16], [17], [9]. No entanto, as funções e mecanismos de miR-497 em câncer de pâncreas permanecem desconhecidos. No presente estudo, mostramos miR-497 foi significativamente regulada negativamente em tecidos de cancro do pâncreas. Regulação positiva de miR-497 células inibiu a proliferação, apoptose aumentada e promovida sensibilidade à gemcitabina por downregulating diretamente a expressão da proteína IGF-1R.

Nosso estudo identificou o papel de miR-497 na regulação da malignidade do câncer de pâncreas. Os resultados suportada que-497 miR células cancerosas inibiu a proliferação, promoveu apoptose e aumento da quimio-sensibilidade, conforme relatado pela literatura [9], [16], [17].

Então, nós investigamos os mecanismos de miR-497 na regulação da progressão do cancro pancreático. Encontrámos IGF-1R foi um alvo directo de miR-497 por um ensaio de repórter de luciferase, que também foi relatado em cancros colo-rectal e os cancros cervicais [8], [9]. Também realizamos western blot para confirmação. Mostrámos que a regulação positiva de miR-497 diminuiu os níveis de proteína IGF-1R, sem qualquer alteração na expressão de ARNm. Regulação negativa de miR-497 aumentou os níveis de proteína IGF-1R. Adicionalmente, foi investigada a expressão de IGF-1R-mediada jusante molecular. Nós encontramos o nível de p-AKT diminuiu significativamente após a regulação positiva de miR-497. A inibição de miR-497 aumentou a expressão de p-AKT. Portanto, nós especulamos que o miR-497 atenuou a malignidade do câncer de pâncreas por parte suprimindo IGF-1R /AKT.

IGF-1R /AKT foi identificado envolver na regulação de vários processos biológicos de cânceres [18], [19]. AKT pode activar BAD por fosforilação em Ser136 [20] ou de activar o NF-kB por meio de regulação da cinase IkB (IKK) [21], assim, resulta em efeitos anti-apoptóticas. Akt também envolve em chemoresistance. inibição AKT2 ab-roga a activação induzida por gemcitabina de AKT2 e NF-kB, e aumenta induzida por gemcitabina PUMA (modulador de p53-regulada positivamente de apoptose) regulação positiva, resultando em quimiossensibilização de cancros pancreáticos à gemcitabina [22]. Consistente com estes estudos, os nossos dados indicam que a inibição de IGF-1R /AKT pode, em parte, explicar os efeitos de miR-497 em células de cancro do pâncreas. No entanto, miR-497 também pode atenuar o tumor maligno dos cancros regulando outros alvos, tais como TARBP2, DICER, BCL2, CCND1, CCNE1, Cdc25A, CCND3, CDK4. [23], [24], [25].

O aumento da expressão de IGF-1R foi encontrado em muitos tipos de câncer [26] e exibe valores de prognóstico [27]. Alta expressão de IGF-1R em tecidos humanos PDAC também foi relatada [11] e associados com maior grau tumoral e pobres sobrevivência [12]. No entanto, os níveis de plasma de IGF-1R em doentes com cancro pancreático não foram detectados. Nosso estudo mostrou que os níveis plasmáticos de IGF-1R em pacientes com câncer pancreático aumentou significativamente, em comparação com que, em pacientes com pancreatite crônica, outros tumores pancreáticos e PNET. Mas não houve diferença significativa de níveis de plasma de IGF-1R entre doentes com cancro pancreático e em voluntários saudáveis, o qual pode ser elucidados em parte por que o IGF-1R foi geralmente expressos em tecidos normais, tais como o fígado, endométrio e células neurais [28]. O valor do plasma IGF-1R no momento do diagnóstico de câncer pancreático foi avaliada no estudo atual. Havia um valor potencial para distinguir o cancro do pâncreas de pancreatite crônica, PNET e outros tumores pancreáticos. Mas a sensibilidade de diagnóstico ou especificidade não era perfeito, grandes detecções das amostras foram necessárias para identificar ainda mais o valor diagnóstico do IGF-1R plasma.

estágio TNM foi associada a níveis plasmáticos de IGF-1R em nosso estudo. Pacientes com tumores em estágio avançado tinham altos níveis de plasma IGF-1R. Plasma IGF-1R poderia ser um novo biomarcador para orientar estágio TNM de câncer pancreático. Surpreendentemente, alta expressão de plasma IGF-1R não foi um fator prognóstico adverso no presente estudo.

Conclusão

miR-497 foi significativamente regulada negativamente em tecidos de cancro do pâncreas. Regulação positiva de miR-497 suprimiu a malignidade do câncer de pâncreas e células PDAC sensibilizados re-a gemcitabina por downregulating diretamente a expressão da proteína IGF-1R. Os níveis plasmáticos de IGF-1R em pacientes com câncer pancreático aumentou, e exibidos valores potenciais para distinguir lesões pancreáticas. IGF-1R poderia ser também um novo biomarcador plasma para guiar estágio TNM de câncer pancreático.

Informações de Apoio

Figura S1.

O nível de expressão de miR-497 após a transfecção de imita ou inibidor. expressão de miR-497 foi detectado por qRT-PCR. U6 foi servido como um controlo interno. (A) BxPC-3 de células transfectadas com o miR-497 imita mostraram um aumento na expressão de miR-497. (B) As células transfectadas com o miR-497 inibidor mostrou uma diminuição na expressão de miR-497. Os dados foram apresentados como média ± SD. (*

P 0,05

)

doi:. 10.1371 /journal.pone.0092847.s001

(TIF)

Figura S2.

níveis de expressão relativa da caspase-3 clivada e PARP. Os dados foram apresentados como média ± SD. (A) Os níveis de expressão relativa de proteínas em células AsPC-1. (B) Os níveis de expressão relativa de proteínas em células BxPC-3. (*

P 0,05

)

doi:. 10.1371 /journal.pone.0092847.s002

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Figura S3.

níveis de expressão relativa de IGF-1R e p-AKT. Os níveis de expressão relativos foram apresentados como média ± DP. (A) Os níveis relativos de IGF-1R e p-AKT em células AsPC-1. (B) Os níveis relativos de proteínas em células BxPC-3. (*

P 0,05

)

doi:. 10.1371 /journal.pone.0092847.s003

(TIF)