Sumário

Fundo

microARNs (miARNs) desempenham um papel fundamental na tumorigénese, quer como um supressor de tumor, ou como um miARN oncogénica, dependendo de diferentes tipos de tumores. Até à data, os cientistas obtiveram uma quantidade substancial de conhecimentos referente à miRNAs em câncer pancreático. No entanto, a expressão e função de miR-371-5p em câncer pancreático não foi claramente elucidada. O objetivo deste estudo foi investigar o papel de miR-371-5p em câncer de pâncreas e sua associação com a sobrevida de pacientes com câncer pancreático

Métodos

A expressão de miR-371. -5p foi examinada em adenocarcinoma pancreático conduta (PDAC) e seus tecidos normais adjacentes (pancreáticas ANPT) ou em linhas celulares de cancro do pâncreas por qRT-PCR. Determinou-se a associação da expressão de miR-371-5p com sobrevida global. A proliferação e apoptose de SW-1990 e células Panc-1, transfectadas com imita miR-371-5p ou inibidor, foram avaliados utilizando o ensaio MTT e citometria de fluxo, respectivamente. A tumorigenicidade foi avaliada através de experimentos ratos de xenotransplante. interações promotor miR-371-5p foram analisados ​​por ensaios de imunoprecipitação de cromatina (chip). a expressão da proteína foi analisada por Western blot.

Resultados

O nível de miR-371-5p expressão foi dramaticamente regulada nos tecidos PDAC clínicos em comparação com ANPT. Pacientes com alta expressão de miR-371-5p tiveram uma sobrevida significativamente menor do que aqueles com baixa expressão de miR-371-5p. A in vitro e em ensaios in vivo mostraram que a sobre-expressão de miR-371-5p resultou na proliferação de células e aumento do crescimento do tumor, o que foi associado com um inibidor de crescimento (ING1) regulação negativa. Curiosamente, também descobrimos que ENTR 1, por sua vez, inibe a expressão de miR-371-5p na região promotora.

Conclusões

nosso estudo demonstra uma novela ENTR 1-miR-371-5p regulamentar circuito fechado de realimentação, o qual pode ter um papel crítico na PDAC. Assim miR-371-5p pode vir a ser um novo fator prognóstico e alvo terapêutico para o tratamento do câncer de pâncreas

Citation:. Ele D, Miao H, Xu Y, Xiong L, Wang Y, Xiang H, et al . (2014) Mir-371-5p Facilita o cancro do pâncreas Proliferação celular e diminui a sobrevida do paciente. PLoS ONE 9 (11): e112930. doi: 10.1371 /journal.pone.0112930

editor: Xin-Yuan Guan, The University of Hong Kong, China

Recebido: 10 de julho de 2014; Aceito: 16 de outubro de 2014; Publicação: 20 de novembro de 2014

Direitos de autor: © 2014 He et al. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Licença Creative Commons Attribution, que permite uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o autor original ea fonte sejam creditados

Data Availability:. O autores confirmam que todos os dados subjacentes às conclusões estão totalmente disponíveis sem restrições. Todos os dados relevantes estão dentro do papel

Financiamento:. Este trabalho foi apoiado por subsídio da Inovação de Ciência e TechnologyCommission de Shenzhen município (No. JCYJ20140414103937769). Os financiadores não tiveram nenhum papel no desenho do estudo, datacollection e análise, decisão de publicar ou preparação do manuscrito

CONFLITO DE INTERESSES:.. Os autores declaram que não há interesses concorrentes existem

Introdução

PDAC é um fenótipo altamente maligno caracterizado pela rápida progressão, metástase precoce e uma resposta limitada à radioterapia e quimioterapia. Apesar de mais de 10 anos de regimes terapêuticos aprovados pela FDA e grandes melhorias nos cuidados médicos, nenhum efeito significativo na sobrevida dos pacientes PDAC foi observada [1]. Agora é a quarta principal causa de mortes relacionadas ao câncer em os EUA com uma taxa de sobrevida em 5 anos 5% ao ano [2]. Portanto, há uma necessidade urgente de identificar biomarcadores que irá promover o diagnóstico precoce e permitem estratégias de tratamento personalizado para os pacientes com alto risco de PDAC.

O desenvolvimento e progressão da PDAC é um processo complexo, envolvendo a desregulamentação dos múltiplos os genes que são essenciais para a célula processos biológicos. Os fatores de transcrição (TFS) e miRNAs são reguladores importantes para a expressão do gene [3]. Nos últimos 10 anos, os miRNAs são particularmente importantes em quase todos os estudos de desenvolvimento de tumor, pois eles podem ser alvos de lesões genômicas, controlados por sinais de tumor clássicos, e eles se apresentam como uma classe de oncogenes ou supressores de tumor [4]. Recentemente, miRNAs têm sido sugeridos para ser intimamente associada com PDAC tumorigênese [5].

miRNAs são pequenos (21-24 nt) não-codificante moléculas de RNA que regulam a expressão gênica pela ligação sequências vagamente complementares na 3 ‘ região -untranslated de mRNAs alvo para reprimir a tradução ou induzir mRNA clivagem [6]. A descoberta de miRNAs tem lançar novas perspectivas no que respeita à regulação da proliferação celular, diferenciação, apoptose e senescência, e também tem contribuído para a gestão dos doentes, incluindo diagnóstico e tratamento [7].

Embora estudos anteriores já esclareceu os papéis de muitos miRNAs em câncer pancreático [8], não há estudos têm abordado o papel de miR-371-5p. Estudos recentes demonstraram que miR-371-5p foi significativamente elevado em pacientes com câncer gástrico (CG) e carcinoma hepatocelular regulada proliferação celular (HCC) acelerando a transição G1 /S [9], [10]. Especialmente, uma validação indicaram que o soro miR-371-5p, como um novo biomarcador, teve um forte potencial em discriminar pacientes GC de controles saudáveis ​​[9]. Por conseguinte, a hipótese de que o miR-371-5p pode também ser um novo mecanismo que contribui para um risco aumentado PDAC por perturbar a progressão do ciclo celular por meio de direccionamento de genes relacionados com o ciclo celular. Para abordar esta questão, foram comparados os perfis de expressão de miR-371-5p entre tecidos PDAC e ANPT. Nós aqui mostram que a expressão de miR-371-5p foi significativamente regulada positivamente em tecidos em comparação com PDAC ANPT, o que resultou na proliferação de células e aumento do crescimento do tumor. Assim, miR-371-5p pode vir a ser um novo fator prognóstico e alvo terapêutico para o tratamento do câncer pancreático.

Materiais e Métodos

cultura celular

As linhas celulares PDAC SW-1990 e Panc-1 foram obtidos a partir do Centro chinês para Type Culture Collection (Xangai, China). As células foram mantidas em meio RPMI-1640 suplementado com 10% de soro fetal bovino e antibióticos (100 U /ml de penicilina e 100 ug /ml de sulfato de estreptomicina). As células foram cultivadas numa incubadora humidificada a 37 ° C, suplementada com 5% de CO2.

proliferação celular Ensaio

MTT [brometo de 3- (4, 5-dimetiltiazol-2-il) -2 , 5-diphenyltetrazoliumbr-omide] – ensaio baseado foi realizada para avaliar o efeito de miR-371-5p sobre a proliferação celular PDAC. As células foram semeadas em placas de 96 poços (5000 células /poço em 200 ul de meio) e incubou-se durante 24 horas a 37 ° C, 5% de CO

2. PDAC células foram transfectadas com o miR-NC, miR-371-5p, miR-controlo, anti-miR-371-5p, NC-siRNA ou ING1 siRNA usando Lipofectamine 2000 Reagent (Life Technologies) durante 1, 2, 3 e 4 dias, respectivamente, de acordo com as instruções dos fabricantes. As células cultivadas com meio completo foram utilizados como controle em branco. No final da cultura, 20 uL de 5 mg /ml de MTT (Sigma, EUA) foi adicionada por poço, e as células foram incubadas durante mais 4 h a 37 ° C. Os sobrenadantes foram removidos e os cristais de formazan foram dissolvidos em 150 ul de dimetilsulf óxido (Sigma, EUA). Finalmente, a densidade óptica foi determinada a 490 nm utilizando o sistema de ensaio de multi-microplacas (Polarstar Optima, Alemanha). Em cada ensaio, cinco poços paralelos foram realizadas, e os resultados foram recolhidos como a média de mais de três experiências independentes. Os lisados ​​foram colhidos para análise de Western blot.

ciclo celular análise

Para analisar ciclo celular, teor de ADN por duplicado foi analisada utilizando o software FACSort Cellquect (BD Biosciences, EUA). Células PDAC foram colocados em 6 bem-placas durante a noite e transfectadas com miR-NC, miR-371-5p, miR-con, anti-miR-371-5p, NC-siRNA, ou ENTR 1-siRNA por 48 horas, respectivamente.

no final da cultura, as células foram fixadas em etanol a 75% arrefecido com gelo durante a noite a 4 ° C. As células fixadas foram coradas com 50 ug /mL de iodeto de propídio (PI) contendo 50 ug /ml de RNase A (isenta de ADNase) durante 15 min à temperatura ambiente, no escuro e analisadas por células activadas por fluorescência (Becton Dickinson, EUA). As células foram excitados a 488 nm e a emissão foi recolhida através de um filtro de 630 nm. No total, 20.000 células foram recolhidas a partir de cada amostra. A distribuição do ciclo celular foi avaliada calculando a percentagem de células em G0 /G1, S e G2 /M fases. Em cada experiência independente, três poços paralelos foram feitas, e os procedimentos foram realizados em triplicado. Os dados obtidos foram apresentados como média ± DP.

ensaios de repórter de luciferase

Resumidamente, os fragmentos da região 3 ‘não traduzida (3’-UTR) de ARNm ING1 contendo a putativa (WT) foram amplificado por PCR a partir de ADN genómico, e o produto de PCR foi subclonado num vector pGL3-controlo (Promega, EUA) imediatamente a jusante do gene da luciferase. Para construir pGL3-ING1 mutante (MU), o kit de mutagénese dirigida ao local QuickChange (Stratagene) foi utilizado para induzir a seis mutações pontuais na região UTR de WT-pGL3-ING1. O DNA de plasmídeo foi sequenciado por autenticidade.

Para o ensaio de repórter de luciferase, as células foram cotransfectadas com 300 ng de construções pGL3-ENTR 1-Mut pGL3-ENTR 1-WT ou e pcDNA3-miR-371-5p ou controle negativo usando Lipofectamine 2000 (Invitrogen) de acordo com o protocolo do fabricante. Cada amostra foi co-transfectadas com 50 ng de pRL-TK plasmídeo expressando a luciferase de Renilla (Promega, EUA). As células foram colhidas 48 h após a transfecção e analisadas utilizando o Repórter Dual-Luciferase Assay System (Promega, EUA). medições relativas de luciferase foram feitas 48 horas após a transfecção usando o duplo de Luciferase Reporter Assay System (Promega, EUA) utilizando um contador de luminescência. As transfecções foram efectuadas em duplicado e repetidos pelo menos 3 vezes em experiências independentes. Mir-371-5p inibidor, siING1 e seus controles negativos (NC) foram adquiridos de Panagene Inc (coreana) e Santa Cruz (EUA), respectivamente. As sequências foram as seguintes: inibidor de miR-371-5p: 5′-TTTTAACATTGCACT-3 ‘. Ad-ENTR 1 adenovírus (Cat #: 1601) e seu controle Ad-GFP adenovírus (Cat #: 1700) foram adquiridas da Vector Biolabs (EUA)

RT-PCR quantitativo

O RNA total. foi isolado utilizando o reagente Trizol (Invitrogen, EUA). 2 ^ g de RNAs totais foram reversamente transcrito utilizando os iniciadores reversos específicos miR-371-5p transcrição (Ribobio, China) utilizando poli-A polimerase baseada Síntese da primeira cadeia kit (Takara Bio, Japão) seguindo o protocolo do fabricante, e a expressão relativa da miR-371-5p foi determinada utilizando SYBR Premix Ex Taq (Takara, China). U6 snRNA foi utilizado para normalização. O método delta-Ct foi utilizado para avaliar as análises de dados em tempo real de PCR. Na semi-quantitativo de RT-PCR, os produtos de PCR finais após determinado número de ciclos foram sujeitas a electroforese em géis de agarose a 2%, seguido por coloração com brometo de etídio, e fotografados num transiluminador UV. Primers para miR-371-5p: iniciador de RT, 5′-GTCGTATCCAGTGCAGGGTCCGAGGTATTCGCACTGGATACGACAGTGCC-3 ‘; Adiante, 5’-GTCGTATCCAGTGCAGCCG-CCACTCAAACTGTGGGG-3 ‘. Primers para U6 snRNA: iniciador de RT, 5’-GGGTCCGAGGTGCACTGGATACGACAAAAT-ATGG-3 ‘; Adiante, 5’-TGCGGGTGCTCGCTTCGGCAGC-3 ‘.

ensaio de imunoprecipitação da cromatina (ChIP)

ENTR 1 de ligação ao promotor de miR-371-5p foi testada usando análise de chip. ensaio chip foi realizada utilizando o kit EZ-chip da Millipore (Millipore, EUA) de acordo com as instruções do fabricante. Resumidamente, cerca de 3 × 10

6 Panc-1, infectadas com ambos os adenovírus Ad-GFP Ad-GFP-ING1 ou foram reticulados utilizando formaldeído a 1% (Bio-Rad, EUA) durante 15 min a 37 ° C. As células foram colhidas após têmpera com 0,125 M de glicina e lisadas em tampão de ChIP de lise (NaCl 150 mM, 1% de Triton X-100, Tris 50 mM (pH 8,0), 0,1% de desoxicolato, 1 mM de EDTA, 1 mM de PMSF, 1 ug /ml de pepstatina, 1 ng /ml de aprotinina e 1 ug /mL de leupeptina). Os extractos foram sonicados seis vezes em 9 s cada um e os lisados ​​foram spinned por centrifugação a 14000 rpm durante 20 min a 4 ° C. Dessa amostra, 150 ul foi utilizado como entrada. Os sobrenadantes foram immunoprecipiated quer com anti-ING1 ou com IgG de ratinho (controlo negativo) a 4 ° C durante 4 h, seguido de proteína G-Sepharose (Sigma, EUA) durante 2 h a 4 ° C. Os imunoprecipitados foram sequencialmente lavados com 1 ml de tampão de lise ChIP duas vezes, tampão de lise chip com 500 mM de NaCl, duas vezes e com LiCl /detergente (Tris-HCl a 10, pH 8,0, LiCl 250 mM, 0,5% de NP-40, 0,5% desoxicolato de sódio, EDTA 1 mM) duas vezes e finalmente com tampão TE (Tris 10 mM e EDTA 1 mM, pH 8,0). As esferas foram eluídas utilizando SDS a 1% e uma solução de bicarbonato de sódio 0,1 M. A entrada e as amostras de eluente foram reversa-reticulado usando NaCl durante 5 h a 65 ° C. O ADN das amostras foi isolado por extracção com fenol-clorofórmio, seguido de precipitação com etanol. A ligação promotor foi testado por PCR utilizando iniciadores que abrangem as regiões a montante de miR-371-5p iniciar locais, sequências de iniciadores: Chip-ING1, F: 5′-AATGTTCACTGCCGCACTGT-3 ‘; R: 5’-ACACCTATAATCCCTGC- TAC-3 ‘; ChIP-NEG-F: 5’-ACGGCCAACATGCTCAGG-3 ‘; R: 5’- TGTTTGCAACTGCTGCGTTAG-3 ‘

Western blot

As células foram lisadas com 1% de tampão de lise RIPA (Tris-HCl a 50, o pH Cloreto de sódio 8.0,150 mM, 1. % de NP-40, 0,5% de desoxicolato de sódio, 0,1% de sulfato de dodecilo de sódio, 2 mM de EDTA) contendo 1 × cocktail inibidor de protease (Roche) 48 h após a transfecção. Os sobrenadantes foram recolhidos, e a concentração de proteína foi determinada usando o BCA Assay Kit (Pierce). As amostras de proteína foram separadas em 10% SDS-PAGE e depois transferidos para uma membrana de PVDF. A membrana foi bloqueada com leite não gordo a 5%, seguido de uma incubação durante a noite a 4 ° C com um anticorpo primário de coelho indicado. A membrana foi lavada três vezes em TBST e, em seguida, incubadas com um anticorpo secundário. Por último, o anticorpo ligado foi detectado por quimioluminescência com o Reagente de Detecção de ECL (Pierce). Os dados foram normalizados para GAPDH ou β-actina.

In vivo

modelo de xenoenxerto de câncer pancreático

Panc-1 células de PDAC moderadamente diferenciado foram estavelmente transfectadas com miR-371 -5p ou plasmídeo de controlo miR-NC. As células transfectadas foram colhidas, suspensas em 200 ul de PBS (1 × 10

7 células), e foram injectados por via subcutânea no macho de 4 semanas de idade BALB /c ratinhos nus (

N

= 10 /grupo) . Os ratinhos foram mantidos num ambiente específico isento de patógeno durante 5 semanas e então sacrificados. O volume do tumor

V

foi calculada utilizando o seu comprimento

L

e largura

W

, de acordo com a equação

V

= 0,4

LW

2. O uso de ratos pelados cumpriu com o Guia para o Cuidado e Uso de Animais de Laboratório e o estudo foi aprovado pelo Animal Care e Use Committee da Universidade Southern Medical.

Pacientes e tecidos tumorais

Um total de 60 tecidos humanos cancro do pâncreas (PC) e tecidos normais adjacentes combinados pancreáticas (NP) foram obtidos durante a cirurgia em Baoan Hospital (Shenzhen, China) entre janeiro de 2008 e dezembro de 2010. o diagnóstico foi baseado na evidência patológica. Além disso, um adicional de 15 pares de PDAC e respectivas amostras de controlo foram recolhidas a partir de doentes durante ressecções cirúrgicas e armazenado em azoto líquido. Todos os 75 pacientes forneceram consentimento informado para o uso de seus tecidos e o protocolo do estudo foi aprovado pelo Comitê da Universidade Southern Medical Ethics o

A análise estatística

As associações de miR-371-. 5p expressão com as características patológicas clínicas foram analisadas utilizando os testes qui-quadrado ou Mann-Whitney. A curva de sobrevida foi construído utilizando o método de Kaplan-Meier e comparadas pelo teste de log-rank. Os grupos foram comparados usando um Student

t

-teste. análise de correlação foi realizada utilizando análise de correlação de Spearman. Todos os valores de probabilidade foram analisados ​​utilizando um teste de duas caudas, e significância estatística foi concluído em

* P 0,05,

** P 0,01,

*** P 0,001; # Representa sem significância estatística. As análises foram realizadas usando SPSS software (versão 17.0) (SPSS Inc., EUA). Os dados foram expressos como a média ± desvio padrão (SD).

Resultados

regulação positiva de miR-371-5p em tecidos de câncer de pâncreas é associada com a sobrevivência

Para determinar o os níveis de expressão de miR-371-5p em doentes com cancro pancreático, o miR-371-5p foi detectada em todas as 15 pares de tecidos de cancro do pâncreas e dos seus tecidos pancreáticos não cancerosos correspondentes usando um método de qRT-PCR. Como mostrado na Fig.1A, tecidos PC mostraram significativamente maior expressão de miR-371-5p em comparação com a dos tecidos NP (

P

0,05). Além disso, a análise de sobrevivência Kapan-Meier revelou que os pacientes com uma expressão positiva miR-371-5p (Fig.1b) tiveram um prognóstico significativamente pior do que aqueles com uma expressão negativa (Figura 1C). A análise de regressão multivariada de Cox indicaram que a expressão de miR-371-5p (perigos ratio [HR] = 2.748, 95% intervalo de confiança [CI] = 1,211-5,914, P = 0,03), era fatores prognósticos independentes para a sobrevida global.

(a) nível de expressão média de miR-371-5p em amostras PDAC humanos (

n

= 15) e normais tecidos pancreáticos (

n

= 15). miARN abundância foi avaliada por qRT-PCR e normalizadas para ARN U6. Os valores são apresentados como a média ± S.D. (B e C) miR-371-5p níveis de expressão e sobrevida global após ressecção de câncer de pâncreas com o miR-371-5p -negative contra grupos -positivas miR-371-5p. O miR-371-5p – grupo positivo tiveram sobrevida significativamente menor do que o miR-371-5p -. Grupo negativo (n = 30 /grupo,

P

= 0,021)

mir-371-5p promoveu a proliferação celular tanto

in vitro

e

in vivo

Para explorar o efeito de miR-371-5p sobre o crescimento de células de câncer pancreático, o PDAC as linhas celulares com diferentes graus SW-1990 e Panc-1 foram transientemente transfectadas com um mímico ou inibidor (anti-miR-371-5p) miR-317-5p e seus respectivos SAE. A análise de qRT-PCR mostrou que imita o miR-371-5p causou um aumento de 14,42 e 6,47 vezes na expressão de miR-371-5p em PANC-1 e células SW-1990, respectivamente (Fig.2a). Enquanto isso, o anti-miR-371-5p diminuiu a expressão de miR-371-5p de 3,14 e 3,28 dobras em PANC-1 e células SW-1990, respectivamente, em comparação com as linhas celulares de controlo (Fig.2B). O ensaio de proliferação MTT foi realizado em SW-1990, Panc-1 e células que foram transf ectadas transitoriamente com um mímico de miR-371-5p ou inibidor. Os resultados mostraram que o miR–mimics 371-5p promoveu o crescimento de células de tumor, enquanto que o crescimento de células tumorais inibidas anti-miR-371-5p (P 0,01, Fig.2C e D) Para investigar o mecanismo pelo qual o anti-miR- 371-5 inibe a proliferação celular, analisou-se a distribuição do ciclo celular das células Panc-1 e SW-1990, que foram transfectadas com anti-miR-371-5p e o controlo. Uma proporção maior de células transfectadas com o anti-miR-371-5p acumulado na fase G1, enquanto que a população fase S diminuiu (Fig.2E). No entanto, um resultado contrário foi observado em células transfectadas com o miR-371-5p (dados não mostrados). Estes resultados sugerem que a inibição anti-proliferativa de miR-371-5p era parcialmente devido a uma paragem na fase G1 das duas linhas de células do cancro do pâncreas.

(A e B) O nível de expressão de miR-371 -5p foi testada durante 48 h em células de cancro do pâncreas transfectadas com imita o miR-371-5p, anti-miR-371-5p e respectivo controlo (NC, 40 nM) por qRT-PCR. (C e D) A proliferação de linhas de células transf ectadas transitoriamente com PDAC imita o miR-371-5p, miR-371-5p inibidor ou controlo foi analisada por ensaio de proliferação com MTT. (E) Anti-miR-371-5p aumenta a proporção de células em G1 como estimada por meio de citometria de fluxo (painel esquerdo, **

P

0,01, n = 4). E histographs representante do ciclo celular (anti-miR-NC vs anti-miR-371-5p) são apresentados (painel da direita). (F) os ratinhos nus foram inoculados subcutaneamente com células Panc-1 transfectadas com o miR-371-5p plasmídeo ou plasmídeo de controlo miR-NC, nos seus flancos. A imagem é representativo dos tumores formados em 10 ratinhos. (G) as curvas de crescimento dos volumes tumorais. O gráfico é representativo do crescimento do tumor, 5 semanas após a inoculação. O volume do tumor foi calculada e todos os dados são apresentados como a média ± S.D. (

n

= 10).

Para determinar ainda se miR-371-5p estava envolvido na tumorigénese, uma linha celular de linha e controle de miR-371-5p celular -overexpression estável foram injectados subcutaneamente em ratinhos nus, e, por sua vez, a actividade de crescimento do tumor foi medido. Quando os tumores foram colhidos, o volume médio dos tumores derivados do grupo miR-371-5p foi maior em comparação com o grupo de controlo (Fig.2F e G,

P

0,05). Estes resultados foram consistentes com os efeitos da sobre-expressão de miR-371-5p in vitro e fortemente sugerido que o miR-371-5p poderia promover a proliferação de células PDAC.

ING1 é um alvo directo de miR-371-5p e envolvido em miR-371-5p induzir promoção da PDAC proliferação das células

para explorar o potencial alvo através do qual o miR-371-5p promove a proliferação de células de câncer de pâncreas, aproveitamos bioinformática para prever o putativo alvos de miR-371-5p. Ambos os sistemas de digitalização e Miranda do alvo para ENTR 1, um supressor de tumor chave, a ser um alvo putativa de miR-371-5p. Para verificar se o miR-371-5p directamente alvo de ARNm de miR-371-5p PDAC em tumores e linhas celulares, in vitro e análise in silico foram conduzidos. Em primeiro lugar, anti-miR-371-5p ou controlo foi transfectado em SW-1990 Panc-1 e as células, e verificou-se que inibiu a expressão de miR-371-5p aumentou os níveis de proteína ING1 em ambas as linhas (Fig. 3a). Em seguida, o miR-371-5p mímica ou controlo foi transfectado nas linhas celulares 2 acima. Descobrimos que a expressão forçada de miR-371-5p diminuiu os níveis de proteína ING1 em ambas as linhas celulares de forma consistente (fig. 3A). Estes resultados indicaram que o miR-371-5p pode promover a proliferação de células PDAC com a diminuição da expressão ING1 in vitro.

(A) na expressão ING1 SW-1990 e células Panc-1 após a transfecção com anti-miR imita -371-5p, ou miR-371-5p, ou controlo detectado por western blotting. (B-I) ENTR 1 foi detectada por qRTPCR em 50 de câncer pancreático (PC) tecidos e foi igualado os tecidos pancreáticos não cancerosas adjacentes (NP). A abundância ENTR 1 foi normalizado contra a GAPDH. (B-II) A relação entre ENTR 1 e expressão de miR-371-5p foi explorada por correlação de Spearman em 50 tecidos PDAC. expressão ENTR 1 foi negativamente correlacionada com miR-371-5p em 50 tecidos tumorais PDAC. (C) Previsto emparelhamento consequente da região de destino 3′-UTR de ENTR 1 (de tipo selvagem ou mutante) e a sequência madura miR-371-5p. A actividade da luciferase na presença de tanto do tipo selvagem ING1 3′-UTR ou mutante e miR-371-5p foi comparado com o controlo. (D) mancha de Western foi realizada para analisar a expressão ING1 em Si ING1 transfectadas células Panc-1. β-actina foi utilizado como um controlo interno quantitativa. (E) Efeito do siING1 sobre a proliferação celular foi medida por ensaio de MTS. (F) Panc-1 foram transfectadas com NC, miR-371-5p inibidor ou inibidor de miR-371-5p e siING1, e, em seguida, ensaio MTS foi realizado.

Para confirmar ainda mais a relação regulatória entre o miR-371-5p e ING1, examinámos a expressão de ING1 em PDAC amostras (PC) e os seus correspondentes tecidos normais (NP). Usando qRT-PCR, verificou-se que o nível médio de expressão ING1 foi significativamente menor em tecidos PC quando comparada com a dos tecidos NP (Fig. 3B-I). Observou-se uma correlação significativa inversa entre ENTR 1 e expressões miR-371-5p em tecidos de câncer de pâncreas (correlação de Spearman, r = -0,4802) e tecidos não cancerosos adjacentes (r = -0,4103, dados não mostrados) (Fig. 3B-II).

para avaliar a capacidade de se ligar à 3’UTR de ING1 miR-371-5p, foi realizado um ensaio de repórter de luciferase e observaram um decréscimo significativo na actividade da luciferase na presença de miR-371-5p – ING1 em células SW-1990, em comparação com os controlos (Fig. 3C). Para validar se ENTR 1 era um alvo direto de miR-371-5p, nós mutado a sites na 3’UTR de ENTR 1 vinculativo miR-371-5p e observou a perda de repressão (Fig. 3C). Tomados em conjunto, os dados sugerem que ING1 era um alvo directo de miR-371-5p.

Para elucidar se o efeito de promoção do crescimento de miR-371-5p foi mediada pela repressão da ING1 em células PDAC, o foi examinada efeito de ING1 sobre o crescimento celular. Primeiro, as células Panc-1 foram transfectadas com siRNA contra ENTR 1 ou o seu controle, e depois examinamos o crescimento celular por MTT ensaio (Fig. 3D). MTT resultados do ensaio mostraram que o silenciamento do gene de ING1 promoveu a proliferação de células de Panc-1 (células Fig.3E). Além disso, o efeito inibidor do inibidor de miR-371-5p sobre o crescimento de células foi invertida quando a expressão ING1 foi knockdown (Fig.3F). Tomados em conjunto, estes resultados indicaram que ING1 é um alvo funcionalmente importante do miR-371-5p que está envolvida na proliferação de células PDAC.

ING1b regula a expressão de miR-371-5p

A família ING do tipo II supressores de tumor servir de ambos os leitores ‘epigenéticas e alvo transferase histona acetil (HAT) e histona deacetilase (HDAC) “escritores” do código de histonas epigenética [11]. A proteína ING1 também tem sido implicada na regulação dos níveis de miARN [12]. Para identificar se ING1 regula a expressão de miR-371-5p, células Panc-1 foram infectadas com adenovírus expressando GFP sozinho ou com adenovírus que expressa GFP e ambos ING1. Mir-371-5p foi confirmado para diminuir de forma significativa e reprodutível em resposta a ENTR 1 superexpressão (4A). Além disso, como se mostra na Fig.4B, suberoilanilida do ácido hidroxâmico (SAHA), uma desacetilase de histona (HDAC), aumento da expressão de miR-371-5p significativamente em células Panc-1, o que é consistente com a regulação epigenética por ING1 como parte de HDAC1 e HDAC2 complexos. No entanto, SAHA não alterou a expressão ENTR 1. análise ChIP de ING1 mostrou que ING1 obrigado a área do promotor de miR-371-5p (Fig.4C), indicando que ING1 regula directamente a expressão de miR-371-5p. Assim, regula ING1 epigeneticamente expressão de miR-371-5p em PDAC.

(A) A expressão de miR-371-5p em células Panc-1 em resposta a ING1 sobre-expressão de 48 horas, foi determinada por Real quantitativa os ensaios de PCR. -tempo (painel superior Barras representam a média ± DP (**

P

.. 0,01, n = 5) (painel inferior) de Western blot foi realizada para analisar a expressão ING1 (B) miR nível -371-5p foi determinada utilizando em tempo real de RT-PCR em células Panc-1 em resposta ao tratamento com o ácido hidroxâmico suberoilanilida do inibidor de HDAC (SAHA). as barras representam a média ± DP (painel superior, *

P

0,05, n = 5) (painel inferior) de Western blot foi realizada para analisar a expressão ING1 (C) as células infectadas com adenovírus de controlo de GFP ou com o mesmo vírus ainda que codifica ING1 foram colhidas 24 h mais tarde e preparada para o chip.. análise utilizando anticorpos de controlo ou ENTR 1. PCR de produtos de imunoprecipitação mostraram que ENTR 1 ligado à região a montante de miR-371-5p.

Discussão

Um completo entendimento dos mecanismos moleculares subjacentes iniciação do tumor pancreático e progressão é importante para novas abordagens prognósticos e terapêuticos que visam melhorar os resultados dos pacientes com câncer. Ao longo dos últimos anos, miRNAs estão emergindo como uma nova classe de reguladores de genes envolvidos em tumores diferentes [13]. Aqui, nós proporcionam a primeira evidência de que o miR-371-5p desempenha um papel fundamental na tumorigénese pancreático. É freqüentemente regulada no PDAC. Consistentemente, a sobre-expressão de miR-371-5p é marcadamente associada com a sobrevivência dos pacientes negativos, sugerindo que é um factor de mau prognóstico. A relação positiva dos níveis de miR-371-5p com a proliferação apoia a noção de que ele age como um onco-miRNA.

As características observadas em pacientes com PDAC são recapituladas no mouse modelos de xenotransplante. células de miR-371-5p-sobre-expressam desenvolver tumores grandes, que são revertidos por injecções de um inibidor específico contra ela. Um comportamento oposto é observado com células que expressam baixos miR-371-5p e injecção de RNA mímico correspondente. Até à data, o miR-371-5p tem sido mostrado para ser envolvido apenas em carcinomas hepatocelulares, que indica que a sua sobre-expressão está associado com os tumores mais agressivos e um resultado mais pobre [14], de acordo com os dados obtidos em PDAC. No entanto, a contribuição de miR-371-5p a este processo precisa de mais investigações.

A nossa compreensão das funções biológicas de miRNA baseia-se na identificação de genes-alvo relevantes. No entanto, a previsão de alvos de miRNA ainda é uma área de pesquisa desafiador. A maioria da coincidência de sequência de miARN alvo baseia-se na complementaridade imperfeita da miARN com o extremo 3 ‘UTR do ARNm alvo. A exigência de uma complementaridade de apenas sete ou oito nucleótidos podem resultar em centenas de possíveis alvos [15]. Até agora, muito poucos genes alvo de-miR 371-5p foram confirmados em diferentes sistemas biológicos.

Aqui, nós validamos ENTR 1 como um alvo funcional direto de miR-371-5p no PDAC, a adição de informações previamente tipos celulares reportados [16]. A família de ING tipo II supressores tumorais contribui para o crescimento de vários tumores [17]. Esta família está bem conservado e inclui cinco genes. Entre eles,

ENTR 1

é o membro melhor caracterizado e codifica quatro isoformas da proteína [18]. A família ING de supressores tumorais atua como leitores e escritores do código epigenético histona, afetando o reparo do DNA, a remodelação da cromatina, a senescência celular, regulação do ciclo celular e apoptose [18]. Superexpressão de ENTR 1 causou a parada do ciclo celular na fase G1, com a consequente apoptose, enquanto a supressão da sua expressão aumentada a formação de colónias foco e crescimento

in vitro formação

e tumor

in vivo

[19]. No entanto, os mecanismos moleculares pelos quais detalhados ING1 actua como um supressor de tumor permanecem incompletamente definidos.

ING1 regula a expressão do gene através de regulação da acetilação de histonas e metilação [20]. ING1 é o alvo principal do inibidor de HDAC a SAHA, e parece regular principalmente compactação da cromatina e, subsequentemente, a expressão de subconjuntos de genes por meio de mecanismos epigenética. Além disso, muitos miARNs têm sido relatados para ser regulada por mecanismos epigenética [21]. Por isso, perguntou se miR-371-5p é regulada por ENTR 1. No estudo actual, mostramos que a expressão de miR-371-5p é regulada epigeneticamente por ING1 e que o miR-371-5p inverte uma proporção significativa dos efeitos inibitórios de ING1 sobre a proliferação celular. Além disso, as alterações na expressão ING1 afectar a proliferação celular e a apoptose, reproduzindo num modo inverso os efeitos devidos a miR-371-5p, como ainda demonstrada em amostras de tumor. As variações recíprocas e inversas de níveis ENTR 1 seguintes modulação miR-371-5p demonstram claramente que eles estão mecanicamente ligados. A inter-relação estreita entre ING1 e miR-371-5p é adicionalmente comprovada pelo seu silenciamento concomitante: knockdown ING1 inverte completamente os efeitos sobre a proliferação celular e da apoptose devido à inibição de miR-371-5p, identificando-o como um efector a jusante principal deste miARN.