Abstract
Fundo
instabilidade genómica com DNA frequentes alterações no número de cópias é uma das características fundamentais da carcinogênese . As regiões cromossômicas com frequentes ganho de número de cópias de DNA e perda de câncer gástrico humano ainda são mal definidos. Permanece desconhecido como o número de cópias de ADN variações contribui para as mudanças de perfis de expressão gênica, especialmente no nível global.
principais conclusões
Foram analisadas as alterações no número de cópias de DNA em 64 amostras de cancro gástrico humano e 8 linhas celulares de cancro gástrico utilizando agregados bacterianos cromossomo artificial (BAC) com base hibridização genômica comparativa (aCGH). A análise estatística foi aplicado para correlacionar os dados de expressão de genes previamente publicados obtidos a partir de cDNA microarrays com os correspondentes dados de variação do número de cópias de ADN para identificar candidatos oncogenes e genes supressores de tumor. Descobrimos que amostras de câncer gástrico apresentaram variações no número de cópias de DNA recorrentes, incluindo ganhos em 5p, 8q, 20p, 20q, e perdas no 4T, 9p, 18q, 21q. As regiões mais frequentes de amplificação foram 20q12 (7/72), 20q12-20q13.1 (12/72), 20q13.1-20q13.2 (11/72) e 20q13.2-20q13.3 (6/72) . A região eliminada mais frequente foi 9p21 (8/72). Correlacionando dados de matriz de expressão gênica com aCGH identificou 321 oncogenes candidatos, que eram overexpressed e mostraram número de cópias de DNA frequente ganhos; e 12 candidatos genes supressores de tumor que foram regulados negativamente e mostrou perdas frequentes no número de cópias de DNA em cancros gástricos humanos. Três redes de genes expressos de forma significativa em amostras de câncer gástrico foram identificadas por análise de caminho ingenuidade.
Conclusões
Este estudo fornece insights sobre as variações no número de cópias de DNA e sua contribuição para perfis de expressão genética alterada durante gástrico humano desenvolvimento de câncer. Ele fornece oncogenes novos motorista candidato ou genes supressores de tumor para o cancro gástrico humano, mapas via úteis para o futuro entendimento da patogênese molecular desta doença maligna, e a construção de novos alvos terapêuticos
Citation:. Fan B, Dachrut S, Coral H, Yuen ST, Chu KM, Direito S, et al. (2012) Integração de DNA copiar o número de alterações e transcricional análise da expressão em câncer gástrico humano. PLoS ONE 7 (4): e29824. doi: 10.1371 /journal.pone.0029824
editor: Reiner Albert Veitia, Institut Jacques Monod, França |
Recebido: 19 de setembro de 2011; Aceito: 03 de dezembro de 2011; Publicação: 23 de abril de 2012
Direitos de autor: © 2012 Fan et al. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Licença Creative Commons Attribution, que permite uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o autor original ea fonte sejam creditados
Financiamento:. Este trabalho é apoiado pelo financiamento concedido pela University of Cancer Research California Coordenar Comitê para XC. BF é suportado por contrato No.2010601079 ao China Scholarship Council. Os financiadores não tiveram nenhum papel no desenho do estudo, coleta de dados e análise, decisão de publicar ou preparação do manuscrito
CONFLITO DE INTERESSES:.. Os autores declararam que não existem interesses conflitantes
Introdução
o câncer gástrico é um dos tumores malignos mais comuns ea segunda causa mais comum de morte relacionada com câncer em todo o mundo [1]. O principal tipo de cancro gástrico é o adenocarcinoma, o que pode ainda ser subdividida em tipo intestinal e do tipo difuso [2]. lesões do tipo intestinal são muitas vezes ulcerativa e ocorrem no estômago distal. Difusa do tipo lesões estão associadas a um prognóstico pior do que o tipo intestinal. O tratamento cirúrgico é a única modalidade terapêutica que tem um efeito potencialmente curativa para câncer gástrico. O prognóstico dos pacientes com câncer gástrico depende muito do estágio clínico e patológico da doença no momento do diagnóstico. As taxas de sobrevida em 5 anos após a queda curativa ressecção cirúrgica de 60-90% na fase I com apenas 10-25% para pacientes em estágio III da doença [3]. pacientes de câncer mais gástricas são identificados na fase avançada, o que leva ao prognóstico sombrio.
As alterações genéticas são eventos-chave no desenvolvimento da maioria dos tumores, incluindo o câncer gástrico [4]. Estudos sugerem que a progressão do tumor depende da aquisição sucessiva de aberrações cromossómicas que levam a ganhos ou perdas de parte do genoma da célula tumoral. Portanto, a caracterização de anomalias genómicas podem ajudar a elucidar a patogénese molecular de cancro gástrico, bem como revelam os marcadores genéticos de progressão. Baseada em array hibridização genômica comparativa (aCGH) é um poderoso método utilizado para identificar alterações no número de cópias de DNA patogênicos em uma escala de todo o genoma [5]. aCGH foi aplicado a uma série de tumores sólidos, incluindo o cancro gástrico [6], [7]. Tem sido demonstrado ser útil na identificação de novos oncogenes e genes supressores de tumores, e para classificar tumores com base nas alterações genéticas.
Expression profiling experiências identificaram um grande número de genes que são expressos diferencialmente em normal e tumoral tecidos. No entanto, a maioria destes genes são susceptíveis de ser genes de passageiros, que têm contribuição para a tumorigénese limitados. O principal desafio tem sido identificar oncogenes de controladores ou genes supressores de tumor que desempenham papéis importantes na iniciação e progressão tumoral, DNA número de cópias variação genômica é um importante tipo de alteração genética observada em células tumorais, e contribui para a evolução do tumor por alterações da expressão de genes dentro da região [8]. DNA número de cópias ganhos e perdas não são aleatórias, mas sim representar eventos genéticos consistentes durante a carcinogênese. Identificação de genes que são sobre-expressos e amplificados ou sub-expressos e excluídos pode ser benéfico porque esses genes podem representar alterações genéticas motorista.
Estudos anteriores relataram alterações no número de cópias de ADN ou perfis de expressão em amostras de câncer gástrico . Os estudos também identificaram ganhos comum cromossômicas e perdas, bem como centenas de genes que podem distinguir tumores de tecidos normais [6], [9]. No entanto, poucos estudos investigaram a associação entre variações no número de cópias de ADN e perfis de expressão de transcrição. Neste artigo, foi realizada a análise aCGH em um grande número de amostras de cancro gástrico humano. Além disso, a análise integrada de variações no número de cópias de DNA e correspondentes valores de expressão gênica foi realizada para identificar genes importantes que podem contribuir para a fisiopatologia do câncer gástrico. Um total de 321 oncogenes candidatos e 12 genes supressores de tumor candidato foram identificados através da análise.
Materiais e Métodos
Declaração de Ética
O uso de amostras gástricas de arquivamento para a corrente estudo foi aprovado pelo Comitê de Ética da Universidade de Hong Kong e da revisão interna Conselhos de Universidade da Califórnia, San Francisco.
amostras de tumores, linhagens celulares e DNA, RNA Preparação
amostras tumorais foram coletados a partir de amostras gastrectomia do Departamento de Cirurgia, Hospital queen Mary, Universidade de Hong Kong. Oito linhas celulares de cancro gástrico, AGS BGC823, N87, NUGC3, SNU16, SNU5, KATOIII e MNK45 foram descritas nas nossas publicações anteriores [10]. O DNA genômico foi extraído utilizando o kit de purificação Genomic DNA (Qiagen, Valencia, CA).
Os parâmetros clínico-patológicos dos tumores foram previamente publicados [11]. Os tumores foram classificados utilizando a classificação dos intestinal e difuso, misto de Lauren, e tipos indeterminados [2]. A presença de H. pylori nas amostras gastrectomia foi determinada por exame histológico e suplementado por coloração de Giemsa modificado. A presença de EBV em células de cancro foi analisada por hibridação in situ para EBER como previamente descrito [12]. Os estágios tumorais foram definidas pelas regras gerais para gástrico Cancer Study dos japoneses Sociedade de Pesquisa para o Câncer Gástrico [13].
baseada em matriz CGH
Humanos 1.14 matrizes foram obtidas a partir do cancro da UCSF Disposição núcleo central (https://cc.ucsf.edu/microarray/). Eles consistiu de 2353 clones bacterianas cromossomo artificial (BAC) que cobriam o genoma humano em 1,5 Mb resolução. Para a hibridação, 1 ug de ADN de tumor e 1 ug de ADN de referência género combinado foi marcado por iniciação aleatória utilizando Cy3-dCTP e Cy5-dCTP, respectivamente, com o Kit Bioprime (Invitrogen). nucleótidos fluorescentes não incorporados foram removidos utilizando uma coluna de Sephadex G-50 (Amersham, Piscataway, NJ). A amostra de ADN de referência e foram misturados com 100 ug Cot-1, precipitado e ressuspenso em solução de hibridação. A solução de hibridização foi desnaturado durante 10 min a 72 ° C e, em seguida, incubadas durante 1 h a 37 ° C. A hibridação foi realizada durante 48-72 horas numa câmara húmida sobre uma mesa de oscilação lenta. As matrizes foram lavadas durante 10 minutos em formamida a 50% e 2 × SSC a 45 ° C, e 10 min em tampão de fosfato à temperatura ambiente. As lâminas foram montadas nas soluções de montagem contendo 0,3 ug /ml de DAPI. Três imagens de intensidade de cor única (DAPI, Cy3 e Cy5) foram coletadas para cada matriz usando uma carga acoplada câmera do dispositivo.
baseada Matriz de Análise de Dados CGH
O software UCSF SPOT [14] foi utilizado para as manchas segmento automaticamente com base nas imagens DAPI, executar correcções de fundo locais, e calcular vários parâmetros de medição, incluindo os rácios log2 do total de intensidades Cy3 e Cy5 integrados para cada ponto. Os dados brutos da aCGH estão disponíveis no GEO (número de acesso: GSE33501).
SPROC programa foi usado para associar identidades clone e um arquivo de informações de mapeamento com cada ponto modo que os dados podem ser plotados em relação à posição de os BACs. As aberrações cromossómicas foram classificados como um ganho quando o Cy3 log2 normalizada /rácio Cy5 era 0,225 e como uma perda quando a proporção foi de -0,225. O número foi determinado como 3 vezes o SD média de normal versus hibridação normais aCGH. As amplificações foram identificados quando o Cy3 log2 normalizada /rácio Cy5 era 0,8. Do mesmo modo, foram identificados deleções quando o Cy3 log2 normalizada /rácio Cy5 era -0,7. Vários ganhos, perdas e amplificações foram contados como eventos separados. O limiar de ganho ou perda de um braço cromossomo inteiro foi definido como o rácio médio log2 de 0,225 ou . -0,225 Para todos os clones no braço cromossomo
análise estatística dos dados
as amostras foram classificadas com base nos resultados experimentais e comparados com os dados clínicos (Tabela S1) usando análise significativa de análise de microarray (SAM) [15]. copiar DNA alterações numéricas, incluindo porcentagem mediana de ganho e perda. amplificação frequente e eliminação foram analisadas usando CGH explorer 3.2 (https://www.ifi.uio.no/forskning/grupper/bioinf/Papers/CGH/). “Análise de erros de cópia” (ACE) foi realizada utilizando uma taxa de descoberta de falsas (FDR) de 0,0001 e sensibilidade média. Clustering de todas as amostras foi realizada em TreeView versão 1.60.
software R /Bioconductor, incluindo o programa CBS, foi usado para calcular a correlação entre a variação do número de cópias e a expressão do gene. Os dados dos 6688 clones de ADNc utilizadas na análise da expressão do gene anterior [11], [16] (GEO número de acesso: GSE2701) expressão foi recuperado. posição mapeamento para esses clones de cDNA foram atribuídos utilizando o conjunto do genoma NCBI, acessado através do banco de dados do navegador genoma UCSC (NCBI construir 35). Os dados aCGH foi segmentada usando segmentação binário circular (CBS), tal como aplicado no pacote de cópia de DNA no R /Bioconductor para traduzir medições de intensidade experimentais em regiões de números de cópias iguais. Faltando valores para mapeamento clones dentro das regiões segmentadas de números de cópias iguais foram imputados, utilizando o valor do segmento correspondente. Os clones de expressão de genes foram mapeados para o clone BAC dentro de 1 Mb do clone expressão do gene que apresentou a maior correlação de Pearson entre o número de cópia e expressão do gene. valores “suavizadas” da CBS com a razão log2 originalmente observado para os clones outlier descritos acima e os valores imputados para valores em falta foram considerados em correlação com a expressão do gene de computação. Correlação só foi computado para clones, e um coeficiente de correlação de 0,29 foi utilizado como ponto de corte para identificar clones que têm correlação positiva entre o número de cópias e a expressão do gene.
p
-Valores para a expressão do gene e copiar correlações números foram obtidos com base em permutação. Os rótulos de dados de expressão foram misturadas aleatoriamente ea correlação de Pearson entre clones de expressão gênica e número de cópias clones BAC foram calculados como descrito anteriormente. Isto foi repetido 1000 vezes. Para cada clone de expressão do gene, o valor de p foi determinada como a percentagem de vezes que a correlação com base permutação foi maior do que ou igual à correlação observada. O
p
-Valores foram então corrigidos para vários testes, controlando para a taxa de descobrir falsas (FDR), utilizando o método Benjamini-Hochberg [17].
A análise funcional dos genes significativas foi realizada usando software Ingenuity Pathway (Ingenuity Systems, Redwood City, CA).
resultados
baseada em matriz Análise CGH de câncer gástrico humano
para identificar o DNA alterações no número de cópias em gástrica cancros, aplicamos BAC aCGH 64 amostras de tecido de câncer gástrico humano e 8 linhas celulares de cancro gástrico. Os dados brutos estão disponíveis na Tabela S2. Observamos variações cromossômicas recorrentes nestas amostras, e foram identificadas as regiões com o número de mudanças de cópias de ADN significativos. A trama de frequência e aberração gráfico resultante dos ganhos e perdas são mostrados na Figura 1A e Figura 1B, respectivamente. Dois lotes relação genome-wide representativos de tumor gástrico individuais são mostrados na Figura S1. As variações mais comuns no número de cópias de DNA neste conjunto de tumores gástricos humanos como determinado pela percentagem média de ganho ou perda incluiu ganhos de 5p, 8q, 20p, 20q, e as perdas de 4T, 9p, 18q, 21q.
(A) frequência global de alterações no número de cópias de DNA por aCGH. A análise de frequência medido como uma fracção dos casos de ganhos ou perdidos ao longo de todos os clones BAC sobre as matrizes. Os dados apresentados foi ordenada pela posição do mapa cromossômico dos clones. barras inferiores representaram perdas e barras superiores representaram ganhos. As barras verticais púrpura representado o limite entre cada cromossoma. alterações numéricas (B) de cópias de ADN em cada um amostras de câncer gástrico. 72 amostras de tumor foram ordenados de cima para baixo. colunas vermelhas representada cópia ganhos de números e colunas verdes perdas no número de cópias representados.
Em seguida, analisamos DNA variações no número de cópias em amostras de câncer gástrico com diferentes características clínico-patológicas, incluindo estágio do tumor, tipo de tumor, local do tumor , diferenciação tumoral, a Helicobacter pylori e a infecção por EBV, bem como a diferença entre as amostras de tumor gástrico e linhas celulares, (Figura S2, S3, S4, S5, S6, S7, S8 e Tabela S3). Encontramos aberrações cromossómicas específicas enriquecidas em certas características clínico-patológicas. Por exemplo, a perda de 19p foi mais frequentemente observada em estágio 1 fase 2 tumores (20%) do que na fase 3 estágio 4 amostras (3,41%) (Tabela S3). perda 16p foi identificada em 10% das amostras negativas por Helicobacter pylori, em comparação com 0% nos amostras positivas Helicobacter, enquanto que o ganho de 16P foi observada em 14,71% do Helicobacter pylori amostras positivas, mas apenas em 3,33% das amostras negativas por Helicobacter (Tabela S3 ). Estes resultados sugerem a possível contribuição de genes dentro de regiões específicas para fenótipos tumorais específicas.
amplificações de alto nível e deleções são resumidos na Tabela S4. A amplificação mais frequente foi encontrado no braço longo do cromossomo 20. Nesta região, quatro amplicons focais separados poderiam ser identificados: 20q12 (7/72), 20q12-20q13.1 (12/72), 20q13.1-20q13. 2 (11/72) e 20q13.2-20q13.3 (6/72). A segunda amplificação mais freqüente, ocorrendo no braço longo do cromossomo 8, também teve quatro amplicons separados focais: 8q23.1 (3/72), 8q24.1 (7/72), 8q24.12-8q24.2 (6 /72) e 8q24.2 (6/72). A região de deleção homozigótica mais frequente foi encontrado em 9p21 (8/72) e no 18q22 (6/72). Outros amplificações de alto nível e deleções ocorreu em frequências relativamente mais baixos. Exemplos de aberrações frequentes são mostrados na Figura 2. Alguns oncogenes bem caracterizados (por exemplo,
HER2, TOP2A, ciclina, TGFB1, AKT2, MYC
) e genes supressores tumorais (por exemplo,
P16, SMAD4, SMAD7
) são encontrados para ser localizada nestes loci. Curiosamente, um maior número de amplificações e deleções foram identificados em linhas de células do que nas amostras de tumor de cancro gástrico primários.
Os clones foram ordenados por sua posição de PTER (esquerda) para qter (à direita). Os rácios de log2 de cada clone nestes casos específicos foram representados como gráficos de linhas quebradas com cor diferente. Vários claras número de cópias mudanças (ganhos, perdas, amplificações e exclusão) pode ser reconhecido. O centro do fragmento amplificado e núcleos de deleção homozigótica foram indicados em conjunto com genes em cada região do núcleo. (A) A amplificação em 17q11.2-17q21. (B) Amplificação em 19q12-19q13.1. (C) Amplificação em 8q24.1-8q24.2. (D) deleção homozigótica em 18q21.1. (E) deleção homozigótica em 9p21. (F) deleção homozigótica em 16q23. (G) deleção homozigótica em 18q12.
Contribuição Número Genomic DNA Copiar Variação para gênica global muda de expressão em humanos câncer gástrico amostras
Em nosso estudo anterior, informou a expressão gênica perfil em 90 amostras de câncer gástrico primário em comparação com os seus 14 homólogos metastáticos e 22 mucosa gástrica não-neoplásica, com 6688 clones de cDNA mostrando variação significativa através destas amostras [11], [16]. Entre as 90 amostras com câncer gástrico, 62 espécimes foram incluídos no estudo atual aCGH. A fim de determinar se o número de cópias de ADN genómico variações contribuir para alterações globais padrão de expressão do gene, determinou-se a correlação entre os valores de expressão do gene e o número de cópias de ADN correspondente mudanças nestas 62 amostras de cancro gástrico humano por um gene por base gene. Do cDNA de 6688 nos estudos de expressão originais, 5719 clones de ADNc com a informação de posição foram recuperadas para esta análise. Destes 5719 clones de cDNA, 1352 clones de cDNA (23,6% dos clones totais de cDNA analisados), o que representa cerca de 973 genes únicos, apresentou correlação estatisticamente significativa entre os valores de expressão e variações no número de cópias de DNA (correlação 0,29 e valor p ajustado inferior a 0,01 com FDR menos de 3,4%. Veja a Tabela S5 para a lista de genes). Para ilustrar se a expressão do gene de números de cópias de ADN influência, comparou-se a correlação sábio par de dados de expressão de genes, quer com valores aCGH de BAC clones perto do local em que cada gene está localizado no (diagonal), ou valores aCGH de clones BAC localizados na outra regiões do genoma. Encontramos pares de regiões ao longo da diagonal têm maior correlação positiva (correlação média ~0.12) do que os pares fora da diagonal (correlação média ~0.0) (Figura S9A). A heatmap da correlação de pares entre a expressão do gene e copiar o número também demonstra a correlação positiva ao longo da diagonal (Figura S9B).
No geral, nossos dados confirmam que no número de cópias de DNA genômico variações contribuir para a regulação da expressão gênica regionais perfis em amostras de câncer gástrico humano.
identificação do Candidato Oncogene ou genes supressores de tumor de câncer gástrico humano
para identificar oncogenes candidatos ou genes supressores de tumor, foi aplicado dois critérios para a lista de 1352 cDNA clones que mostraram correlação estatisticamente significativa entre a expressão do gene e alterações no número de cópias de ADN correspondentes. Em primeiro lugar, temos procurado por genes que mostraram mais 5 ganhos do que perdas ou 5 mais perdas do que ganhos em amostras de câncer gástrico. A seguir, corresponde à lista de genes com os 3329 clones de ADNc que foram identificados para ser diferencialmente expressos entre os tecidos gástricos que não de tumor e amostras de cancro gástrico humano [11]. Assim, reduzimos nossa lista de 363 clones, o que representa 333 genes únicos (Tabela S6). Entre estes genes, 321 genes foram sobre-regulada em amostras de cancro gástrico, sendo frequentemente adquirida ou amplificado a nível de ADN genómico. Os restantes 12 genes foram regulados negativamente em amostras de câncer de estômago e foram frequentemente excluídos no nível do DNA genômico. Estes dois conjuntos de genes, portanto, representam oncogenes potenciais candidatos ou genes supressores de tumor, respectivamente, os quais podem estar envolvidos na patogênese do câncer gástrico e de desenvolvimento.
DNA número de cópias muda com a valores de expressão gene correspondente em agrupamentos de genes selecionados nos cancros gástrico humano
Para ilustrar ainda mais como número de cópias de DNA variações influenciam a expressão do gene, foram analisados os padrões de 333 oncogenes candidatos e genes supressores de tumor nas 62 amostras com câncer gástrico utilizando agrupamento hierárquico (Figura 3A) de expressão. Não foram identificadas associações entre o padrão de agrupamento e as características clínicas (Figura S10), sugerindo que estes genes não fornecem valores adicionais para a classificação molecular de câncer gástrico humano. Curiosamente, vários grupos de genes foram encontrados para ser localizado nas mesmas regiões cromossômicas, incluindo genes localizados em 6p21.3-p21.1, 7q21-q22, 8q21-q24, 8q24.3, 12q14-q15, 20q11-q13 e 20q13. 3 (Figura 3B para 3H). Uma forte correlação geral entre a expressão regulada coordenado destes agrupamentos de genes e de cópias de ADN ganhos número nas regiões cromossômicas correspondentes foi observado (Figura 3B a 3h). Ele sugere que a variação do número de cópias de DNA é um dos principais contribuintes para a variação destes genes dentro do cluster expressão.
(A) de agrupamento hierárquico dos padrões de variação na expressão de oncogenes e supressores de tumor genes 333 candidatos (da tabela S6) em 62 tumores gástricos. Cada linha representa um clone de ADNc separado no micro-arranjo e cada coluna representa o padrão de expressão de uma amostra de tumor ou tecido separado. A relação de abundância de transcritos de cada gene significativo a sua abundância em todas as amostras de tecido foi representado de acordo com a escala de cor mostrado na parte inferior. Cinza indicada dados perdidos ou excluídos. O dendrograma na parte superior da figura representa o agrupamento hierárquico dos tumores baseados na similaridade no seu padrão de expressão destes genes. (B) a (H) do número de cópias de ADN em comparação com alterações nos valores de expressão de gene correspondente em agrupamentos de genes seleccionados em cada amostra de tumor individuais. Veja a Tabela S8 para dados completos.
Análise Caminho de Genes significativamente Expresso
O software Ingenuity Pathway Analysis (IPA) foi empregada para investigar as interações entre os oncogenes candidatos ou genes supressores de tumor identificado por matriz expressão e aCGH. A Figura 4 mostra as três redes mais significativos de interacção em amostras de cancro gástrico. Rede 1 foi especificamente associada com o câncer, renais doença urológica, e ciclo celular. Rede 2 foi especificamente associada com o desenvolvimento de tecido conjuntivo e função, cancro, e doença gastrointestinal. Rede 3 foi especificamente associada a distúrbio genético, esquelético desordens musculares, e doença inflamatória (Tabela S7). Todas as redes atingiu uma pontuação de 21 ou superior e continha 11 ou mais genes, o que demonstra o extenso relacionamento e interação entre os genes significativamente regulados em cancro gástrico. Principais funções biológicas destes genes estavam relacionados ao ciclo celular, replicação do DNA, recombinação e reparação, produção de energia e metabolismo do ácido nucleico (Figura S11). Todas estas funções são conhecidas por estarem envolvidas na tumorigênese, proporcionando possíveis ligações entre os oncogenes candidatos identificados e genes supressores de tumor durante o desenvolvimento de câncer gástrico
.
redes Ingenuity gerados pelo mapeamento dos oncogenes candidatos e genes supressores tumorais identificadas por análise integrada da matriz de expressão e de dados aCGH. Cada rede foi graficamente com genes ou produtos de genes, os nós (diferentes formas representadas as classes funcionais dos produtos do gene) e as relações entre os nós biológicos como arestas (linhas). O comprimento de uma aresta refletiu a evidência na literatura apoiando essa relação nó-a-nó. A intensidade da cor nó indicado o grau de para cima (vermelho) ou a regulação negativa (verde) do respectivo gene. Genes em notas sem cor não foram identificados como diferencialmente expressos em nossa experiência e foram integrados nas redes computacionalmente gerados na base da evidência armazenado na memória do conhecimento IPA indica uma relevância para esta rede. Uma linha a cheio sem seta indicada interacção proteína-proteína. Setas indicam a direção da ação (com ou sem ligação) de um gene para outro.
Discussão
alterações no número de cópias do gene são particularmente importantes como desregulamentação eventos na progressão do câncer. Neste estudo, foram analisados Copiar Número Aberrações (CNAs) através de array CGH. Os ganhos e perdas frequentes foram identificados a partir do estudo. Além disso, as regiões cromossómicas com níveis elevados de amplificações e deleções foram também descritos. Além disso, a correlação entre a expressão de genes e de DNA CNAs foram investigados. candidatos oncogenes e genes supressores de tumores foram identificadas através da realização de análises de número de cópias integradas do genoma e expressão de genes. Finalmente, as relações entre estes genes candidatos e sua função biológica foram descritos em 3 redes que utilizam a análise via Ingenuity. Os dados confirmam que a combinação de análise aCGH e expressão do gene de matriz é um método potente para identificar candidatos oncogenes ou genes supressores de tumores em cancro gástrico humano. Consistente com este papel, estudos anteriores têm aplicado abordagens semelhantes para identificar eventos genéticos motorista em outros tipos de tumores, como câncer de fígado [18] e cancro da mama [19]. Curiosamente, mais oncogenes candidatos foram identificados de genes supressores de tumor candidato do nosso estudo. Pode ser explicado pela maior magnitude possível intervalo de ganho em comparação com a perda de tumor em amostras combinadas com rácios compactados a partir de células não tumorais misturados. A diferença no número de genes podem também sugerem que a expressão de oncogenes pode ser mais profundamente regulada por CNA de genes supressores de tumores são.
Na análise aCGH, os ganhos e amplificações frequentes foram detectadas em amostras de cancro gástrico. De nota, consistente com estudos anteriores [20], [21], 20q foi o local mais frequente de ganho detectados em amostras de câncer gástrico. Amplification em 20q também tem sido relatada em vários outros tipos de câncer, como câncer de mama [22] e câncer pancreático [23]. Em nosso estudo, amplificações de alto nível foram encontrados em 20q12-q13.3 no câncer gástrico. Vários genes estão localizados neste locus, como
AIB1
e
BCAS1
.
AIB1
(20q12), um co-ativador do receptor esteróide encontrado pela primeira vez amplificado na mama e cancro do ovário, está envolvido na proliferação de células de câncer gástrico através da interação com receptores nucleares [24].
BCAS1
(20q13.2), carcinoma da mama amplificado sequência 1, está amplificado em uma variedade de tipos de tumores e está associada com fenótipos de tumor mais agressivo. expressão de
BCAS1
-regulada é significativamente correlacionada com a amplificação de alto nível de 20q13 em adenocarcinomas da junção gastro-esofágica [25]. 8q foi o segundo local mais comum de ganho, uma vez que foi detectada em 26,39% das amostras. Amplification em 8q foi identificada em muitos tipos de câncer, como câncer de mama e câncer pancreático [23], [26]. Em nosso estudo, amplificações de alto nível foram encontrados em 8q24.1-q24.2 no câncer gástrico. Vários genes estão localizados neste locus.
MYC
é o mais representativo. É um dos oncogenes mais estudados, o que contribui para a malignidade de muitos cancros humanos agressivos e indiferenciadas diferentes [27]. O efeito patológico de
MYC
tem sido atribuída à sua capacidade de controlar os processos de multiplecellular como o crescimento celular, diferenciação, apoptose, DNA danos resposta, instabilidade genômica, angiogênese e invasão tumoral [28].
Outra amplificação de alto nível importante foi encontrado em 17q12-q21. Os genes representativas localizadas neste locus é
ERBB2
. A sobre-expressão e /ou amplificação tem sido observada em muitos tipos de cancros, incluindo o cancro gástrico [29], [30], [31]. Correlação entre
ERBB2
amplificação e superexpressão é observado comparando aCGH e dados de matriz expressão em nosso conjunto de dados câncer gástrico (Figura S12). A sobre-expressão e amplificações foram identificados em apenas um pequeno número (~ 6 de 72) das amostras de cancro gástrico. Isto pode explicar porque ERBB2 não foi selecionado na lista oncogene candidato correlacionados, pois não passar os critérios como um dos genes diferencialmente expressos. No entanto, o resultado sugere claramente que a amplificação de 17q12-q21 pode representar um mecanismo chave para níveis elevados de expressão ERBB2 num subconjunto de amostras de cancro gástrico humano. pacientes com câncer gástrico com amplificação de 17q12-q21 podem beneficiar do tratamento com Herceptin, um anticorpo humanizado, projetado para atacar e bloquear a função de ErbB2.
De acordo com o estudo de
Gorringe KL, et al
, também foram identificados amplificações em 6p21 e 5p13 em nossa matriz de resultados CGH [7]. É curioso notar que um número desproporcionadamente mais elevados de amplificações de alto nível e deleções foram identificados em linhas de células de cancro gástrico em comparação com amostras de tecido. A observação indica que estas amplificações ou supressões podem fornecer vantagens de crescimento durante
in vitro de cultura de células
, e, portanto, são enriquecidas em linhas celulares. Os resultados destacam a importância destas amplificações de alto nível e deleções na regulação da proliferação celular ou sobrevivência. As linhas celulares com estas amplificações ou supressões fornecer excelentes recursos para ajudar um estudo mais aprofundado dos papéis funcionais dos genes nestas regiões durante o desenvolvimento do câncer gástrico.
Estudos anteriores têm fornecido insights sobre a importância das alterações no número de cópias específicas no desenvolvimento de tumores epiteliais, mostrando que estas alterações podem levar à expressão de oncogenes alterados críticos ou supressores de tumor [21], [31], [32]. portanto, o nosso estudo confirma esses relatórios anteriores e fornece provas para apoiar essa CNA representa um fator importante na regulação do anormal cima ou para baixo-expressão destes genes durante a carcinogênese câncer gástrico. No entanto, a maioria dos genes identificados a partir de nossos estudos são ainda susceptíveis de ser genes passageiros cuja expressão do gene são altamente dependentes da dose, e têm limitada papéis funcionais durante a tumorigénese.