Sumário

do receptor do factor de crescimento epidérmico (EGFR) e do resultado a activação no aumento da proliferação e migração de tumores sólidos incluindo cancro do ovário. Nos últimos anos, a evidência de montagem indica que o EGFR é um alvo directo e funcional de miR-7. Neste estudo, verificou-se que o miR-7 de expressão foi significativamente regulada negativamente em linhas celulares altamente metastáticas epiteliais do cancro do ovário (EOC) e tecidos metastáticos, ao passo que a expressão de EGFR correlacionada positivamente com a metástase em ambos os pacientes EOC e linhas celulares. Superexpressão de miR-7 marcadamente suprimida a capacidade de invasão e migração celular e resultou em alterações morfológicas de um fenótipo mesenquimal para um fenótipo epitelial, como em EOC. Além disso, a sobre-expressão de miR-7 upregulated expressão CK-18 e β-catenina e expressão de vimentina regulada negativamente, acompanhada de inibição de EGFR e AKT /ERK1 /2 inactivação. Semelhante a miR-7 transfecção, o silenciamento do EGFR com o presente siARN em células EOC também upregulated CK-18 e β-catenina expressão e regulados negativamente vimentina expressão, e diminuiu a fosforilação de ambos Akt e ERK1 /2, confirmando que o EGFR é um alvo de miR -7 na reversão EMT. A inibição farmacológica da PI3K-AKT e ERK1 /2 significativamente melhorada, tanto CK-18 e β-catenina expressão e expressão de vimentina suprimida, indicando que a AKT e ERK1 /2 vias são necessários para miR-7 EMT mediação. Finalmente, a expressão de miR-7 e EGFR em EOC primária com metástases tecidos emparelhados foi explorada. foi mostraram que miR-7 é inversamente correlacionada com EGFR. Tomados em conjunto, os nossos resultados sugerem que miR-7 metástase inibido do tumor e EMT revertida através de AKT e ERK1 /2 inactivação via, reduzindo a expressão de EGFR em linhagens de células EOC. Assim, miR-7 pode ser um potencial marcador de prognóstico e alvo terapêutico para a intervenção metástase do câncer de ovário

Citation:. Zhou X, Hu Y, Dai L, Wang Y, Zhou J, Wang W, et al. (2014) MicroRNA-7 Inibe a metástase de tumor e Transição inverte epitelial-mesenquimal através AKT /ERK1 /2 Inactivação por Segmentação EGFR em epitelial cancro do ovário. PLoS ONE 9 (5): e96718. doi: 10.1371 /journal.pone.0096718

editor: Jung Weon Lee, da Universidade Nacional de Seul, Coreia do Sul

Recebido: 08 de dezembro de 2013; Aceito: 10 de abril de 2014; Publicado em: 09 de maio de 2014

Direitos de autor: © 2014 Zhou et al. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Licença Creative Commons Attribution, que permite uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o autor original ea fonte sejam creditados

Financiamento:. Este trabalho foi apoiado por subsídios da National Science Foundation Natural da China (Grant No. 81.072.138), projeto de cruzamento Médico-engenharia de Shanghai Jiao Tong University (YG2010MS24). Os financiadores não tiveram nenhum papel no desenho do estudo, coleta de dados e análise, decisão de publicar ou preparação do manuscrito

CONFLITO DE INTERESSES:.. Os autores declararam que não existem interesses conflitantes

Introdução

o câncer de ovário é a principal causa de mortes por doenças malignas ginecológicas e a 5ª causa de mortes relacionadas ao câncer entre as mulheres de liderança no mundo [1]. De acordo com o relatório do National Cancer Institute (NCI), cerca de 22280 novos casos serão diagnosticados com câncer de ovário nos Estados Unidos em 2012, e 15500 pacientes morrerão desta doença, ea taxa de sobrevida em 5 anos para eles é cerca de 30%. Especulou-se que a metástase continua a ser a principal causa de morte e recidiva do cancro do ovário, e ainda os mecanismos moleculares associadas com a aquisição de capacidade metastática do cancro no ovário humano são mal compreendidos.

MicroRNAs (miARNs) são uma classe de pequena não-codificante RNA de aproximadamente 20-22 nucleotídeos que funcionam como reguladores pós-transcricional, visando 3 ‘regiões não traduzidas (UTR) de mRNAs e causando tanto a inibição da tradução ou degradação de mRNA [2]. MiRNAs contribuir para diversos processos celulares, incluindo a proliferação, apoptose, invasão e morfogénese [3], [4], [5]. Além disso, uma gama de miARNs foram identificados que funcionam como oncogenes clássicas ou genes supressores de tumor [6], [7], [8]. MiR-7 foi caracterizado como um supressor do tumor em vários cancros humanos. Centra-se um número de proto-oncogenes, incluindo o receptor do factor de crescimento 1 semelhante à insulina (IGF1R) [9] do receptor do factor de crescimento epidérmico (EGFR) [10], activada por p21 quinase 1 (Pak1) e Cdc42 de quinase associada 1 (Ack1 ) [11]. É demonstrado que a sobre-expressão de miR-7 o crescimento celular inibido schwannoma tanto em cultura e em modelos de tumor de xenoenxerto in vivo, o que se correlacionou com a regulação negativa do EGFR, e Pak1 Ack1 [11].

Cerca de 70% de células epiteliais câncer de ovário (EOC) expressa activado EGFR [12]. a sobre-expressão do EGFR e do resultado a activação no aumento da proliferação e migração de tumores sólidos incluindo cancro do ovário [13]. A activação da tirosina-cinase EGFR resulta na activação de uma série de sinais intracelulares, que culminam em não apenas a proliferação celular, mas também outros processos que são cruciais para a progressão tumoral, incluindo migração celular, angiogénese, metástases, e a transição epitelial-mesenquimal (EMT). Estes eventos são mediados através de diferentes alvos a jusante de EGFR (por exemplo, proteína quinase (AKT) e regulada por sinal extracelular cinase 1/2 (ERK1 /2)) [14], [15], [16]. Curiosamente, é mostrado que o miR-7 tem como alvo EGFR directamente ARNm 3′-UTR, e, em seguida, inibe a expressão do seu mRNA e proteína [17]. Apesar de sinalização de EGFR é importante e bem estudada no que diz respeito à progressão da EOC, pouco se sabe sobre como miR-7 mediar EGFR sinalização para modular a metástase das células EOC.

No presente estudo, identificamos pela primeira vez que o miR -7 desempenha um papel importante na EOC metástase. Além disso, mostramos que miR-7 inverte EMT através AKT /ERK1 2 inactivação /alvejando EGFR em EOC, que fornece uma nova compreensão sobre os mecanismos de metástase subjacente de câncer de ovário.

Materiais e Métodos

pacientes e Ética

amostras pareadas de tecidos primários epiteliais do cancro do ovário e tecidos metastáticos (omento ou peritônio) foram obtidas de pacientes com FIGO estadio III-IV avançado EOC que tinham sofrido tumor debulking em Renji Hospital, Escola de medicina, Shanghai Jiao Tong University, entre 2010 e 2012. entre eles, 17 amostras pareadas foram snap-congelados em nitrogênio líquido e armazenadas a -80 ° C para a extração de RNA depois, 25 amostras pareadas foram fixados em formalina e embebidos em parafina. As amostras foram clinicamente e patologicamente mostrado para estar correctamente rotuladas. O estudo foi aprovado pelo conselho de revisão institucional do Renji Hospital, Faculdade de Medicina da Shanghai Jiao Tong University e consentimento informado por escrito foi obtido de todos os pacientes. Tudo investigação clínica foi realizada de acordo com os princípios expressos na Declaração de Helsinki.

Materiais

MIR-7 plasmídeo e controle negativo (NC) foram sintetizados por Shanghai IBS Company. A sequência de plasmídeo e NC são como se segue: 5′-UGGAAGACUAGUGAUUUUGUUGU-3 ‘; Controlo negativo: 5’-GAAATCTACTGCGCGTGGAGAC-3 ‘(empresa IBS). kit TaqMan (Applied Biosystems) especificado para quantificação de miARN foi usada para avaliar a expressão de miR-7 e U6. EGF coelho receptor de mAb (# 4267), fosfo-receptor de EGF (Tyr992) Coelho mAb (# 2235), fosfo-p44 /42 MAPK (Thr202 /Tyr204) Coelho mAb (# 4370), fosfo-Akt (Ser473 /Thr308), coelho mAb (# 4060 /# 2965), Akt (pan) rabbit mAb (# 4691), LY294002 (PI3K Kinase Inhibitor) (# 9901), U0126 (MEK1 /2 Inhibitor) (# 9903), Vimentin coelho mAb (# 5741 ), e o mAb de coelho β-catenina e mAb coelho e-caderina (# 3195) foram adquiridos a partir de Cell Signaling Technology (CST). citoqueratina-18 (CK-18) mAb (T410) Pab (BS1204) foi adquirido a partir de Bioworld Tecnologia. P44 /42 MAPK coelho Acm foi obtido a partir de Santa Cruz ((SC-33746)). mAb de rato GAPDH foi comprado de ABmart (# M20006). 800CW cabra conjugado anti-IgG de coelho ((926-32210), adsorvido altamente cruzada e 800CW cabra conjugado anti-IgG de ratinho (926-32211), adsorvido altamente cruzada foram adquiridos a partir de LI-COR Biosciences. EGFR e de controlo curta ARN interferentes (siRNA ) eram da sonda de detecção Sanong Biotech.Has-miR-7-LNA foram adquiridos de Exiqon (38.485-15).

cultura celular

HO-8910pm, linhas celulares HO-8910 foram obtidos do Cell Bank da Academia chinesa de Ciências (Xangai, China), Caov-3, SKOV3, A2780, A2780 /DDP, e as células ES-2 foram obtidas a partir de ATCC (Manassas, VA). as células foram cultivadas em Roswell Park Memorial Institute 1640 (RPMI-1640) meio (Hyclone), complementado com 10% de soro fetal de bovino (Hyclone) e penicilina /estreptomicina (1:100, Sigma) numa incubadora de atmosfera húmida com 5% de CO2 a 37 ° C. a não ser que de outra maneira indicado, as células foram cultivadas até 70-80% de confluência, em seguida,-privadas de soro durante a noite em meio RPMI-1640 isento de soro antes do tratamento.

miARN e Transfection siRNA

80-90% confluentes as células foram transfectadas com plasmídeo de miR-7 humana (miR-7) ou um controlo negativo (CN) e 30-40% de células confluentes foram transfectadas com o EGFR ou siRNA siRNA-NC por Lipofectamina 2000 (Invitrogen) de acordo com o protocolo do fabricante. O ARN total foi extraída de 24 horas após a transfecção, e de proteína celular total foram extraídos 48 ou 72 horas após a transfecção.

A transcrição reversa quantitativa PCR em tempo real

O ARN total foi isolado por TRIzol Reagent (Invitrogen ). Maduro miR-7 foi sujeitos a transcrição reversa com os iniciadores específicos TR e quantificadas com uma sonda TaqMan, e normalizada por U6 ARN nuclear pequeno utilizando ensaios de miARN TaqMan (Applied Biosystems). Análise da expressão de ARNm foi realizada por PCR quantitativo utilizando SYBR corante verde, com mudanças relativas calculadas pelo método ΔΔCt. Os iniciadores utilizados foram os seguintes: GAPDH-F, 5-TGCACCACCAACTGCTTAGC-3; GAPDH-R, 5-GGCATGGACTGTGGTCATGAG-3; De EGFR-F, 5-AGCCATGCCCGCATTAGCTC-3; De EGFR-R, 5-AAAGGAATGCAACTTCCCAA-3.

Western blotting

Os extractos celulares totais foram preparados como descrito previamente [18] e quantidades iguais de proteína foram separadas por um 8% ou 10% de SDS -Página e elctrotransferred para uma membrana de PVDF (Millipore). As membranas foram em seguida bloqueadas durante 1 hora à temperatura ambiente com um agente bloqueador LI-COR (LI-COR). Com agitação constante, as membranas foram incubadas com anticorpos primários durante a noite a 4 ° C, seguido por incubação durante 1 hora com os anticorpos secundários apropriados marcados com 800IRdye. Imunorreatividade foi detectado e quantificado com o sistema de imagem Odyssey infravermelho (Li-Cor).

ensaios de migração

Cells (8 × 10

4) foram colhidas e re-suspenso em sérica livre de RPMI-1640 e colocou nos poços superiores da câmara de Boyden (Corning). O meio contendo soro bovino fetal a 10% foi adicionado para dentro da câmara inferior. Após 8 h de incubação, as células que permanecem na superfície superior da membrana foram removidos, as células que tinham invadido através da membrana de tamanho de poro de 8 um foram fixadas, coradas e contadas sob um microscópio com ampliação de 200 x. Os resultados obtidos foram a média entre os três experiências independentes.

ensaios de invasão

Células (3 x 10

4) foram colocados nas câmaras superiores revestidas com 50 ul de Matrigel (diluição 1:05 em meio isento de soro). Meio suplementado com soro a 10% foi adicionado à taça exterior. Após 24 h de incubação, as células que permanecem na superfície superior da membrana foram removidos, as células que tinham invadido através do Matrigel e na membrana de tamanho de poro de 8 um foram fixadas, coradas e contadas sob um microscópio com ampliação de 200 x. Os resultados foram em média entre três experiências independentes.

imuno-histoquímica (IHQ) e Cromogênico hibridização in situ (CISH)

A imuno-histoquímica (IHQ) foi realizada utilizando o peroxidase de rábano (HRP) -polymer anti-ratinho de IHC DAB (diami-nobenzidine) -based kit (MaxVision, Fuzhou, China), de acordo com o protocolo do fabricante. A recuperação de antígenos foi realizada utilizando tampão de borato (pH = 8), seguido por incubação em peróxido de hidrogénio e passos de bloqueio adicionais. Os anticorpos foram utilizados a 1:50. O IHC foi examinada e fotografada utilizando um microscópio Olympus BX51 (Tóquio, Japão) em 1:200. sinais positve foram identificados pela rotulagem marrom intenso de suas membranas celulares.

Cromogênico hibridização in situ (CISH)

foi realizada utilizando a sonda Tem-miR-7 a partir Exiqon (LNA sonda de detecção de mercúrio 5 ‘e 3’-DIG (digoxigenina) marcado com). A sonda foi detectado usando anticorpo digoxigenina (Abcam), LSAB2 System-HRP (Dako Denmark A /S, Glostrup, Dinamarca) e líquido DAB + Substrato cromogénio Sistema (Dako) de acordo com as instruções do fabricante. A CISH foi examinada e fotografada utilizando um microscópio Olympus BX51 (Tóquio, Japão) em 1:200. sinais de hibridação positivos foram identificados pela rotulagem marrom intenso de seus citoplasma da célula.

Os resultados de IHQ e CISH foram independentemente marcado por dois patologistas de forma cega. A pontuação foi com base na intensidade e grau de coloração e foi avaliada de acordo com o seguinte método de pontuação histológica. intensidade da coloração foi classificada como se segue: 0, coloração negativa; 1, coloração fraca; 2, coloração moderada; 3, de coloração forte. A proporção média de células coradas por espécime foi determinado semi-quantitativamente e teve como se segue: 0 para a coloração de 1%, 1 para 1-25%, 26-50% para 2, 3, para 51-75%, e 4 para 75% das células examinadas. A pontuação histológica (H-score) para cada amostra foi calculado pela fórmula: H-score = pontuação proporção × pontuação intensidade. A pontuação total de 0-12 foi calculado e classificado como negativo (-, pontuação: 0), fraco (+, pontuação: 1-4), moderada (++, pontuação: 5-8) ou forte (+++, pontuação: 9-12)

a análise estatística

a análise estatística foi realizada com o pacote de software de análise estatística SPSS 12.0.. Em cada experiência in vitro, um mínimo de três poços /pratos foi usada e foram obtidos resultados semelhantes. Cada experiência foi repetida pelo menos três vezes, o valor médio das repetições foi calculada e este valor foi utilizado na análise estatística. Os dados experimentais estão expressos como média com desvio padrão (SD). As diferenças entre os grupos foram avaliadas pelo teste t de Student quando se compara apenas dois grupos ou analisados ​​por ANOVA de uma via com teste post hoc quando mais de dois grupos foram comparados. A correlação entre EGFR e miR-7 foi analisada por meio do teste de Spearman. Os resultados de IHQ e CISH foram analisadas pelo teste de Wilcoxon. foram consideradas estatisticamente significativas diferenças na P 0,05, * P 0,05 e ** P . 0,01

Resultados

miR-7 de expressão é inversamente correlacionada com EOC metástase

para explorar a expressão e significado do miR-7 em EOC metástase, detectamos a expressão de miR-7 em tecidos EOC metastáticos 17-emparelhados e tecidos EOC primários. Quantitative PCR em tempo real (qRT-PCR) demonstrou que os tecidos a partir de omento ou o peritoneu metástases expressaram níveis mais baixos de miR-7 em comparação com os tecidos EOC primária, indicando uma relação inversa entre a expressão de miR-7 e o estado metastático de tecidos EOC ( Figura 1A). Além disso, foram selecionados HO-8910 e seu clone altamente metastático HO-8910pm. HO-8910pm foi estabelecido e caracterizado Cell Bank, da Academia Chinesa de Ciências [19], [20], [21]. Descobrimos que o miR-7 de expressão foi significativamente diminuída no clone altamente metastático HO-8910pm comparação com HO-8910 (Figura 1B). Tomados em conjunto, os nossos resultados sugerem que a regulação negativa de miR-7 está correlacionada com o aumento da metástase EOC e que miR-7 pode suprimir a progressão EOC. Para determinar as linhas de células óptimas para um estudo mais aprofundado, foi medida a expressão de miR-7 em sete linhas de células de EOC (HO-8910pm, HO-8910, A2780, A2780 /DDP, SKOV-3, Caov-3 e ES-2) . Os nossos dados mostraram que a expressão de miR-7 foi mais baixo em linha celular ES-2 (P 0,05) (Figura 1C), o qual é uma outra célula com potencial EOC altamente metastático. Por isso, nós escolhemos HO-8910PM e ES-2 para estudar os mecanismos de miR-7 inibir a metástase em EOC nas experiências seguintes.

(A) A expressão relativa de miR-7 em tecidos EOC-17 emparelhados a partir de omento ou metástases peritoneu e tecidos EOC primário foi detectado por qRT-PCR. O ARN nuclear pequeno U6 foi usada como um controlo interno e a mudança de dobragem foi calculada pelo método ΔΔCt (B) O nível de expressão de miR-7 em um par de linhas de células metastáticas de AOE baixas e altas. (C) O nível de expressão de miR-7 em sete linhas de células de AOE. (* P . 0,05 ** P 0,01).

miR-7 regula negativamente EGFR nas células EOC

Para detectar o mecanismo subjacente pelo qual miR-7 inibição EOC invasão e metástase, temos procurado por miR-7 alvos usando como TargetScan e PicTar. Que identificou 181 genes alvo candidato incluindo EGFR. É demonstrado que o miR-7 regula negativamente a expressão de EGFR por direccionamento directamente EGFR ARNm 3′-UTR [17]. Estamos particularmente interessados ​​em EGFR por causa de seus papéis positivos na migração de células cancerosas e invasão e sua sobre-expressão em EOC. Nós investigamos ainda mais a expressão e significado do EGFR em EOC metástases através da detecção de expressão da proteína EGFR em tecidos EOC metastáticos 17-emparelhados e tecidos EOC primários. análise de transferência de Western mostrou que os tecidos a partir de omento ou metástases peritoneu expressaram níveis mais elevados de EGFR em comparação com tecidos EOC primária, indicando uma correlação positiva entre a expressão do EGFR e do estado metastático de tecidos EOC (Figura 2A, Figura S1A). Enquanto isso, nós também detectaram a expressão da proteína EGFR por transferência Western tanto em células HO-HO-8910pm 8910 e. Descobrimos que a expressão do EGFR foi significativamente aumentada no clone altamente metastático HO-8910pm comparação com HO-8910 (Figura 2B, Figura S1B). Tomados em conjunto, os nossos resultados sugerem que a expressão de EGFR é positivamente correlacionada com EOC metástase e que o EGFR pode promover a progressão EOC.

(A) A expressão da proteína de EGFR em tecidos de 17 pares EOC de omento ou metástases peritônio e primária tecidos EOC foi analisada por western blot. (B) A expressão de proteínas de EGFR em HO-8910 e HO-8910pm linhas celulares foi analisada por Western blotting. (C) O nível de expressão de miR-7 em HO-8910pm e ES-2 As células transfectadas com o miR-7 ou NC foi analisada por qRT-PCR. (D) O nível de expressão de ARNm de EGFR em HO-8910pm e ES 2-células transfectadas com miR-7 ou NC foi analisada por qRT-PCR. (E) A expressão da proteína EGFR foi analisado por transferência de Western em HO-8910pm e ES-2 As células transfectadas com o miR-7 ou NC, gliceraldeído 3-fosfato desidrogenase (GAPDH) foi usada como um controlo interno. (* P . 0,05 ** P 0,01).

Para certificar-se os papéis de miR-7 na regulação da expressão do EGFR nas células EOC, ambas as células HO-8910pm e ES-2 foram transfectadas com miR-7 plasmídeo ou miR-NC. qRT-PCR mostrou que o miR-7 de expressão foi significativamente aumentada (Figura 2C), enquanto que a expressão de ARNm de EGFR foi diminuiu significativamente (Figura 2D), após o miR-7 transfecção em ambas as linhas celulares. Além disso, a análise de transferência de Western indicou que a expressão da proteína EGFR foi significativamente reduzida após o miR-7 transfecção em ambos HO-8910pm e ES-2 células (Figura 2E, Figura S1C). Nossos resultados sugerem que miR-7 regula negativamente EGFR em EOC.

miR-7 suprime a invasão de células EOC e migração in vitro

Para investigar se miR-7 regula invasão celular e migração na EOC, tanto HO-8910pm e ES-2 as células foram transfectadas com plasmídeo de miR-7 ou NC-miR. Os ensaios de migração e invasão Transwell foram então realizadas. Verificou-se que a transfecção com o miR-7 suprimiu significativamente a invasão de células de ambas as HO-8910pm (Figura 3A) e ES-2 células (Figura 3B). Da mesma forma, a capacidade de migração também foi significativamente regulada para baixo em ambos os ho-8910pm-miR-7 células e ES-2-miR-7 células contra células HO-8910pm-NC e células ES-2-NC (Figura 3A, Figura 3B) . Estes resultados indicam que miR-7 participa na regulação da migração celular e invasão em EOC.

(A) a migração Transwell e ensaios de invasão usando células HO-8910pm transfectadas com miR-7 ou controle negativo (NC). Imagens representativas são mostrados à esquerda, e a quantificação dos campos seleccionados aleatoriamente 6 é mostrada no lado direito. ensaios (B) de migração Transwell e invasão usando células ES-2 transfectadas com miR-7 ou NC. Imagens representativas são mostrados à esquerda, e a quantificação dos campos seleccionados aleatoriamente 6 é mostrada no lado direito. Os valores apresentados são expressos como médias ± DP. (* P . 0,05 ** P 0,01).

A superexpressão de miR-7 inverte EMT na célula EOC

Nas células EOC, observamos que miR-7 transfecção resultou em mudanças morfológicas de, um fenótipo alongado em forma de fuso, para um fenótipo mesenquimal mais arredondada,-epitelial semelhantes, com as células agregam em grupos (Figura 4A). Estas variações representam os processos inversos de EMT, o que é uma razão importante para o cancro epitelial para obter a capacidade de invasão e metástase. Além disso, foi examinada a expressão de proteínas dos marcadores epiteliais de E-caderina, CK-18 e β-catenina, como também o marcador de vimentina mesenquimais por Western blotting. Embora não houvesse expressão de E-caderina em ambas as linhas celulares, mesmo depois de miR-7 transfecção, CK-18 e β-catenina expressão dramaticamente aumentada, enquanto a expressão de vimentina diminuiu em ambas as células HO-8910pm e ES-2 após o miR-7 transfecção ( Figura 4B, Figura S2). Nossos dados sugerem que a sobre-expressão de miR-7 inverte EMT em linhas celulares EOC.

(A) imagens de contraste de fase de 2-ES células infectadas com o miR-7 ou NC. (B) A expressão da proteína de E-caderina, CK-18, β-catenina e vimentina em HO-8910pm e ES-2 As células transfectadas com o miR-7 ou NC foram analisados ​​por transferência de Western, de GAPDH foi usada como um controlo interno. (* P . 0,05 ** P 0,01).

ensaios de repórter de luciferase

Para compreender o mecanismo molecular pelo qual miR-7 suprimir EOC invasão e metástase, usamos diferentes métodos computacionais para procurar o miR-7 metas, tais como Targetsan e PicTar. Estes métodos encontrados 181 genes candidatos possíveis. Estamos particularmente interessados ​​em EGFR por causa de seus papéis positivos na invasão da célula cancerosa. A análise da sequência 3′-UTR do EGFR identificados três locais de ligação possíveis para miR-7. Para determinar se o EGFR é alvo directo de miR-7, construímos seu extremo 3 ‘UTR fragmentos, em que os locais de ligação de tipo selvagem e mutantes foram inseridos na região immediatedly a jusante do gene repórter (Figura 5A), ensaios de repórter de luciferase mostrou que o miR-7 transfecção causou uma diminuição notável na actividade de luciferase que continha fragmentos de tipo selvagem 3’-UTR locais (Figura 5B) de ligação.

(a) Diagrama da construção repórter de EGFR 3’UTR. (B) de tipo selvagem ou mutantes plasmídeos repórter foram co-transfectadas com o miR-7 ou NC em ES-2. (* P . 0,05 ** P 0,01).

miR-7 suprime a AKT e ERK1 /2 ativação da via dependente de sua inibição EGFR nas células EOC

Estudos anteriores mostraram EGFR que regula a actividade de AKT e ERK1 /2 em cancro do ovário [15], [22]. Porque miR-7 pode pós-transcricional inibir a expressão de EGFR, a hipótese de que o miR-7 regula AKT e ERK1 /2 ativação da via. Para investigar o efeito de miR-7 em AKT e ERK1 /2, que as células transfectadas HO-8910pm e ES-2 com miR-7 plasmídeo ou miR-NC, e, em seguida, examinada a fosforilação de AKT e ERK1 /2 por Western blotting. A transfecção com o miR-7 suprimiu a fosforilação de AKT em Ser473 e ERK1 /2 em Thr202 /Tyr204, no entanto, o miR-7 não alterou significativamente a fosforilação de AKT em Thr308 (Figura 6A). Uma vez que a activação do EGFR é jogando papel importante na metástase de muitos cancros, que também detectada seu estado de fosforilação após o miR-7 transfecção em HO-8910pm e células ES-2. No entanto, nos nossos estudos, não houve EGFR fosforilação pré e pós transfecção miR-7, ao passo que o miR-7 transfecção inibiu a expressão de proteína total de EGFR (Figura 6A, Figura S3 (A-C)). Como prova de que o miR-7 tem muitos genes-alvo, procurou-se determinar se miR-7 AKT mediado e ERK1 /2 ativação da via é dependente da sua inibição EGFR. HO-8910pm e ES-2 as células foram transfectadas com o EGFR ou o siRNA controlo negativo. Mostrámos que o silenciamento do EGFR com o presente siARN em células de cancro do ovário diminuiu a fosforilação de AKT em Ser473 e ERK1 /2 em Thr202 /Tyr204 em Western Blotting, mas não houve nenhuma alteração significativa na fosforilação de AKT em Thr308 (Figura 6B, Figura S3 ( dE)).

() células HO-8910pm e ES-2 foram transfectadas com miR-7 ou NC, EGFR, AKT e ERK1 /2 fosforilação foram analisadas por western blotting. células (B) HO-8910pm e ES-2 foram transfectadas com ARNsi de EGFR ou NC, EGFR, AKT e ERK1 /2 fosforilação foram analisadas por western blotting. (* P . 0,05 ** P 0,01).

miR-7 inverte EMT através de EGFR /AKT e EGFR /ERK1 2 pathway /Tablet

Para determinar se o EGFR /AKT e EGFR /ERK1 /2 vias de sinalização estavam envolvidos na reversão de EMT por miR-7, transfectadas EGFR siRNA em células Ho-8910pm e ES-2 e, em seguida, explorar a expressão da proteína caderina-e, CK-18, β -catenina e vimentina por western blotting. Verificou-se que não havia nenhuma pré expressão de E-caderina e pós EGFR siARN transfecção em ambas as linhas celulares, no entanto, CK-18 e β-catenina expressão dramaticamente aumentada, enquanto a expressão de vimentina diminuiu em ambas as células HO-8910pm e ES-2 após o EGFR siRNA transfecção (Figura 7A, Figura S4 (AC)). Em seguida, foi utilizada a via PI3K /AKT inibidor de LY294002 e o U0126 inibidor de ERK1 /2 para bloquear especificamente a Akt e as vias de ERK1 /2, respectivamente. Como esperado, o inibidor de PI3K /AKT LY294002 inibiu a fosforilação de AKT, enquanto inibidor de ERK1 /2 L 0126 inibiu a fosforilação de ERK1 2 /em HO-8910pm e células ES-2 (Figura 7B, FigureS4 (D-G)). Além disso, tanto a AKT e ERK1 /2 inibidores reforçada CK-18 e β-catenina expressão e expressão de vimentina suprimida em HO-8910pm e ES-2 células (Figura 7C e Figura S4 (H-H)). Os nossos dados demonstram o envolvimento do EGFR /AKT e EGFR /ERK1 /2 vias no miR-7 EMT revertida em células de cancro do ovário.

Ho-8910pm e células (A) ES-2 foram transfectadas com EGFR siRNA ou NC, a expressão da proteína de e-caderina, CK-18, β-catenina e vimentina foram exploradas por western blot. (B) HO-8910pm e células ES-2 foram tratadas com LY294002 (20 umol /L) ou U0126 (10 umol /L), AKT e ERK1 /2 fosforilação foram analisadas por western blotting. células (C) HO-8910pm e ES-2 foram tratadas com LY294002 (20 umol /L) ou U0126 (10 umol /L), a expressão da proteína de CK-18, β-catenina e vimentina foram explorados por western blotting. GAPDH foi utilizado como um controlo interno (* P . 0,05 ** P 0,01).

miR-7 e EGFR são inversamente expresso em tecidos primários e metástases EOC

usados ​​CISH e IHC para detectar a expressão de miR-7 e EGFR no mesmo tipo de tecido. Nós determinado se miR-7 de expressão foi associada com expressão de EGFR em tissuses EOC. O tecido continha 25 pares de tecidos EOC primários e metastáticos seus tecidos correspondentes. A análise CISH mostrou uma redução evidente do miR-7 em tecidos metastáticas em comparação com os seus tecidos primários EOC (Figura 8A, Quadro 1) correspondente. Em contraste, os resultados de IHC revelou que a expressão do EGFR era mais elevada em tecidos metastáticos do que em tecidos EOC primárias (Figura 8B, Tabela 2). Além disso, a análise estatística mostrou que a expressão do EGFR foi correlacionada inversamente com o miR-7 expressão (Tabela 3).

(A) Expressão de miR-7 em EOC primário e seu tecido metastático acompanhado por CISH. (B) A expressão de EGFR em EOC primário e seu tecido metastático acompanhado por IHC. (* P . 0,05 ** P 0,01).

Discussão

miRNAs têm surgido como reguladores críticos da carcinogênese e progressão maligna de cancro por segmentação oncogenes e genes supressores de tumor [23], [24]. Tem sido implicado que o miR-7 inibe a invasão de tumores e metástases em glioblastoma, Schwannoma, cancro do pulmão, cancro da mama e muitos outros tipos de cancro [25], [26], [27]. No presente estudo, foram investigados o papel biológico do miR-7 na metástase EOC humano. Descobrimos que miR-7 foi regulada para baixo em tecidos metastáticos câncer epitelial de ovário (EOC) em comparação com os tecidos EOC primários. miR-7 de expressão também foi diminuída significativamente no clone altamente metastático HO-8910pm comparação com HO-8910. Além disso, mostramos que a expressão de miR-7 foi mais baixo em linha de células-2 ES, que é outra célula EOC com elevado potencial metastático em sete linhas de células de EOC (HO-8910pm, HO-8910, A2780, A2780 /DDP, SKOV -3, Caov-3 e ES-2). Por conseguinte, os nossos resultados indicaram que o miR-7 expressão está inversamente correlacionada com a metástase EOC.

Curiosamente, cada miARN pode potencialmente regulam centenas de genes aos níveis pós-transcricionais através da ligação às sequências específicas em que as moléculas de ARNm alvo baseados em “complementaridade imperfeita”. Tem sido mostrado que a sobre-expressão de miR-7 invasão tumoral e metástase inibida por direccionamento do receptor de insulina-like growth factor-1 (IGF-1R) no cancro gástrico [9]. miR-7 também tem sido relatada a FAK alvo em células de cancro da mama [28]. Nos últimos anos, a evidência de montagem indica que o EGFR é um alvo directo e funcional de miR-7 [10], [17]. Os receptores de tirosina-quinase do EGFR família regula as funções celulares essenciais, incluindo a proliferação, sobrevivência, migração, e diferenciação. Os dados publicados demonstram que o EGFR desempenha um papel importante na progressão do tumor [12], [27]. Neste estudo, verificou-se que os tecidos de omento ou metástases peritônio expressaram níveis mais elevados de EGFR em comparação com os tecidos EOC primários. Enquanto isso, descobrimos que EGFR foi regulada no clone altamente metastático HO-8910pm comparação com HO-8910. Estes resultados sugerem que o EGFR está intimamente relacionado com a metástase do câncer de ovário. Os nossos estudos anteriores mostraram também que a sobre-expressão do EGFR e activação resultado num aumento da metástase de células de cancro do ovário humanos [18], [29]. No entanto, nenhum estudo é realizado para determinar se o miR-7 tem como alvo EGFR para modular o comportamento de EOC metástase. Aqui, mostramos que tanto o EGFR de ARNm e a expressão da proteína EGFR foi significativamente reduzida após o miR-7 transfecção em linhas celulares de AOE. Nós posteriormente identificados que tanto invasão e capacidade de migração foram significativamente regulada para baixo depois de miR-7 transfecção em EOC in vitro. Os presentes resultados experimentais confirmaram pela primeira vez que o miR-7 suprimiu a invasão de células EOC e migração. Tomados em conjunto, os nossos resultados indicam que o miR-7 suprime a invasão celular e migração, pelo menos em parte, através de direccionamento directo de EGFR em EOC.

EMT refere-se a um processo biológico que as células epiteliais se transformar em células do mesênquima através da