Abstract
É amplamente aceito que a maioria dos cânceres colorretais (CRCs) são provenientes de adenomas colorretais (ANR) , mas os dados transcriptomic caracterizam a progressão de mucosa normal colorectal para adenoma, e em seguida, para adenocarcinoma são escassos. Estes passos de transição foram investigados utilizando microarrays, tanto ao nível de expressão do gene e de splicing alternativo de pré-ARNm. Muitos genes e exons foram anormalmente expresso em CRAs, ainda mais do que em CRCs, em comparação com a mucosa normal. caminhos biológicos conhecidos envolvidos no CRC foram alterados no CRA, mas vários novos caminhos enriquecidas também foram reconhecidos, tais como o complemento e de coagulação cascatas. Também identificamos quatro assinaturas de transcrição intersetoriais que poderão distinguir CRAs de mucosas ou CRCs normal, incluindo uma assinatura de 40 genes diferencialmente desregulados em ambas as amostras CRA e CRC. A maioria destes genes havia sido descrito em diferentes tipos de câncer, incluindo
FBLN1
ou
INHBA
, mas apenas uns poucos no CRC. Várias destas variações foram também observados ao nível da proteína. Além disso, 20% destes genes (
ou seja CFH
,
CRYAB
,
DPT
,
FBLN1
,
ITIH5
,
NR3C2
,
SLIT3
e
TIMP1
) mostrou alterado pré mRNA-splicing em CRAs. Como uma variação global de ocorrendo desde a fase CRA, e mantida no CRC, a expressão e splicing mudanças deste conjunto de 40 genes pode marcar o risco de ocorrência de câncer a partir da análise de biópsias CRA
Citation:. Pesson M, Volant A, Uguen A, Trillet K, De La Grange P, Aubry M, et al. (2014) A expressão do gene e Pré-mRNA emenda assinatura que marca o adenoma-adenocarcinoma progressão no cancro colorectal. PLoS ONE 9 (2): e87761. doi: 10.1371 /journal.pone.0087761
editor: Amanda Ewart Toland, Ohio State University Medical Center, Estados Unidos da América
Recebido: 24 de setembro de 2013; Aceito: 30 de dezembro de 2013; Publicação: 06 de fevereiro de 2014
Direitos de autor: © 2014 Pesson et al. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Licença Creative Commons Attribution, que permite uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o autor original ea fonte sejam creditados
Financiamento:. Financiado pela Inserm, Universidade de Brest, Brest Hospital Universitário Cancéropôle Grande Oeste, Ligue contre le Cancer, Oséo – Programa BioIntelligence, ARC, e na região da Bretanha. MP foi o destinatário de uma bolsa da Région Bretagne. Os financiadores não tiveram nenhum papel no desenho do estudo, coleta de dados e análise, decisão de publicar ou preparação do manuscrito
CONFLITO DE INTERESSES:.. Os autores declararam que não existem interesses conflitantes
Introdução
o câncer colorretal (CRC) é um dos cânceres mais prevalentes nos países desenvolvidos, e é a principal causa líder de mortalidade relacionada ao câncer em todo o mundo. O tipo mais comum de CRC é o adenocarcinoma ( 95%), que é uma neoplasia invasiva do epitélio glandular do cólon ou do recto. Aceita-se que adenocarcinomas, provavelmente, pode surgir a partir de adenomas colorretais (CRAS), como inferido a partir de características específicas fenotípicas, tais como tamanho e histologia.
lesões colorretais são classificados na endoscopia como não-polipóide (flat) e polipóide, que são separados em tubular, túbulo ou das vilosidades, com diferentes graus de displasia. ANR são muitas vezes referidos como pólipos adenomatosos que representam as lesões mais frequentemente associados com o resultado neoplásica, e foi mostrado que a sua remoção estava ligada a uma diminuição na incidência de CRC [1]. Enquanto adenomas tubulares são as mais comuns, adenomas vilosos são os menos frequente, mas eles podem transformar-se em cancro com alta frequência [2]. Além disso, os pacientes com pólipos múltiplos anteriores tinham adenoma com características patológicas avançada [3].
várias mutações condutoras foram identificados durante a progressão de ANR para CRC [4], em conjunto com outros eventos moleculares, tais como microARN modulação [5] ou alterações de splicing de ARNm de pré-[6]. Além disso, vários perfis de expressão de genes têm sido relatados em CRC [7], [8]. Alguns estudos também pesquisou a expressão do gene no CRA, e analisada a linhagem com CRC [9], [10], [11], [12], [13], [14]. No entanto, a maioria das análises foram realizadas a partir de um número limitado de amostras de PCR. Além disso, poucos estudos analisaram os perfis de emenda do genoma alternativas pré-mRNA de amostras CRA [15] e sua ligação com o CRC, apesar de splicing alternativo ocorre para uma estimativa de 90% dos genes no genoma humano [16] .O objetivo deste estudo foi analisar, com microarrays, expressão gênica e splicing alternativo na ANR, em comparação com a mucosa normal, mas também com CRCs. Relatamos aqui um quadro abrangente das modificações ocorridas em CRAs, alguns dos quais eram específicos para CRAs, enquanto outros foram compartilhados em CRCs. Importante, identificámos um conjunto de 40 genes (32 jusante e 8 de up-regulamentados genes), a partir de uma análise cruzada de comparações lado-a-lado, considerando mucosa normal, CRAs e CRCs, que poderia marcar os principais acontecimentos regulatórios que caracterizam a progressão gradual no cancro colorectal.
Materiais e Métodos
Processamento de Amostra de tecido
Um formulário de consentimento informado foi elaborado em conjunto com a Comissão do Hospital Universitário de Brest Ética (liderado por Pr . Boles JM). Os pacientes assinaram o formulário, que foi devolvido ao departamento de Anatomia e Patologia do Hospital Universitário de Brest. Assim, este estudo foi aprovado pelo Comitê de Ética do Hospital Universitário de Brest. amostras do cólon ou do recto biópsia foram obtidos após a remoção cirúrgica. As amostras foram então processadas anonimamente. Os fragmentos de tecido derivadas de biópsias foram armazenados em RNAlater (Ambion, França): 55 CRAs, 25 CRCs e 27 de mucosas normais colorectal (NOR; emparelhado com CRAs ou CRCs) foram coletados entre 2006 e 2012, a maioria a partir de 2009. A partir CRA ou biópsias de CRC, um fragmento de superfície foi recolhido a partir da região do tumor, compreendendo células em média 90% do tumor, 5% de linfócitos e células de 5% do estroma. Estas percentagens foram muito homogênea entre as amostras independentes. Três subgrupos (A1, A2 e A3) das ANR pode ser distinguidos de acordo com dados histológicos. Informações detalhadas paciente é apresentada na Tabela 1 e Tabela S1. ADN e o ARN total foi extraído com o AllPrep ADN /ARN Mini Kit (Qiagen, Courtaboeuf, França) a partir de amostras de tecido homogeneizado (20 mg), de acordo com as instruções do fabricante. pureza e integridade do RNA foram determinadas medindo a razão de densidade óptica (A260 /A280) e o número de integridade do RNA (NIR) foi obtido utilizando o RNA 6000 Nano LabChip (Agilent, Massy, França) e o Bioanalyzer 2100 (Agilent). Somente amostras de RNA com uma relação 28S /18S 1,0 e Rin ≥7.0 foram utilizados para microarray analisa
todo o genoma Microarray
Uma análise de amostras de 55 RNA derivado de colorectal. tecido, constituído por três grupos de amostras (NOR, CRA e CRC) com um número variável de repetições biológicas, foi realizada em 44k microarrays inteiras do Genoma humano (Agilent) que contêm 41,093 sondas, proporcionando cobertura total de transcritos humanos. cDNA de cadeia dupla foi sintetizado a partir de 500 ng de RNA total utilizando o kit de marcação rápida Amp, One-cor, conforme indicado pelo fabricante (Agilent). Marcando com cyanine3-CTP, fragmentação de ARNc, hibridação e de lavagem foram realizadas de acordo com as instruções do fabricante (Agilent). Os microarrays foram digitalizadas e os dados foram extraídos com a Agilent Software Feature Extraction.
Gene Expression Analysis
dados de expressão de genes em bruto foram importadas para o programa de software 11.0.2 GeneSpring GX (Agilent). comparações lado-a-lado foram realizadas para alterações de expressão gênica: CRC
vs
emparelhado NOR, CRA
vs
NOR, e CRC
vs
CRA…. Os genes com valores em falta em mais de 25% das amostras foram excluídos da análise. Estes dados foram depositados em Omnibus Gene Expression do NCBI e são acessíveis através de números de acesso GEO Série GSE50114, GSE50115 e GSE50117. Uma diferença de corte de 2 vezes foi aplicada para selecionar o para cima e para baixo-regulados genes (P-valor ≤0.01 por
t
-teste com Benjamini-Hochberg taxa de falsa descoberta, FDR). agrupamento hierárquico dos dados expressão foi realizada utilizando distância euclidiana com ligação média.
Gene Set Análise de Enriquecimento
O software disponível ao público, banco de dados para anotação, visualização e descoberta integrada [17], foi usado para analisar o enriquecimento conjunto de genes em lesões colorretais. Uma diferença de corte de 2 vezes foi aplicada para selecionar a lista de genes desregulados (P-valor ≤0.01 pelo
t
-teste com FDR). Somente os caminhos da Enciclopédia Kyoto de genes e genomas (KEGG) serão descritos [18].
splicing alternativo Análise
A RNA reunidas, analisadas em duplicado, de 3 mucosa normal, colo-rectal e 24 amostras CRA RNA foram analisadas em Exon Human 1.0 ST matrizes (Affymetrix, Paris, França), o que permitiu a análise de ambos expressão gênica e splicing alternativo. hibridação microarray foi realizada nas instalações de Curie Instituto (Paris, França). Os dados brutos foram analisados por tecnologia GenoSplice. Estes dados são acessíveis através de número de acesso GEO Series GSE50592. Uma diferença de corte de 1,5 vezes foi aplicada para selecionar o para cima e para baixo-regulados genes e exons (P-valor ≤ 0,05).
Real-Time Polymerase Chain Reaction Validação
Como um passo de validação dos resultados de microarray, quantitativo de RT-PCR foi realizada em três grupos (NOR, CRA e CRC) de pelo menos 8 amostras, incluindo algumas das amostras hibridadas em microarrays, ou em um conjunto independente de 14 ANR e 8 emparelhado tumoral amostras de CRC -Normal. O ARN total (200 ng) foi utilizado para síntese de ADNc de primeira cadeia com o High-Capacity cDNA kit de transcrição reversa (Applied Biosystems). RT-PCR quantitativa foi realizada utilizando o verde SYBR de PCR Master Mix de energia (Applied Biosystems) de acordo com as instruções do fabricante, com um sistema de tempo real ABI 7000 ou PCR 7300 (Applied Biosystems). Todas as determinações foram realizadas em duplicado e normalizados contra o
beta
-2-microglobulina como um gene controle interno. Os resultados foram expressos como a expressão do gene relativa utilizando o método ΔΔCt [19]. Todos os genes testados foram seleccionados com base na análise do microarray, a fim de validar o enriquecimento via biológica e uma assinatura de genes em ANR e CRCs. As sequências dos iniciadores e condições de reacção será fornecido mediante solicitação. Além disso, uma configuração de matriz de PCR (Qiagen) foi utilizada para analisar, em Nor e amostras de CRC, a expressão de genes com iniciadores presentes entre as placas com múltiplas cavidades de matriz de PCR (apoptose, cancro do Caminho Localizador, Drug Metabolism, lipoproteína de sinalização e o metabolismo do colesterol,
Wnt
via de sinalização).
resultados
Comparação de colorretais Adenoma morfológicas subgrupos
Vários marcos mutações têm sido descritas na progressão para cancro colo-rectal, tais como
KRAS
,
BRAF
e
PI3K
mutações [4], [20], e foram analisados em nossas amostras (Informações de Apoio). Além disso, o estado de instabilidade de microssatélites (Informações de Apoio) foi determinada em 12 amostras CRA, mas todos foram negativos. A classificação de Viena permitido adenomas grupo em duas classes: um grupo menor de amostras de grau superior amostras de grau inferior (3) com 11 (22%) e um grupo principal de 40 (78%) ( 3) (Tabela S1) . Esta classificação não se encontraram com os tipos de lesão tubuloviloso tubular /vilosidades /, uma vez que as ANR tanto com displasia de alto grau de baixo grau e foram igualmente distribuídos nos grupos tubullovillous e tubulares (apenas uma CRA era do tipo das vilosidades). Esta separação em tubular, vilosidades ou tubuloviloso, portanto, não foi aprovada. Decidimos contar com uma análise da morfologia precisa e aplicado um agrupamento anatômico, o que levou à distinção de três subgrupos morfológicos: adenomas com áreas de micro-invasivo adenocarcinomas (A1; 10 amostras), degenerou adenomas,
ou seja
. adenomas com áreas de
em
situ (intra-mucosa) adenocarcinomas (A2; 17 amostras) e adenomas com áreas de displasia (A3; 24 amostras). A fim de determinar se ANR também podem ser distinguidos por meio moleculares, um ANOVA de uma via foi realizada para comparar os subgrupos CRA a CRC e nem os grupos, com “tipo de tecido”, tal como um factor ANOVA (dados não mostrados). A análise revelou que os subgrupos CRA estavam muito perto uns com os outros. Não houve diferença entre os subgrupos A2 e A3, eo número máximo de sondas desregulados foi encontrado para o subgrupo A1
vs
. subgrupo comparação A2 (49 sondas, o que corresponde a 0,12% do número total de sondas, valor-p ≤0.01). Além disso, enquanto as comparações entre subgrupos CRA e mucosas normais mostrou o maior número de sondas distintas (até 4.382 sondas em subgrupo A2
vs
. NOR), as comparações entre subgrupos e CRCs CRA apresentou a menor (até 1.424 sondas em CRC
vs
. subgrupo A2). CRAs como um todo foram, portanto, mais distinto de mucosas normais do que a partir CRCs. Os três subgrupos CRA também foram comparadas entre si, e não foi observada diferença no lado-a-lado comparações (P-valor de ≤0.01 por
t
-test com FDR). Consequentemente, as ANR foram considerados coletivamente como um grupo único para futuras comparações lado-a-lado a estudante de
t
-teste.
Gene Expression Profiling em Colorectal lesões em comparação com a normal de mucosa
a fim de identificar os genes que poderiam participar na progressão da mucosa normal ao CRA, foi realizada uma CRA
vs
. NOR comparação, e descobriu que 2.393 sondas foram desregulados em CRAs (≥2.0 dobrá-change (FC), P-valor do ≤0.01 pelo
t
-teste com FDR), correspondendo a 32% para cima e 68 % down-regulamentação. O CRC
vs
. NOR comparação mostrou que 1.805 sondas foram desregulados em CRCs (≥2.0 FC, P-value ≤0.01 por emparelhado
t
-teste com FDR), correspondendo a 46% para cima e 54% para baixo-regulação. Os mapas de calor das sondas desregulados com um fold-change ≥3.0 e um valor P ≤0.001 são mostrados nas Figuras 1A (CRA
vs
. NOR) e 1B (CRC
vs
. NOR), e Figura S1 (CRA
. NOR, imagem completa vs). Listas completas do diferencialmente expressos sondas no CRA
vs
. NOR e CRC
vs
. Nem são apresentados nas Tabelas S2 e S3, respectivamente. Um conjunto de eventos de desregulamentação em CRA
vs
. NEM foi analisado por RT-PCR quantitativo, e a taxa de validação de resultados de microarray da Agilent foi de 78% (50 de 64 transcrições; Tabela S4). Além disso, as experiências de PCR da Qiagen de matriz foram realizados em um conjunto independente de CRC 96 e 20 NOR amostras (de banco de tumores Brest). Entre as sondas desregulados em CRC
vs
. NEM em microarrays, 41 pares de iniciadores correspondendo aos mesmos genes que estavam presentes nas matrizes de PCR. Vinte e oito também foram desregulados em matrizes de PCR (≥2.0 FC, P-value ≤0.01), correspondendo a 68% de validação cruzada (Tabela S5).
Mapa do calor dos dados de expressão foi construído utilizando distância euclidiana com ligação média. O mapa de calor das sondas desregulados com um fold-change ≥3.0 e um P-valor ≤0.001 é mostrado para CRA
vs
. NOR (A; mapa de calor completa na figura S1), para CRC
vs
. NOR (B), e CRC
vs
. CRA (C).
O CRA
vs
. NOR comparação mostrou mais diferenças do que o CRC
vs
. NOR comparação, e havia mais terra-regulamentação (68% em CRA
vs
. 54% em CRC) do que up-regulamentação (32% no CRA
vs
. 46% em CRC) . Uma análise cruzada de alterações nos níveis de sonda foi realizado (Figura 2A), que mostra uma assinatura de 954 sondas desregulados em ambas as amostras CRA e CRC, em comparação com mucosas normais (Tabela S6 e Figura S2), o que corresponde a 40% e 53% sondas desregulada em CRA e CRC, respectivamente. Todas as sondas comumente desregulados seguiu o mesmo tipo de variação em ambas as comparações,
i.
Foram para cima ou para baixo-regulado de forma semelhante.
Uma análise interseccional de alterações de nível da sonda foi realizada. Os valores-limite foram P-valor ≤0.01 e dobre-a mudança ≥2. O CRA
vs
. NOR comparação mostrou o maior número de mudanças de nível sonda (2.393 sondas desregulados), enquanto o CRC
vs
. comparação CRA apresentaram os menores (669 sondas desregulados). As sondas que mostraram alterações em duas ou nas três comparações foram de interesse. (A) Assinatura de 954 sondas desregulados em ambas as lesões CRA e CRC, em comparação com NOR. (B) Assinatura de 172 sondas desregulados na CRC em comparação com tanto CRA e NOR. (C) Assinatura de 265 sondas desregulados na CRC em relação ao CRA, que níveis já foram anormais em CRA, em comparação com NOR. (D) Assinatura de 44 sondas mostrando alterações nas três comparações (CRA
vs
. NOR, CRC
vs
. CRA e CRC
vs
. NOR). Abreviaturas: nem: mucosa normal colorretal; CRA: adenoma colorretal; CRC:. Câncer colorretal
Pathway Enriquecimento em colorretais lesões em comparação com a normal de mucosa
A análise via de KEGG mostrou 25 conjuntos de genes distinguir CRA da NOR, e 20 distinguir CRC de NOR ( P-valor ≤0.05; Tabela 2), considerando-se as sondas desregulados com 2 vezes de corte (P-valor ≤0.01 pelo
t
-teste com FDR). O complemento e de coagulação cascatas, interação receptor de citocina por citocinas e quimiocinas vias de sinalização estavam entre o topo das vias enriquecido em CRA
vs
. NOR, enquanto ciclo celular e replicação do DNA eram vias mais afetadas no CRC
vs
. NEM, de acordo com o valor P. Sete percursos foram enriquecidos em ambas CRA
vs
. NOR e CRC
vs
. NOR comparações, entre as quais a via de sinalização p53 era parte de vias enriquecidos já descritos na CRA [14]. metabolismo do nitrogênio também foi um caminho comumente enriquecido entre ambas as análises, e incluiu os anidrase carbônica (
CA1
e
CA4
) que faziam parte dos mais regulada sondas em CRA e CRC.
Se a diferença de corte 1,1 vezes, em vez de 2,0 foi aplicado para selecionar sondas desregulados (P-valor ≤0.01),
ou seja
. se todas as sondas desregulados foram consideradas (5 733 sondas), 18 gene define em vez de 25 foram alterados no CRA
vs
. NOR acordo com KEGG (P-valor ≤0.05; Tabela S7). Somente a via do complemento e de coagulação cascatas era comum entre as duas listas de genes 18 e 25. Portanto, 17 novos caminhos foram enriquecidos no CRA, como a replicação do DNA, do ciclo celular, spliceosome ou reparação incompatibilidade.
Gene Expression Profiling em Colorectal Adenocarcinomas na comparação com Colorectal adenomas
Uma análise dos diferencialmente detectados sondas entre CRC e CRA identificados 669 sondas desregulados (≥2.0 FC, P-valor de ≤0.01 pelo
t
-teste com FDR), correspondendo a 55% para cima e 45% para baixo-regulação. O mapa de calor das sondas desregulados com uma dobra de mudança de ≥3.0 e um P-valor ≤0.001 é mostrado na Figura 1C. A lista completa dos sinais da sonda diferencial em CRC
vs
. ANR é apresentado na Tabela S8. O CRC
vs
. comparação CRA mostraram menos diferenças de nível sonda com muito mais baixos dobrável alterações do que o CRC
vs
. NOR e CRA
vs
. NOR comparações. A análise cruzada de sinais da sonda mostraram uma assinatura de 172 sondas desregulados no CRC, em comparação com amostras de ambos CRA e NOR (Figura 2B, Quadro S9 e Figura S3), o que corresponde a 26% sondas desregulados em CRC
vs. CRA, e menos de 10% sondas desregulados em CRC
vs
. NEM. À medida que essas modificações não estavam presentes na CRA, eles podem ser marcadores de CRC agressividade.
Pathway Enriquecimento em Colorectal Adenocarcinomas na comparação com Colorectal adenomas
A análise via de KEGG revelaram cinco conjuntos de genes que distinguem CRC de CRA (P-valor ≤0.05; Tabela 2), considerando as sondas com um 2-fold de corte desregulamentado (P-valor ≤0.01 pelo
t
-teste com FDR). Duas vias enriquecidos foram específicos para o CRC
vs
. comparação CRA: arginina e prolina metabolismo, e TGF-
beta
via de sinalização que já foi descrita como uma via alterada entre CRA e CRC [9]. Além disso, o CRA
vs
. NOR e CRC
vs
. comparações CRA teve três vias comumente enriquecido, entre os quais a adesão focal e interação do receptor ECM faziam parte das vias já reportados enriquecidas em cólon carcinogênese [21]. Estes percursos podem desempenhar um papel importante na progressão da CRC, porque eles foram enriquecidos de NOR para CRA, e depois de CRA para CRC.
Assinatura Intermediário de progressão de Colorectal adenoma colorretal para Adenocarcinoma
a evidência da progressão de nEM a PCR, e, em seguida, a CRC, foi investigada com uma análise cruzada de alterações nos níveis de sonda. Uma assinatura de 265 sondas, que corresponde a 215 genes, foi identificada (Figura 2C, Tabela S10 e Figura S4), o qual foi coincidência nas listas dos 2,393 e 669 sondas desregulada, correspondente ao CRA
vs. NOR e CRC
vs
. comparações CRA, respectivamente. Ele incluiu sondas desregulados em CRC
vs
. CRA, que já eram distintos na CRA
vs
. NOR análise. As distribuições de eventos para cima e para baixo-regulados em CRC
vs
. CRA foram 69% e 31%, respectivamente. Uma análise enriquecimento da assinatura de 265 sondas foi realizada utilizando vias KEGG, e revelou que 41 genes eram parte de oito conjuntos de genes de enriquecimento, incluindo a adesão, a interação do receptor ECM focal ou TGF
beta
via de sinalização (Tabela S11). Além disso, uma assinatura de expressão do gene intermediário de 44 sondas (correspondentes a 40 genes) foi identificado assinaturas (Figura 2D e a Tabela 3), que era coincidente nas três listas de sondas desregulados, e, em seguida, foi parte de todas as assinaturas que anteriormente descrito ( de 954, 172 e 265 sondas). Ele correspondeu a 8 para cima e 32 genes regulados negativamente em ambas as amostras CRA e CRC, em comparação com a mucosa normal. Oito sondas demonstrou progressivamente aumentada sinais de NOR para CRA, e depois para CRC; 23 sondas reveladas diminuiu gradualmente sinais. Além disso, 13 sondas foram menos suprimida em CRC do que na CRA, em comparação com NOR.
Classificação de Colorectal adenomas em comparação com a normal de mucosa e colorretal Adenocarcinomas
A classificação do tecidos colorrectais foi realizada utilizando agrupamento hierárquico de alteração do sinal de sonda correspondentes aos quatro assinaturas anteriormente descritos. Apenas dois grupos foram distinguidos considerando a assinatura de 954 sondas (Figura S2): um foi composta de mucosas normais eo outro continha uma mistura de lesões colorretais. Em contraste, o agrupamento considerando a assinatura de 172 sondas permitiram fazer a distinção dos três tipos de tecidos colorrectais (figura S3): um grupo só foi composta por CRC, e o outro foi dividido em um subgrupo CRA e um subgrupo NOR. Da mesma forma, o agrupamento com a assinatura de 265 sondas permitiram distinguir os três tipos de amostras (Figura S4), mas um grupo só foi composto por CRAs, eo outro agrupados os NOR e CRC amostras que foram distribuídos em dois subgrupos distintos. Finalmente, a assinatura de 44 sondas mostraram que a maioria das ANR agrupado com os CRCs, alguns ANR (que mostra a histologia menos afectada) a ser agrupados com NOR amostras (figura 3). Para a maioria das amostras, nenhuma concordância estrita entre (subgrupos morfológicos ou localização) histológicos e dados moleculares foi reconhecido referente à distribuição das ANR em subgrupos. Da mesma forma, as especificidades do CRC agrupamento não foram explicadas por localização do tumor (Tabela S1). Os dados moleculares pode, assim, dar informações complementares para classificar as lesões colorretais.
Ramos representam amostras colorretais individuais. As cores diferentes foram utilizadas para identificar os grupos de amostra: vermelho, grupo de mucosas normais (N: normal); verde, grupo de adenomas (A: adenoma); azul, grupo de adenocarcinomas (C: câncer). A primeira anotação amostra corresponde ao grupo de amostra. Os subgrupos de adenomas são especificadas: A1, adenomas com áreas de adenocarcinomas micro-invasivos; A2, adenomas com áreas de adenocarcinomas intra-mucosa; A3, adenomas com áreas de displasia. A segunda anotação amostra corresponde ao número da amostra.
Exon em nível de análise em Colorectal adenomas
A CRA
vs
. NOR comparação foi realizada em Exon Human 1.0 matrizes ST (Affymetrix), e mostrou que 1.484 genes foram desregulados no CRA (590 para cima e 894 genes regulados negativamente; ≥1.5 FC, P-value ≤0.05; Tabela S12). Um mapa de calor correspondente é mostrado na figura S5. Um conjunto de transcritos desregulados em CRA
vs
. NEM foi analisado por RT-PCR quantitativo, e a taxa de validação de resultados de microarray Affymetrix foi de 83% (24 de 29 transcrições, também validados para a análise Agilent). Além disso, o CRA
vs
. NOR comparação mostrou grandes mudanças nos perfis de splicing alternativo: 1.852 exons foram desregulados no CRA (862 cima e 990 sub-regulada exons; ≥1.5 FC, P-valor ≤0.05; Tabela S13). Um banco de dados de expressão microarray publicamente disponíveis definidas a partir de 10 emparelhado amostras de tumores do normal CRC [6] foi baixado do site da Affymetrix, a fim de comparar perfis de splicing alternativo na CRA e CRC. O CRA
vs
. NOR e CRC
vs
. NOR comparações tinha 100 exons desregulados em comum. Enquanto 47 para cima e 47 eventos de splicing regulada para baixo seguido o mesmo tipo de variação nas duas comparações, alguns regulamentos foram oposto em PCR e CRC, que corresponde a 6% de exões desregulados comuns (dados não mostrados). Nós descobrimos que 296 desregulamentado (102 para cima e 194 sub-regulada) sondas no CRA
vs
. Nem da Agilent análise mostrou exões desreguladas na análise de Affymetrix (dados não mostrados). Um grande número de genes que faziam parte das vias alteradas teve exons desregulados. Entre os 40 genes da assinatura Agilent transcricional de 44 sondas, 8 (
CFH
,
CRYAB
,
DPT
,
FBLN1
,
ITIH5
,
NR3C2
,
SLIT3
e
TIMP1
),
ou seja
. 20 exons%, tinha desregulados (Tabela S14).
Discussão
O objetivo deste estudo foi investigar, ao nível de todo o transcriptoma, o grau de variações que ocorrem em adenomas colorretais humanos em comparação com os adenocarcinomas, tendo o epitélio normal como uma referência. Muitas mudanças foram evidentes no CRA
vs
. NOR, mais ainda do que no CRC
vs
. NEM. Assim, CRA, como um tipo de lesão intermediária, já exibia sinais fortes de alterações. A partir das mudanças moleculares evidenciados nas CRA, é evidente que as ANR não são apenas acumulando alterações que serão todos encontrados em CRCs. Possivelmente, a evolução de CRCs segue uma expansão clonal mais rigorosamente, o que pode levar à selecção de alterações genéticas importantes para o crescimento clonal, enquanto eliminando modificações menos relevantes. De acordo com esta hipótese, CRAs podem ter resultados diferentes, alguns estão a evoluir para o câncer, enquanto outros poderiam ser propenso ao desaparecimento. Foram identificados quatro assinaturas que distinguem os tipos de tecidos colorretais e mostrou que um conjunto de 40 genes poderia ser de interesse específico, marcando as alterações moleculares que distinguem a mucosa normal da CRA e CRC. É importante ressaltar que vários eventos de splicing alternativo de pré-mRNA também foram característicos da CRA para a progressão da CRC.
Vários genes implicados na CRC foram desregulados na CRA
vs
. NEM. Os maiores aumentos nos níveis de sonda incluída
KIA1199
que já tinha sido encontrado desregulamentado no CRA [22], ou a metaloproteinase matriz
MMP7
que a sobre-expressão é conhecida por influenciar a carcinogênese colorretal precoce [23 ]. Quinze conjuntos de genes, tais como aqueles que estão envolvidos na interacção citocina-receptor de citocina, quimiocina via de sinalização, ou moléculas de adesão de células, eram específicos para PCR
vs. NEM. Importante, várias novas vias biológicas enriquecidos foram identificados, entre os quais a via do complemento e coagulação cascatas foi a mais afectada significativamente na análise da Agilent, e também foi identificado como alterado na análise de Affymetrix (dados não mostrados). Isto está de acordo com um relatório recente sugere que os componentes da cascata de coagulação poderia influenciar a progressão do câncer [24].
Uma série de genes também foram expressos diferencialmente no CRC
vs
. CRA. A maioria destes genes não foram descritos em estudos anteriores de microarray, embora várias das alterações concordou em relatórios anteriores, incluindo as variações nos níveis de AMN, THBS2, SPP1 ou TIMP1 expressão [25], [26], [27]. Além disso, 58 sondas (19 cima e 39 para baixo-regulado) do CRC
vs
. comparação CRA estavam entre uma lista de 248 sondas identificadas anteriormente [11], incluindo as que, para
AURKA
, que codifica para uma quinase regulada pelo ciclo celular envolvidos em CDC [28], e foi sobre-expresso em CRC conforme em comparação com ANR e NOR. Além disso, entre nossos principais desregulamentado sondas,
SPON2
,
RGS16
,
SFRP4
e
CTHRC1
já foram encontrados entre os mais up-regulada sondas em CRC em relação ao CRA, e
FAM55D
,
ATOH8
,
RETNLB
,
ID4
,
UGT1A6
e
VSIG2
, entre os mais sondas para baixo-regulados [11]. Já foi demonstrado que alguns destes genes foram desregulados em cancros epiteliais ou associados, tais como
SFRP4
,
SPON2
[29],
RGS16
[30], ou
UGT1A6
[31].
foram identificadas alterações de expressão de genes específicos em qualquer tipo de lesões colorretais, graças a análises intersetoriais (Figura 2). Em primeiro lugar, 1.218 (51%) sondas desregulados eram específicos para a transição nem CRA e, em seguida, poderia marcar CRA baixo risco, porque não havia nenhuma ligação com o CRC. Em segundo lugar, 723 (40%) sondas desregulados foram específicos para CRC
vs
. NOR, e depois poderia marcar especificamente CRC. Finalmente, 276 (41%) desregulados sondas foram específicos para a PCR para a transição de CRC. O último conjunto de sonda poderia ser interessante para definir eventos específicos para as etapas finais da progressão do câncer.
A assinatura de 954 sondas corresponderam a genes que mostram alterações de expressão em ambas as amostras CRA e CRC, em comparação com a mucosa normal. Como estas sondas desregulados em CRC também foram expressos de forma anormal no CRA, foram os marcadores candidatos improváveis da progressão da CRA para CRC. Por conseguinte, o agrupamento hierárquico não permitia distinguir CRAs de CRCs. A assinatura de 172 sondas, correspondente a genes desregulados na CRC em comparação com tanto CRA e NOR, poderia marcar especificamente CRC e, apoiando esta hipótese, o agrupamento hierárquico identificou o CRCs como um único grupo. A assinatura de 265 sondas correspondentes a genes desregulados no CRC
vs
. CRA, que já foram anormalmente expresso em CRA
vs
.