Abstract

Iniciação, o crescimento, a recorrência e metástase de cabeça e pescoço carcinoma de células escamosas (CECP) têm sido relacionados com o comportamento de células-tronco cancerosas (CSC) que podem ser identificados por sua aldeído-desidrogenase atividade (ALDH1)-1 -isoform. Foram quantificados e enriquecido ALDH1

+ células dentro das linhas de células de carcinoma epidermóide e, posteriormente, caracterizado suas propriedades fenotípicas e funcionais como a capacidade de invasão e de transição epitelial-mesenquimal (EMT). esferoidal cultura enriquecido CSC a partir de cinco linhas de células de carcinoma epidermóide em até 5 vezes. Em células-derivadas esferóides (SDC) e a linha de células derivadas de monocamada parental ALDH1, CD44, CD24, E-caderina, α-SMA, e expressão de vimentina foi comparada por citometria de fluxo e imunof luorescência em conjunto com a análise de proliferação e ciclo celular. Invasão actividade foi avaliada por ensaio de Matrigel e expressão de factores de transcrição relacionados com o stemness (TF) Nanog, OCT3 /4, Sox2 e genes relacionados EMT-Snail1 e 2, e de torção por PCR em tempo real. Todas as linhas de células formado esferóides que podem auto-renovar e ser em série fazendo uma nova passagem. expressão ALDH1 foi significativamente maior no SDC. ALDH1

+ células mostraram um aumento da colónia-formação. A proporção de células com um putativo CSC marcador constelação de CD44

+ /CD24

– era altamente variável (de 0,5% a 96%) em monocamada e esferóides culturas e sobrepostos em 0% a 33% com o CD44

+ /CD24

– /ALDH1

+ subconjunto de células. SDC teve aumento significativo da actividade invasora. ARNm dos genes relacionados com a stemness Sox2, nanog, e OCT3 /4 foi significativamente aumentada em SDC de todas as linhas celulares. Torção foi significativamente aumentado em dois enquanto Snail2 mostrou um aumento significativo em um e uma diminuição significativa na SDC de duas linhas celulares. SDC teve uma proporção mais elevada de fase G0, mostraram expressão de alto nível de α-SMA e vimentina, mas diminuiu significativamente a expressão da caderina-E. CECP linhas abrigar potencial CSC, caracterizada por ALDH1 e marcador stemness expressão TF, bem como imóveis como invasão, quietude, e EMT. CSC pode ser enriquecida por técnicas de cultura independente de ancoragem, que podem ser importantes para a investigação de sua contribuição para a resistência à terapia, a recorrência de tumores e metástases

Citation:. Chen C, Wei Y, Hummel M, Hoffmann TK, Gross M, Kaufmann PM, et ai. (2011) Evidência para epitelial-mesenquimal Transição em Cancer Stem Cells da cabeça e pescoço carcinoma espinocelular. PLoS ONE 6 (1): e16466. doi: 10.1371 /journal.pone.0016466

editor: Lin Zhang, da Universidade da Pensilvânia, Estados Unidos da América

Recebido: 20 de setembro de 2010; Aceito: 20 de dezembro de 2010; Publicação: 27 de janeiro de 2011

Direitos de autor: © 2011 Chen et al. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Licença Creative Commons Attribution, que permite uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o autor original ea fonte sejam creditados

Financiamento:. O estudo foi inteiramente financiada por dinheiro de Charite-Universitätsmedizin. Não foram utilizados fontes de financiamento externo para este estudo. Os financiadores não tiveram nenhum papel no desenho do estudo, coleta de dados e análise, decisão de publicar ou preparação do manuscrito

CONFLITO DE INTERESSES:.. Os autores declararam que não existem interesses conflitantes

Introdução

contas CECP para aproximadamente 6% de todos os casos de câncer e para cerca de 650.000 novos casos e 350.000 mortes no mundo a cada ano [1], [2], [3]. Avanços na terapia melhoraram a qualidade de vida, mas as taxas de sobrevivência têm-se mantido inalterada ao longo das últimas décadas. A mortalidade por esta doença continua a ser elevada por causa do desenvolvimento de metástases distantes e o aparecimento de recidivas locais e sistêmicos resistentes à quimioterapia e radioterapia. Portanto, é essencial para desenvolver uma compreensão mais profunda da biologia desta doença, a fim de desenvolver abordagens terapêuticas mais eficazes.

A evidência foi recentemente acumulando para apoiar a hipótese de que os tumores contêm uma pequena subpopulação de células chamado de haste do cancro células (CSC), os quais exibem capacidades de auto-renovação e são responsáveis ​​pela manutenção tumoral e metástase [4]. CD44

+ /CD24

-cells foram, em primeiro lugar proposto para expor propriedades CSC no cancro da mama [5].

Posteriormente, CD133 foi encontrado para identificar CSC em tumores cerebrais [6], carcinoma colorectal [7], e carcinoma pancreático [8]. Em HNSCC, Prince et al. demonstrou pela primeira vez que uma CD44

+ população de células possui as propriedades de CSC [9], mas os números relativamente elevados destas células ( 5.000 células) foram necessários para gerar novos tumores em ratinhos imunodeficientes indicando quer uma baixa frequência de CSC ou uma baixa especificidade de CD44 como CSC-marcador para CECP. Esta última hipótese é suportada pela observação de que CD44s e expressão de CD44v6 não distingue normal a partir de epitélio benigno ou maligno da cabeça e pescoço. CD44s e CD44v6 foram abundantemente presentes na grande maioria das células nos tecidos da cabeça e pescoço, incluindo carcinoma de [10]. Assim, a identificação dos marcadores mais específicos para CSC HNSCC é desejável. Recentemente, alta aldeído desidrogenase 1 (ALDH1, também conhecido como ALDH1A1) actividade foi mostrado para identificar o CSC no HNSCC e outros cancros epiteliais [11], [12], [13], [14], [15]. No entanto, no cancro da mama do ALDH1

+ população mostra uma surpreendentemente pequena sobreposição com o anteriormente descrito CD44

+ /CD24

– fenótipo de apenas 0,1-1,2%. Interessantemente, no cancro da mama as células portadoras de ambos os fenótipos pareceu ser altamente tumorigénicas, ser capaz de gerar tumores a partir de tão pouco quanto 20 células [15]. Mantém-se a determinar se o mesmo padrão fenotípica de células estaminais em HNSCC está associada com um potencial tumorigénico semelhante.

ensaios esfera não-aderentes são cada vez mais utilizadas para avaliar a actividade de células estaminais em tecidos normais e CSC putativo. O neurosphere é o ensaio de esfera mais estudados. células do sistema nervoso central e cultivadas em superfícies não aderentes dar origem a neuroesferas que têm a capacidade de auto-renovação e pode, em princípio, gerar todos os tipos de células do cérebro [16], [17]. A capacidade para a geração repetida de neuroesferas individuais de células é geralmente visto como prova de auto-renovação [18]. Recentemente, foi descrito que as células-derivadas esferóides (SDC) a partir de linhas de células de gliossarcoma de rato possuir capacidade CSC [19]. Até o momento, não se sabe se as culturas esferóides de HNSCC pode enriquecer a CSC.

células estaminais hematopoiéticas normais são capazes de se auto-renovar e dar origem a todos os tipos de células sanguíneas. Eles são células não-ou muito lenta dividindo e residir em nichos de medula óssea em estado dormente. A capacidade de manter estas condições não se dividem ou em outros termos, permanecer na fase G0 do ciclo celular, é chamado quiescência [20]. Tem sido proposto que a CSC partilham muitas qualidades com células estaminais normais uma vez que a grande maioria deles também deve ficar em repouso e ser capaz de se auto-renovar. Porque a maioria das drogas anti-câncer, dirigir-se dividindo ativamente células (ciclismo), de repouso CSC permanecer vivo e pode ser a causa de recidivas e progressão do câncer. Ki-67 é o antigénio do ciclo celular relacionados com prototípico proteína nuclear, expressa por células em proliferação em todas as fases do ciclo celular activo (G1, S, G2 e fase M), mas está ausente nas células em repouso (G0).

Outra capacidade da CSC é realizar a transição epitelial-mesenquimal (EMT), um passo fundamental durante a embriogênese [21], [22], [23] e cicatrização de feridas [24]. Evidências recentes sugerem que os programas genéticos relevantes para EMT são também transitoriamente activadas em cancros epiteliais que desempenham um papel na progressão do cancro, através do qual os cancros epiteliais invadir tecidos e metástases. Embora o programa EMT é necessário para o desenvolvimento normal, a activação aberrante de EMT contribui para várias condições patológicas, incluindo fibrose e carcinoma progressão [25], [26]. Durante EMT células epiteliais quebrar célula-célula e os contactos célula-matriz extracelular e migram para outros locais no corpo [27]. Durante a progressão do cancro, EMT parece prover as células cancerosas com a capacidade de infiltrar o tecido circundante e, finalmente, metastizar para locais distantes [28]. Recentemente, foi relatado que a indução de EMT em células humanas imortalizadas diferenciadas mamárias epiteliais levou à aquisição do CD44

+ /CD24

– stem fenótipo de células [29]. Além disso, demonstrou-se que estes putativo CD44

+ /CD24

– CSC isolado a partir de tecidos neoplásicos da mama humano expressos níveis elevados de ARNm que codificam os marcadores associados EMT-Snail1 (SNA), Snail2, e torção. Os tumores malignos consistem de células cancerosas e células hospedeiras associados a tumores, com o último um maior interesse recentemente devido à sua participação na invasão tumoral e metástase, e resposta terapêutica [30], [31]. Os miofibroblastos são os componentes mais importantes do estroma tumoral. No entanto, a origem destas células permanece controverso até agora. A expressão da actina do músculo liso alfa (α-SMA) é considerado o marcador de miofibroblastos totalmente diferenciadas. Emergindo evidência mostra que miofibroblastos pode ser derivada das células epiteliais (tumor) através de EMT, [33] [32]. Esta noção é suportada pela observação de que os esferóides compactos formados por células de cancro do ovário no comportamento contráctil visor ascite, possuem a capacidade de invasão in vitro e alta a expressão de α-SMA, que também está associado à capacidade contráctil elevada [34].

no presente trabalho, nós testamos se técnicas de cultura celular independente de ancoragem permite a geração de esferóides-culturas e se estas culturas foram enriquecidas para células com propriedades funcionais e fenotípicas que caracterizam CSC de HNSCC. Aqui, forneceu a evidência que miofibroblastos pode ser derivada a partir de HNSCC utilizando um modelo de cultura celular esferóide que enriquece para células CSC-like como caracterizado por uma alta proporção de positividade ALDH1, quiescência proliferativa e capacidade invasiva.

resultados

linhas celulares HNSCC contêm células com capacidade de auto-renovação que formam esferóides tumorais

Várias abordagens diferentes foram usados ​​para identificar CSC. A estratégia utilizada para os nossos experimentos foi o in vitro esferóide método de formação de colónias. Foi investigada a capacidade de cinco linhas de células derivadas de CECP (UD-SCC1, UT-SCC22, UM-SCC11B, UT-SCC9, UT-SCC24A) a crescer de forma independente de ancoragem, como esferóides-culturas. As células foram colocadas em placas a uma densidade de 20.000 /ml. Depois de cultura in vitro, durante 5-10 dias em meio isento de soro sob condições não aderentes, todas as linhas celulares investigadas formado esferóides, variando de 50 a 500 células por esferóide (Figura 1A). A capacidade de auto-renovação destes esferóides tumor foi avaliada usando o método publicado pela Ghods et al [19]. Resumidamente, os esferóides foram recolhidas e dissociados numa única suspensão de células que foi subsequentemente colocadas em placas a uma densidade clonal de 1.000 células por ml. subspheroids tumorais que variam de 20 a 40 células foram evidentes após 10 a 14 dias (Figura 1B, C). Em contraste, as culturas de células em monocamada cultivadas parentais sob as mesmas condições não formar esferóides se plaqueadas a esta concentração baixa, mesmo após 21 dias. Quando os esferóides foram transferidas de volta para um frasco de cultura de tecido normal revestida para cultura de células em monocamada, os esferóides aderidas ao frasco e cresceu a partir de células do esferóide e formaram uma monocamada confluente. O fenótipo destas células foi idêntico ao das linhas celulares parentais (Figura 1D).

imagens representativas da linha de células UD-SCC1s são mostrados. (A) A primeira geração de esferóides. (B) Um subspheroid formado após a sementeira, a uma concentração de 1000 células /ml. (C) Um esferóide formada na geração 21. (D) Spheroid aderir e crescer até à confluência após repique em frascos revestidos de cultura de tecidos. (E) linha de células parental crescido permanentemente como uma cultura em monocamada.

Caracterização fenotípica da SDC

A expressão do putativo marcador de células-tronco ALDH1 em SDC ea respectiva linha de células monocamada parental utilizado como controlo foi comparada com a de CD44

+ /CD24

– expressando população por multicolor FACS análise

Curiosamente, todos SDC havia um aumento do número de células positivas ALDH1, em comparação com as linhas celulares parentais. (Figura 2). A maior proporção de ALDH1

+ células foi encontrado em esferóides gerados a partir da linha celular UD-SSC1 (46,4 ± 8,1%), que foi 5 vezes maior do que a linha celular parental correspondente (9,4 ± 5,3%).

(A) FACS-análise Representante de duas linhas de células após coloração Aldefluor. Comparação das frequências de células positivas ALDH1 em monocamada a SDC e controle DEAB. DEAB é um inibidor específico da ALDH1. (B) Os resultados representam a expressão de ALDH1 em células derivadas de culturas esferóides (colunas protegidos) em comparação com células monocamada (colunas abertas). ALDH1 expressão de SDC é geralmente aumentada significativamente (A, B). UD-SCC22, UT-SCC24A, e UM-SCC11B exibir um fenótipo mesenquimal parcial tem expressão já relativamente alta ALDH1 em linhas celulares parentais. (** P 0,01, * p 0,05)

células de tumor com uma CD44

+ /CD24

– fenótipo mostraram ter propriedades CSC numa variedade de tumores sólidos. [4]. Estamos, portanto, também investigou comparativamente a expressão de CD44 e CD24 em linhas de células de carcinoma epidermóide e descobriu que a proporção de CD44

+ /CD24

– células é altamente variável (0,5-97%). A sobreposição com ALDH1

+ células foi pequena (0-2,2%), excepto para as duas linhas de células UM-SCC11B e UT-SCC22 que tiveram uma sobreposição de cerca de 33% e foram compostas de mais de 95% de CD44

+ /CD24

– células. Interessantemente, a percentagem de CD44

+ /CD24

– células não foi consistentemente enriquecido pelo método de cultura de esferóide (Tabela 1). Este resultado levantou a questão de como bem ALDH1 é adequado para a identificação de células com propriedades CSC no HNSCC. Para abordar esta questão, células positivas e negativas ALDH1 dos esferóides gerados a partir das linhas de células UT-SCC9 e UD-SCC1 foram separados por separação por FACS. Subsequentemente, a sua capacidade de formação de colónias foi avaliada. UT-SCC9 e UD-SCC1 foram escolhidas porque, em comparação com as outras linhas celulares que geraram mais esferóides com maior enriquecimento do ALDH1

+ células. Os dados mostram que ALDH1

+ células podem formar 3 a 4 vezes mais do que clones ALDH1

– células (Figura 3). observação microscópica de luz depois de 2 semanas, demonstraram que os clones formados por ALDH1

+ células em média continha 197 células (197 ± 47) em comparação com 33 (33 ± 16) células em clones gerados a partir de ALDH1

– células (p 0,01). Os nossos dados também mostram que a única ALDH1

+ células podem significativamente melhor regenerar um esferóide numa cultura independente de ancoragem com meio isento de soro complementado com bFGF e EGF (UT-SCC9: 17,1%, UD-SCC1s: 19,3%), enquanto nas mesmas condições individuais ALDH1

– células regeneradas em apenas um caso um esferóide. (Quadro 2, Figura S1).

Dois mil células-ALDH1 classificados foram semeadas e depois de 14 dias, as colónias que se formaram foram quantificados. O ALDH1

+ subpopulação em linhas celulares de UD-SCC1 e UT-SCC9 ter uma maior eficiência de formação de clones em relação ao ALDH1

– subpopulação (** p 0,01).

Em resumo, SDC gerada a partir de linhas de CECP expressam altos níveis do marcador CSC putativo ALDH1, formam significativamente mais clones, que também regeneram significativamente mais frequentemente em esferóides, em seguida, ALDH1

– células e têm uma sobreposição variando com a CD44

+ /CD24

-. população

show de SDC aumentou invadindo capacidade in vitro

Central para a definição de CSC é a capacidade de iniciar e conduzir o crescimento da tumor primário e de invasão e metástase. A estreita relação entre a percentagem de células com CSC fenótipo (CD44

+ /CD24

-) no tumor primário e no desenvolvimento de metástase em câncer de mama em Recentemente, foi relatado [35]. Além disso, para indicação do potencial metastático de células com CSC-fenótipo no cancro da mama vem da observação de que as células de cancro da mama detectado na medula óssea mostrou predominantemente este fenótipo [36].

Em analogia com esta observação, nós perguntado se CSC derivados de culturas esferóides de HNSCC exibir um potencial invasor similar. Ao usar uma câmara de invasão Matrigel, comparamos a capacidade de invasão das células quer levantadas no esferóide ou monocamada cultura. SDC a partir de todas as cinco linhas de células testadas mostraram um aumento significativamente a capacidade de invadir de 2,1-8,6 vezes em relação ao controlo parental (Figura 4).

câmaras de invasão de Matrigel foram utilizados para comparar a capacidade invasora entre células derivadas de esferóides (tracejado colunas) ou monocamada (colunas aberta). SDC de todas as linhas celulares investigadas mostraram maior atividade de invasão in vitro de células derivadas de monocamada. (** P 0,01, * p 0,05).

A superexpressão de genes relacionados à stemness em SDC

Foi relatado que Oct4, Sox2 e Nanog, que formam uma núcleo de auto-organizada de fatores de transcrição (TF), manter a pluripotência e auto-renovação das células-tronco embrionárias humanas [37], [38]. Queríamos saber se CSC também compartilham esta característica de expressão TF com células-tronco embrionárias (ES). Para este fim, quantitativamente em relação à expressão de ARNm destes TF entre SDC e células derivadas de monocamada parentais. Descobrimos que os níveis de mRNA de OCT3 /4, Sox2 e Nanog foram todos aumentaram significativamente no SDC. O maior aumento foi observado em UT-SCC22, em que um aumento de 52 vezes na expressão Sox2 foi encontrada em esferóides. A menor alteração foi encontrada em UT-SCC9, em que um aumento de 1,23 vezes na OCT3 /4 expressão foi encontrada em esferóides. O TF-chave envolvido na EMT, Snail1 foi também significativamente aumentada em todos SDC gerados a partir dos cinco linhas de células de carcinoma epidermóide. Curiosamente, duas outras TF envolvido na EMT, Snail2 e Twist, mostrou um padrão de expressão de acordo com o estatuto de CD24. Em UD-SCC1, UT-SCC9 e UT-SCC24A onde a maioria das células são CD44

+ /CD24

+, o nível Snail2 diminuiu em esferóides enquanto torção não mostrou nenhuma mudança significativa. No entanto, em UT-SSC22 e UM-SCC11B, que foram compostas para mais de 95% de CD44

+ /CD24

– células Snail2 e Twist, mostrou um aumento significativo (Figura 5). Estes resultados implícito que Snail2 e nível de expressão da torção foram correlacionadas com o fenótipo de CD24.

RNA mensageiro isolado a partir de culturas em monocamada esferóides e foi quantificada a expressão do TF indicado. A proporção de expressão de esferóide a monocamada de células é dada. Diferenças significativas foram * p 0,05; ** P 0,01. O nível de mRNA de relacionados com stemness TF Nanog, OCT3 /4, Sox2 e aumentaram notavelmente nos esferóides. O TF-chave na EMT Snail1 foi também aumentado em todas as esferóides, mas outros dois TF envolvido na EMT, Snail2 e Twist, mostrou um padrão de expressão, dependendo do estado CD44 /CD24.

SDC são mais quieta do que a sua camada única derivado parental homólogos

Para a análise do ciclo celular por FACS, as linhas de células UT-SCC24A, UT-SCC9, UD-SCC1, UT-SCC22, e UM-SCC11B cultivadas em cultura em monocamada ou esferóide foram coradas para o Ki-67-FITC e ADN contrastadas por iodeto de propídio. As células que residem no pico G1 /G0 que foram negativos para o Ki-67 de coloração foram consideradas ser a fracção de repouso (fase G0). Em todas as linhas celulares, a proporção de células na fase G0 mostrou um aumento altamente significativo na SDC, indicando que SDC contêm uma maior proporção de células quiescentes que as células derivadas de monocamada parentais (Figura 6).

(A ) coloração dupla com Ki-67 e de iodeto de propídio para a medição da proliferação e do conteúdo de ADN celular. células individuais foram fechado em FL2-W e FL2-A. teor de ADN e expressão de Ki-67 foi avaliada por análise de citometria de fluxo. (b) As frequências de células quiescentes em SDC como comparação com células derivadas de monocamada. Em todos os casos, as células derivadas de esferóides contêm uma percentagem maior altamente significativo de células quiescentes (G0). (** P 0,01).

Uma subpopulação de células em esferóides adquiriram características de miofibroblastos e podem ter sofrido EMT

miofibroblastos são componentes do estroma tumoral e pode ter um papel na construção da CSC-nicho, o que pode ajudar a preservar a stemness da CSC. No entanto, a origem destas células permanece desconhecido. Os miofibroblastos produzir vários factores, que podem estimular a proliferação de células cancerosas e facilitar a infiltração do tecido. Na literatura, esferóides não aderentes gerados a partir de linhas celulares de cancro foram mostrados para conter putativo CSC. Estas esferas podem ser mantidas em cultura por longos períodos, o que implica que os esferóides podem proporcionar um nicho adequado para a manutenção e crescimento de CSC. Por isso, perguntamos se existem i) miofibroblastos no nicho criado por esferóides, ii) são esses miofibroblastos derivados de células tumorais epiteliais através de EMT, e iii) existem indicações de que este processo é reversível?

Para abordar esta importa, foi investigada a expressão de marcadores de miofibroblastos Vimentin e α-SMA na SDC das linhas 3 celulares que têm diferentes níveis de expressão ALDH1 em cultura em monocamada (baixo: UD-SCC1: 9,4 ± 5,3%, média: UT-SCC22: 16,9 ± 4,1 %, de alta: UT-SCC24A: 25,8 ± 3,0%). Descobrimos que as diferentes linhas de células e SDC gerado a partir destas linhas celulares variadas na proporção de células que expressam vimentina e α-SMA (Tabela 3). UD-SCC1s não mostrou que expressam células e fraco (12,5 ± 2,5%) A expressão de vimentina das células em cultura em monocamada a α-SMA. Em contraste, a UT-SCC24A (Figura 7) e UT-SCC22 células derivadas da monocamada tinha uma frequência relativamente elevada de vimentina e α-SMA células que expressam o que indica que estas linhas de células têm ambas as características epiteliais e mesenquimais. Interessantemente, estas duas linhas de células possuem uma percentagem relativamente elevada de células nas culturas de monocamada que são ALDH1 positivo (Tabela 3). No entanto, como culturas esferóides, todas as linhas de células continha mais células α-SMA e vimentina positivas do que as linhas de células monocamada parental correspondentes.

(A) Imunofluorescência coloração da monocamada (A1-3 e B1-3) e esferóide (C 1-3 D1-3 e) culturas de UT-SCC24A com anticorpos dirigidos contra α-SMA (verde) e vimentina (vermelho). Todo o SDC (painel C e D) mostram níveis elevados de marcadores mesenquimais alfa-SMA e vimentina em comparação com os seus homólogos em monocamada. (B) Análise de expressão de E-caderina por FACS. Em comparação com os seus homólogos em monocamada, esferóides mostrou diminuição da expressão da caderina-E; duas populações de células derivadas de UT-SSC24A podem ser separados de acordo com o nível de expressão da caderina-E, que indica que o SDC adquiriram características de miofibroblastos por EMT.

EMT também é acompanhado por perda de contactos célula-célula para as células epiteliais, caracterizado por uma sub-regulação da expressão de E-caderina. O número de células de E-caderina em SDC e monocamadas expressando foi quantificado por FACS (Figura 7, Tabela 3). A SDC apresentaram aumento significativamente proporções de E-caderina negativos a células que expressam baixos em comparação com os seus homólogos derivados de monocamada, indicando perda de adesão celular nesta subpopulação.

Finalmente, nós também testou a re-adesão de esferóides de plástico cultura. Curiosamente, quando os esferóides ligado ao balão e começou a crescer para fora como uma cultura em monocamada, o nível de vimentina α-SMA e diminuiu, e a maioria das células que cresceram a partir dos esferóides coradas negativo para estes dois marcadores (Figura 8).

(a-C) imagens Light-microscópicas com a forma de contraste de fase esferóides UD-SCC1 reattaching para cobrir slides durante o processo de re-crescimento a um fenótipo monocamada. (A) 24 horas após o reatamento, algumas células fusiformes crescer fora de esferóides aderiram. (B) 72 horas após a religação, mais de forma das células ligadas parece com o seu homólogo monocamada parental (C). (D-E) imunofluorescência indireta de esferóides recolocado após 24 h coradas com DAPI (D1, E1), α-SMA (D2; verde) e vimentina (E2; vermelho). Pictures D3 e E3 mostrar a sobreposição com a coloração nuclear. Setas retratam células superando irradiam do esferóide. A expressão de α-SMA e vimentina diminuiu em células (setas) superando após o reatamento e na maioria das coloração foi confinado a esferóides enquanto a maioria das células cultivadas a partir de esferóides foram imaculada.

Discussão

Em biologia tumor muitos esforços têm sido feitos para explicar as características embrionárias-like de células cancerosas transformadas. A capacidade de CSC para reconstruir o tumor a partir de uma única célula pode explicar muitas das diferenças que discriminam as células tumorais a partir de células somáticas diferenciadas como a imortalidade, quiescência, invasão levando a metástase, e de recorrência após o tratamento. Príncipe e colaboradores [9], demonstraram que uma população menor de CD44

+ CECP células possuem características CSC, o que poderia dar origem a novos tumores in vivo (≈5,000 células injetadas). Mack e colegas questionaram a utilização de CD44 como um marcador específico no CSC HNSCC desde CD44 foi abundantemente expressa na maioria das células tumorais dentro HNSCC (60% -100%) e, portanto, não pode ser usado para distinguir normal a partir de epitélio benigno ou maligno da cabeça e pescoço [10]. ALDH1 foi mostrado recentemente para ser um marcador mais adequadas para identificar putativo CSC de CECP e outros cancros epiteliais [11], [12], [13], [14], [15]. Em HNSCC, Chen et al mostrou que 3000 ALDH1

+ células CECP de cinco pacientes em camundongos xenotransplantadas resultou em todos os casos na geração de tumores visíveis 6 semanas após a injeção, enquanto 10

4 ALDH1

– células falhou para gerar tumores. [12], [39]. Descreve-se um método de propagação e de enriquecimento ALDH1

+ culturas de células de linhas de células de carcinoma epidermóide. As características semelhantes a células estaminais de estas células foram analisadas por comparação a expressão do antigénio de superfície e a expressão de TF embrionário, bem como as características funcionais das linhagens de células monocamada parentais. A observação de que esferóides-culturas não consistem em uma população de células homogênea desencadeada mais subanálises que revelaram uma população de células com expressão de EMT-marcadores. Isso pode indicar que estas células têm um EMT-programa activado e demonstra uma relação potencialmente estreita entre CSC e as células com um programa EMT activado o que pode ter derivado da CSC.

esferóides são tridimensionais aglomerados

(esféricos) de células de tumor cultivadas a partir de um ou vários clones de células. Em comparação com tempos de duplicação da célula medida em cultura em monocamada, a taxa e o padrão de crescimento de esferóides in vitro melhores resultados que a observada em tumores in vivo [40]. o crescimento independente de ancoragem tem sido mostrado para ser uma propriedade partilhada por células de tecido normal que exibem propriedades das células estaminais [41]. Também CSC derivado de melanoma [42], o cancro da mama [43], e gliossarcoma [19] foram capazes de ser propagado de forma independente de ancoragem e exibir o fenótipo de esferóides não aderentes.

Como exemplificado no cancro da mama, por exemplo, putativo CSC (CD44

+ /CD24

-) podem ser enriquecidos in vitro através do isolamento a partir de culturas em suspensão mammospheres [43], [44]. Em nosso estudo, encontramos a frequência de CD44

+ /CD24

– células em linhas CECP ser altamente variável (de 0,5% a 97%). Além disso, eles não poderiam ser enriquecido pela cultura esferóide. Em contraste, as células positivas ALDH1 foram encontrados para ser altamente enriquecido em culturas de esferóide a partir de todas as cinco linhas de células de carcinoma epidermóide. Se semeadas numa densitiy muito baixo, separadas por FACS ALDH1

+ células formadas significativamente mais colônias em seguida, a ALDH

– população, indicando uma capacidade proliferativa maior desta subpopulação. Outros mostraram, que ALDH1

+ ou ALDH1

+ /CD44

+ /CD24

– populações de células isoladas de CECP-pacientes têm um maior potencial tumorigénico em seguida ALDH1

– células, mesmo se eles eram CD44

24

– se xenotransplantadas em ratos [12]

Cancro e as células-tronco normais (SC) partilham propriedades proliferativas de auto-renovação, quietude e expressão de fatores-chave de transcrição (TF. ). Chickarmane et ai. [45] configurar um computador de modelo para descrever as combinações de fatores de transcrição chave em SC e altos níveis definidos de OCT3 /4, Sox2 e Nanog. Por outro lado, Ji et al. [46] compararam o papel do OCT3 /4 e Nanog em transformada (t-hPSCs), e as células-tronco pluripotentes humanas normais (hPSCs). Ao contrário SC normal, a auto-renovação e sobrevivência de t-hPSCs foi encontrado para ser independente de OCT3 /4 expressão. Em contraste, knockdown genética de Nanog causou perda completa de auto-renovação concomitantemente com a apoptose em t-hPSCs. Em nosso estudo, a expressão de OCT3 /4, Sox2 e Nanog foi regulada em SDC nas linhas celulares derivadas de cinco CECP. Isto implica que SDC podem ter propriedades de células-tronco.

Os estudos que tratam de perfis de expressão genética in vivo células invasoras ou células submetidos a EMT in vitro, revelou uma mudança de um proliferativa a um fenótipo invasivo. De acordo com esta observação, a proliferação de células de marcador Ki-67 foi mostrado para etiquetar apenas uma pequena minoria das células na frente invasiva, em comparação com a parte central mais diferenciada do tumor, sugerindo que as células tumorais não-proliferantes que escaparam a massa tumoral pode ter potencial metastático [47]. Em nosso estudo, descobrimos que SDC teve uma proporção mais elevada de 67 Ki-células negativas em comparação com as culturas em monocamada correspondentes. Isto indica que a SDC são mais quiescente do que as células derivadas de monocamada. Nós também descobrimos que a SDC têm uma maior capacidade de invasão, o que implica que estas células pode ter uma maior capacidade de metastizar.

miofibroblastos são um tipo de células mesenquimais que joga um papel chave na invasão tumoral e metástase e resposta terapêutica. Eles podem produzir vários factores que podem estimular a proliferação de células cancerosas e facilitar a sua infiltração [31]. No entanto, a origem desses miofibroblastos não é clara. EMT tem sido relatada a desempenhar um papel importante na iniciação CSC [29]. Neste estudo, foi demonstrado que as células tipo miofibroblastos são uma subpopulação de SDC. Estes esferóides derivado exclusivamente de células tumorais clonadas. Portanto, pode-se concluir que os miofibroblastos só poderia surgir a partir de células epiteliais cancerosas, alterando a epitelial para um fenótipo mesenquimal através EMT. Mais importante, como encontramos, que mais de 90% da SDC manchado positivo para α-SMA e vimentina, enquanto a percentagem de ALDH1

+ células variou de 37% para 46,4%. Uma diminuição significativa da expressão de E-caderina pode ser demonstrada em SDC, indicando uma redução de contato célula-célula em culturas esferóides. Estas expressões marcadoras foram reversível sob condições de cultura, onde poderia esferóides aderem e as células cresceram radialmente para fora para formar uma monocamada.