Abstract

O carcinoma hepatocelular humano (HCC) representa biologicamente agressivo e quimioterapia cancros resistentes. Devido à baixa afinidade com o factor apoptótico Mcl-1, o medicamento de BH3 mimético ABT-737 não conseguiu exercer actividades matando-cancerosas potentes em vários modelos de cancro incluindo carcinoma hepatocelular. O presente estudo demonstrou que a combinação de ABT-737 e Celastrol sinergicamente suprimiu a proliferação celular HCC, e que a apoptose induzida foi acompanhada com a activação da cascata de caspase e a libertação de citocromo c de mitocôndrias. Outras estudo revelou que o Noxas aumentada causada por Celastrol foi o factor-chave para a sinergia, uma vez que pequenas interferindo knockdown mediada por ARN de expressão em células de carcinoma hepatocelular Noxas resultou numa diminuição da apoptose e atenuados efeitos anti-proliferativos da combinação. Além disso, o nosso estudo desvendado que, após exposição Celastrol, a activação do retículo endoplasmático (ER) estresse, especificamente, a via eIF2α-ATF4 desempenharam um papel indispensável na activação de Noxas, que foi validado pela observação de que a depleção de ATF4 significativamente revogada a elevação Noxa por Celastrol. Nossos resultados destacam uma nova via de sinalização através do qual Celastrol aumentar a expressão Noxa, e sugerir o uso potencial da regulação mediada por ATF4 de Noxa como uma estratégia promissora para melhorar as actividades anti-câncer de ABT-737

Citation.: Zhu H, Yang W, Ele Lj, ​​Ding Wj, Zheng L, Liao Sd, et al. (2012) upregulating Noxa por ER estresse, Celastrol Exerce sinérgica Anti-Cancer Atividade em combinação com ABT-737 em células humanas carcinoma hepatocelular. PLoS ONE 7 (12): e52333. doi: 10.1371 /journal.pone.0052333

editor: Tetsuo Takehara, Osaka University Graduate School of Medicine, Japão

Recebido: 07 de agosto de 2012; Aceito: 12 de novembro de 2012; Publicação: 20 de dezembro de 2012

Direitos de autor: © 2012 Zhu et al. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Licença Creative Commons Attribution, que permite uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o autor original ea fonte sejam creditados

Financiamento:. Os autores gratos pelo apoio financeiro dos fundos investigação fundamental para as Universidades Central (No. 2011FZA7008) e Zhejiang Provincial Natural Science Foundation da China (No. Y2110933). Os financiadores não tiveram nenhum papel no desenho do estudo, coleta de dados e análise, decisão de publicar ou preparação do manuscrito

CONFLITO DE INTERESSES:.. Os autores declararam que não existem interesses conflitantes

Introdução

ABT-737 é um inibidor potente de molécula pequena, que tem como alvo a via de apoptose Bcl-2-regulada, que serve como um mimético de Bad-como BH3. Ele limita selectivamente a Bcl-2, Bcl-XL e Bcl-W, mas não de Mcl-1 e Bfl-1 /A1. Em estudos pré-clínicos, ABT-737 demonstrou actividade de agente único contra vários leucemia [1], linfoma [2], e cancro do pulmão de pequenas células [3]. Enquanto ABT-737 foi mostrada para ser um agente terapêutico promissor, é pouco provável que seja eficaz como um agente único, em tumores sólidos resultou da sua baixa afinidade com Mcl-1 e de elevado nível de Mcl-1 em células cancerosas [4] – [7]. Isso faz com que a exploração de estratégias de combinação cruciais para melhorar o tratamento actual de ABT-737 contra o cancro, de que o problema quente é combinar ABT-737 com outras drogas que têm a capacidade de modular a Mcl-1. Nos nossos estudos anteriores, verificou-se que a gemcitabina poderia aumentar a ubiquitinação e subsequente degradação de Mcl-1, por conseguinte, exibiu citotoxicidade sinérgica com ABT-737 em vários tipos de células [6] cancerosas. Da mesma forma, GDC-0941 de promoção da degradação do Mcl-1 também foi responsável por sua morte sinérgica de células de câncer de mama com o ABT-737 [5]. Portanto, a modificação na Mcl-1 expressão provocaria sensibilização da ABT-737 em cancelar células.

O BH3-only proteína Noxa é capaz de interagir selectivamente com Mcl-1, em seguida, solte Bak ou Bax de Mcl- 1 para activar a via de apoptose mitocondrial ou alvo para a degradação proteossómica [5] – [8]. Devido à sua característica típica, Noxas tem sido destacado como um factor eficaz para inverter a resistência a ABT-737, que é causada por Mcl-1. Lucas KM et ai indicaram que a sobre-expressão de Noxas superou fortemente a resistência de ABT-737 em células de melanoma [9]. Além disso, agentes indutores de Noxas também têm sido relatados para sensibilizar células cancerosas para ABT-737, incluindo bortezomib [10], Fludarabina [11], oxaliplatina [12], etc. Recentemente, Dai Y et ai demonstraram que Celastrol, um extracto natural com capacidades potentes anti-câncer, pode levar à indução de Noxa e clivagem de Mcl-1 [13], o que atraiu a nossa atenção para examinar os efeitos quando combinar este agente com ABT-737, cujas atividades anti-câncer foram intimamente relacionado com Mcl -1.

Celastrol é um composto farmacologicamente activo originalmente identificados a partir de medicina tradicional chinesa Trovão de extractos de raiz Deus videira, e tem sido utilizado como um remédio natural para condições inflamatórias e ao tratamento anti-cancro durante anos [14]. Como um inibidor de HSP90, Celastrol interrompido interação HSP90-Cdc37 contra células de câncer pancreático [15], [16], e impôs influência na resposta ER-stress [17]. Além disso, Celastrol poderia induzir a apoptose pela ativação Noxa e modulando Mcl-1 [13], com mecanismos detalhados desconhecidos, ea aplicação potencial são ainda imperceptíveis.

Neste estudo, nós investigamos as capacidades potencialmente sinérgicos de ABT- 737 em combinação com Celastrol em linhas celulares de carcinoma hepatocelular humano, em que na maior parte abrigar elevado nível de Mcl-1 expressão da proteína [18]. Os valores de índice de combinação (IC) das capacidades anti-proliferativas em duas linhas celulares de cancro do fígado humano Bel-7402 e HepG2 foram inferiores a 0,7, o que indica o sinergismo da combinação de ABT-737 e Celastrol. Além disso, Celastrol potenciou grandemente a apoptose ABT-737-mediada em células HepG2 Bel-7402 e por estimular a expressão Noxas e a sua interacção com Mcl-1, que era dependente da indução da resposta ER estresse, especificamente, a activação de ATF4. Em geral, o nosso estudo determinado, em primeiro lugar os efeitos sinérgicos de ABT-737 mais Celastrol em células de carcinoma hepatocelular humano, abrindo a possibilidade de combinar estes dois agentes como combinação terapêutica potente, e sugerindo que a activação de ER stress que levam à manipulação em Noxas pode serviu como uma estratégia eficaz para inibir a Mcl-1 e, portanto, para aumentar a actividade anti-cancro de ABT-737.

ensaios MTT foram utilizados para examinar as actividades inibidoras da proliferação celular em cancro do fígado humano Bel-7402 ( A) e células HepG2 (B). As células em placas de 96 poços foram expostos a concentrações seriadas de ABT-737, ou a mistura Celastrol-relação constante entre estes dois durante 72 h. As concentrações utilizadas foram 1,25-10 M para ABT-737, 0,16-1,25 M para Celastrol. As curvas de concentração-resposta de duas linhas de células para ABT-737, e a combinação Celastrol foram apresentados. Três experiências independentes foram realizados, e o desvio padrão foi representada como barras de erro. Os valores IC foram demonstrados na Tabela 1.

Materiais e Métodos

1. Produtos químicos e reagentes

ABT-737 foi comprado de Selleck produtos químicos (Houston, TX). Celastrol foi sintetizado pelo professor Wei Lu (East China Normal University) com pureza superior a 99%. Tanto o ABT-737 e Celastrol foram dissolvidos em dimetilsulfóxido a uma concentração de estoque 20 mM (DMSO). Os anticorpos primários contra a PARP, pró-caspase-3, Bax, Bim, Bcl-xL, ubiquitina, actina e marcado com HRP anti-cabra secundário, anticorpos anti-murganho e anti-coelho foram adquiridos a partir de Santa Cruz Biotechnology (Santa Cruz, CA); os anticorpos primários contra clivada pela caspase-3, o puma, o citocromo c, Bcl-2, Mcl-1, ATF4, costeleta, p-eIF2α (Ser51), eIF2α, HSP70, p-ERK, ERK, e CDK4 foi adquirido a partir de células Signaling Technology (Danvers, MA); os anticorpos primários contra Noxas foi adquirido de Calbiochem (Darmstadt, Alemanha).

2. Cultura celular

linhas Humanos hepatocelular carcinoma de células Bel-7402 e HepG2 foram adquiridos a partir de Xangai Instituto de Bioquímica e Biologia Celular (Xangai, China) e mantidos em um CO 5%

2 atmosfera a 37 ° C. células BEL-7402 foram cultivadas em meio RPMI-1640 suplementado com soro fetal bovino a 10% e as células HepG2 em meio de Eagle modificado por Dulbecco suplementado com 10% de soro fetal de bovino.

. As células foram tratadas com 10? M de ABT-737, 1,25 uM Celastrol e a combinação de 24, 48, 72 horas e a apoptose foi testada por coloração com iodeto de propidio de núcleos de células lisadas e analisadas por citometria de fluxo. B. Após o tratamento de 10 uM de ABT-737, 1,25 uM Celastrol e a combinação de 72 horas, as células foram coradas com DAPI e observada pela Leica DMI 400B Xuorescence microscópio. As células foram tratadas com 10? M de ABT-737, 1,25 uM e a combinação Celastrol durante 24 h; C. Os lisados ​​foram colhidos e immunobloted com caspase-3 clivada, anticorpos de caspase-3 e PARP; D. actividade caspase-3 foram determinadas utilizando o substrato específico Ac-DEVDPNA; As células HepG2 foram tratadas com 10? M de ABT-737, 1,25 uM e a combinação Celastrol durante 24 h. células BEL-7402 e HepG2 E. foram coradas com JC-1, então observado por Leica DMI 400B Xuorescence microscópio; Os níveis de proteína F. de Bax, Bcl-2, Bcl-xL e Mcl-1 em células HepG2 e Bel-7402 foram detectadas por análise de transferência de Western. A densidade da banda de proteína foi determinada usando o Bio-Rad Quantidade Um software de imagem; G. a separação do citosol foi realizada. As amostras de citosol foram analisadas, ea liberação de citocromo c foi avaliada por análise de transferência de western. Os resultados foram semelhantes em pelo menos três experiências independentes. *,

p Art 0,05; **,

p

. 0,01

3. Ensaio de sobrevivência celular

A sobrevivência das células foi avaliada por ensaio de viabilidade celular MTT. Resumidamente, em crescimento exponencial 7402-Bel e HepG2 foram semeadas em placas de 96 poços e cultivadas durante a noite em um de CO a 5%

2 atmosfera a 37 ° C antes do tratamento de expostas a veículo de DMSO, as concentrações em série de ABT-737, Celastrol ou a combinação durante 72 h. Em seguida, as células foram incubadas com MTT (5 mg /ml, 20 ul /poço) durante 4 h e os grânulos de formazano gerados por células vivas foram dissolvidos em DMSO. A absorvância a 570 nm foi medida utilizando um espectro de exploração múltipla (Thermo Electron Corporação Marietta, OH). Os ensaios foram realizados em triplicado em três experimentos independentes.

4. Análise de Apoptose por coloração DAPI

em crescimento exponencial de células HepG2 Bel-7402 e foram semeadas em placas de 96 poços e cultivadas durante a noite em 5% de CO

2 atmosfera a 37 ° C antes de tratamento de veículo de DMSO, concentrações seriadas de ABT-737, ou a combinação Celastrol durante 72 h. As células recolhidas foram lavadas uma vez com PBS, incubadas com 0,1% de Triton e 0,1% DAPI à temperatura ambiente durante 3 min, em seguida, lavada duas vezes com PBS e fotografada com Leica DMI 400B microscópio de fluorescência.

. células BEL-7402 foram tratadas com 10? M de ABT-737, 1,25 uM Celastrol e a combinação de 3, 6, 12 h. B. células HepG2 foram tratadas With10 uM ABT-737, 1,25? M para Celastrol 12, 24, 48 h. Então lisados ​​foram colhidos e immunobloted com anticorpos Noxa, Bim, Puma e PARP.

5. Análise de Apoptose por PI Coloração

em crescimento exponencial Bel-7402 e as células HepG2 foram semeadas e cultivadas durante a noite em 5% de CO

2 atmosfera a 37 ° C antes de tratamento de veículo de DMSO, as concentrações em série de ABT- 737, ou a combinação Celastrol durante 24 h, 48 h e 72 h. As células recolhidas foram lavadas uma vez com PBS e fixadas com etanol frio a 70% a -20 ° C durante pelo menos 2 h. As células fixadas foram lavadas duas vezes com PBS e ressuspensas em PBS contendo 40 ug /ml de RNase A a 37 ° C durante 30 min e 10 mg de iodeto de propídio /ml no escuro à temperatura ambiente durante 30 min. A citometria de fluxo foi realizada no FACScan (BD Biosciences, San Jose, CA).

6. Determinação de Membrana Mitocondrial A despolarização

células em crescimento exponencial Bel-7402 e HepG2 foram semeadas e cultivadas durante a noite em 5% de CO

2 atmosfera a 37 ° C antes de tratamento de veículo de DMSO, as concentrações em série de ABT-737 , Celastrol ou a combinação durante 24 h. As células recolhidas foram lavadas uma vez com PBS e ressuspendeu-se em PBS contendo 10 ug /ml de JC-1 (5,5 ‘, 6,6′-tetracloro-1,1′, 3,3’- iodeto tetraethylbenzimidazolyl-arbocyanine). Após incubationat 37 ° C durante 20 min, as células foram lavadas duas vezes com PBS, em seguida trabalhada com Leica DMI 400B microscópio de fluorescência ou analisados ​​por citometria de fluxo.

células HepG2 foram transfectadas com noxa siRNA de acordo com as recomendações do fabricante. Quarenta e oito horas após a transfecção, as células foram tratadas With10 uM ABT-737, 1,25 uM e a combinação Celastrol durante 48 h. A. Os lisados ​​foram colhidos e immunobloted com anticorpo noxa. B. Os lisados ​​foram colhidos e immunobloted com anticorpos caspase-3 clivada e PARP. C. Os índices de clivagem de caspase-3 /β-actina. D. Os rácios de clivada-PARP /actina. A densidade da banda de proteína foi determinada utilizando Quantity One software de imagem Bio-Rad. E. As fracções de sobrevivência celular foram detectados por ensaio MTT. *,

p Art 0,05; **,

p

. 0,01

7. Análise Western Blot

Bel-7402 e as células HepG2 foram colhidas, lavadas uma vez com PBS e ressuspensas em tampão de lise (Tris-HCl a 50, NaCl 150 mM, EDTA 1 mM, 0,1% de SDS, 0,5% desoxicólico ácido, 0,02% de azida de sódio, 1% de NP-40, 2,0 ug /ml de aprotinina, fluoreto de fenilmetilsulfonilo 1 mM) em gelo durante 30 min. Os lisados ​​foram centrifugados a 13000 rpm durante 30 min a 4 ° C. As concentrações de proteína total de lisado foram detectados por ensaio de Bradford padrão (Bio-Rad, San Diego, CA). Para a análise de Western blot, 40-100 ug de proteínas foram submetidas a electroforese através de SDS-PAGE, transferidos para membrana de nitrocelulose (Pierce Chemical) e sondadas com anticorpos primários seguido de anticorpos secundários acoplados a peroxidase de rábano em 1:5000 diluição. As proteínas foram visualizadas usando quimioluminescência aumentada (ECL) -mais kit da Amersham Biosciences (UK).

8. Medição da Actividade de Caspase-3

A actividade da caspase-3 foi medida através da clivagem de substrato selectivo acetil-Asp-Glu-Val-Asp P-nitroanilida (Ac-DEVDPNA) (Beyotime Instituto de Biotecnologia). As células foram lisadas e a concentração de proteína dos sobrenadantes foi medida pelo método de Bradford e quantidades iguais de proteínas (10 ul) foram incubados num volume total de 100 ul constituídos por tampão de detecção de 80 uL. A reacção foi iniciada por adição de caspase-3 Ac-DEVD substratos-PNA (10 mL). Após incubação durante 60 min a 37 ° C, a clivagem do substrato foi detectada utilizando um espectro de exploração múltipla (Thermo Electron Corporação Marietta, OH) no comprimento de onda de 405 nm. Atividades de caspase-3 foram expressos como alterações na atividade DEVDase.

9. A detecção da libertação do citocromo c

As células foram colhidas, lavadas uma vez com PBS, e res suspenso num tampão de extracção [20 mmol /L de HEPES (pH 7,5), 1,5 mmol /L de MgCl

2, 10 mmol /L de KCl, 1 mmol /L de EGTA, 1 mmole /L de EDTA, 250 mmol /L de sacarose, 0,1 mmol /L de fluoreto de fenilmetilsulfonilo e 1 mmol /l de DTT], e homogeneizou-se utilizando um microhomogenizer. Os homogenatos foram centrifugados a 750 x g durante 10 min a 4 ° C. Em seguida, os sobrenadantes foram centrifugados a 10000 × g durante 15 min a 4 ° C, e os sobrenadantes restantes foram consideradas como fracção de citosol. Após a análise de transferência de Western, de anticorpos anti-citocromo c (Cell Signaling Technology) foram usadas para detectar a libertação mitocondrial de citocromo c.

Após o tratamento de 10 uM de ABT-737, 1,25 uM e a combinação Celastrol durante 24 h , extractos celulares foram imunoprecipitados com anticorpos noxa (B) de Mcl-1 (A) ou. Os imunoprecipitados foram sujeitos a SDS-PAGE e sondadas com Noxas (A) ou anticorpos de Mcl-1 (B). Os lisados ​​foram colhidos e immunobloted com anticorpos, noxa e actina Mcl-1.

A e B. Bel-7402 e as células HepG2 foram tratadas 1,25, 2,5, 5 Celastrol uM durante 3 h, os lisados ​​foram colhidos e immunobloted com Hsp70, p-ERK, CDK4 e anticorpos UB. C. As células HepG2 foram tratadas 1,25, 2,5, 5 Celastrol uM durante 3 h, os lisados ​​foram colhidos e immunobloted com p-eIF2a e ATF4. D. células HepG2 foram tratadas com 1,25? M Celastrol ou mais 10 uM de ABT-737 durante 12 h. Os níveis de ARNm foram determinados por Noxas em tempo real de RT-PCR em relação ao GAPDH como um controlo interno. células de E. HepG2 foram transfectadas com ATF4 siRNA de acordo com as recomendações do fabricante. Quarenta e oito horas após a transfecção, os lisados ​​foram colhidos e immunobloted com anticorpo ATF4. As células foram tratadas com F. 1,25 uM Celastrol durante 24 h. Os níveis de ARNm foram determinados por Noxas em tempo real de RT-PCR em relação ao GAPDH como um controlo interno. Os resultados foram semelhantes em pelo menos três experiências independentes. *,

p

. 0,05

10. A transcrição reversa PCR Ensaio

O ARN total foi preparado utilizando o Trizol, precipitada por álcool isopropílico e lavou-se com etanol a 70%. ADNc de cadeia simples foi preparado a partir do ARN purificado utilizando oligo (dT) iniciação (kit RT Thermoscript; Invitrogen), seguindo-se em tempo real SYBR-Green PCR (Qiagen). Os iniciadores foram como se segue: Noxas, 5′-ATGAATGCACCTTCACATTCCTCT-3 ‘, 5′-TCCAGCAGAGCTGGAAGTCGAGTGT-3’ [19]; ​​GAPDH, 5 ‘-di-TGCACCACCAACTGCTTAGC-3′, 5’-GGCATGGACTGTGGTCATGAG-3 ‘[20]. os níveis de expressão relativa de genes alvo foram normalizados com GAPDH o gene de controlo. Para a detecção de XBP1 splicing, as condições usadas para a transcrição reversa-PCR foram os seguintes: 10 min a 25 ° C, 60 min a 42 ° C e 15 min a 72 ° C. O ADNc foi submetido a amplificação por PCR utilizando o seguinte iniciador directo e inverso: XBP1, iniciador de sentido directo: 5’-CCTTG TAGTTGAGAACCAGG-3 ‘e o iniciador inverso: 5′-GGGGCTTGGTATATATGTG G-3’ [21]. Os produtos de PCR foram separados em gel de agarose a 1,0% e visualizado por coloração com brometo de etídio. Os géis foram fotografados usando um gel de DOC 2000 analisador de imagens (Bio-Rad, Hercules, CA, EUA).

11. Silenciamento da expressão de genes com pequeno ARN interferente (siRNA)

exponencialmente as células em crescimento foram semeadas em placas de 6 poços (4 × 10

4 /poço) e cultivadas durante a noite em 5% de CO

2 atmosfera a 37 ° C. Em seguida, o meio foi substituído com Opti-MEM I Reduced meio de soro (GIBCO) contendo 20,0 nM de Mcl-1 ou ATF4 siRNA (GenePharma, China) e oligofectamine reagente (Invitrogen Corporation) de acordo com as recomendações do fabricante. As sequências com sentido de siRNA foram como se segue: noxa: 5′-UCAGUCUACUGAUUUACUGG-3 ‘[22]; ATF4: 5’-GCGUAGUUCGCUAAGGUGAdTdT-3 ‘[23]. Quarenta e oito horas após a transfecção, as células foram colhidas e tratadas com veículo DMSO, concentrações seriadas de ABT-737, ou a combinação Celastrol.

12. Imunoprecipitação

As células foram colhidas e ressuspensas em lise universal /tampão de imunoprecipitação (Tris-HCl a 50, NaCl 150 mM, EDTA 2 mM, EGTA 2 mM, NaF 25 mM, 25 mM β-glicerofosfato, pH 7,5, ortovanadato de sódio 0,1 mM, PMSF 0,1 mM, 5 ug /ml de leupeptina, 0,2% de Triton X-100, 0,5% de Nonidet P-40) em gelo durante 30 min. Os lisados ​​foram centrifugados a 13000 rpm durante 30 min a 4 ° C. 300 ug de proteínas celulares foram pré-aclarados por adição de 1 ug de imunoglobulina normal L em conjunto com 50 ul de proteína A + conjugado apropriado G-agarose (Santa Cruz) durante 1 h a 4 ° C. As imunoprecipi tacões foram realizadas com o anticorpo primário apropriado durante a noite a 4 ° C. Complexos ligados à proteína A + G-agarose conjugado foram lavados sete vezes com tampão de lise /imunoprecipitação universal e fraccionados por SDS-PAGE. A análise Western blot foi então realizada.

13. Análise Estatística

índice de combinação (CI) é bem aceito para quantificar sinergismo de drogas com base na equação múltipla efeito da droga de Chou-Talalay [24]. No nosso estudo, cis para cada concentração de ABT-737, Celastrol e a combinação em ensaios de sobrevivência de células foram calculadas por software CalcuSyn (Biosoft, Cambridge, Reino Unido). Um CI inferior a 0,9 indica sinergismo; um IC de 0,9-1,10 indica aditivo; e uma CI superior a 1,10 indica antagonismo

As diferenças de população sub-G1, caspase-3 atividade e Bax /Bcl-2 ratiofor cada dois grupos (combinação

vs

ABT-737..; combinação

vs.

Celastrol), e as diferenças de caspase-3 /actina, clivada PARP /actina, e porcentagem de sobrevivência do grupo de combinação em Noxa silenciados células

vs.

controlar células de siRNA, dobre . mudanças no ARNm Noxas de Celastrol-tratados células em células ATF4 siRNA

vs

controlar células de ARNsi, foram avaliadas pelo teste t não emparelhado de Student dos dois lados e indicados com ** para p 0,01 e * para p 0,05. Para cada análise, três experimentos independentes foram conduzidos para obter os dados.

Resultados

1 citotoxicidade da combinação ABT-737 e Celastrol em linhas de células humanas carcinoma hepatocelular

Em primeiro lugar , usando o ensaio de MTT foi avaliada a citotoxicidade de ABT-737, Celastrol e a combinação nas concentrações indicadas, durante 72 horas em duas linhas celulares de carcinoma hepatocelular Bel-7402 e HepG2. Correspondentes curvas de sobrevivência foram fracção mostrado na Fig. 1. Em comparação com o ABT-737 ou Celastrol sozinho, a combinação de ABT-737 e Celastrol exerceu efeitos mais significativos de anti-proliferação em ambas Bel-7402 e HepG2. Os valores IC foram calculados por CalcuSyn Software nas concentrações de razão fixa de ABT-737 e Celastrol (Tabela 1). Synergy (CI 0,70) ou uma forte sinergia (CI 0,30). Foi observada em ambas as linhas de células de câncer testadas

2 ABT-737 Synergized com Celastrol para desencadear a apoptose

2.1 ABT-737, mais Celastrol apoptose induzida reforçada.

Ambos ABT-737 e Celastrol são relatados para modular a apoptose em células cancerosas, assim, somos inspirados a determinar os efeitos sinérgicos de ABT-737, mais Celastrol sobre a apoptose em células HepG2 Bel-7402 e . Em primeiro lugar, a coloração de PI para análise de conteúdo Sub-G1 foi utilizado para caracterizar a apoptose em células HepG2 tratadas com 10? M de ABT-737, 1,25 uM Celastrol ou a combinação durante 24 h, 48 h e 72 h e Bel-7402. Como mostrado na Fig. 2A, ABT-737 em combinação com Celastrol levou a uma maior apoptose do que os grupos mono-tratamento; As células que sofrem apoptose após tratamento de combinação aumentou o tempo-dependente. As diferenças de células em apoptose entre o tratamento de associação versus grupos mono-tratamento foram estatisticamente significantes em ambas as células HepG2 Bel-7402 e (*,

p Art 0,05; **,

p Art 0,01) (Fig. 2A). características morfológicas típicas da apoptose, incluindo a condensação da cromatina, fragmentação nuclear e a formação de corpos apoptóticos, também foram observados em 10 ^ M de ABT-737, Celastrol 1,25 uM ou Bel-7402 tratados com combinação e células HepG2 por coloração com DAPI. 10 uM de ABT-737 em combinação com 1,25 uM Celastrol induzidas corpos apoptóticos mais do que os mono-tratamentos (Fig. 2B). Caspase-3 é uma caspase efectora críticos nas vias apoptóticas, da qual o substrato é clássica poli (ADP-ribose) polimerase (PARP) [25]. Utilizando a análise de Western Blot, foram detectados a activação de caspase-3 e PARP de clivagem. Em ambas as células HepG2 Bel-7402 e, apesar de ABT-737 e Celastrol teve pouco efeito sobre a caspase-3 e PARP, a combinação causou clivagem muito mais significativa da caspase-3 e PARP (Fig. 2C). Em células HepG2, ao introduzir a caspase-3 de substrato específico Ac-DEVDPNA, ABT-737 e o co-tratamento Celastrol foi demonstrada para provocar um aumento acentuado na actividade da caspase-3 (4,2 vezes em comparação com o grupo de controlo) (Fig. 2D) , ao passo que os grupos mono-tratamento não exibido um evidente a activação de caspase-3 (1,1 vezes e 1,0 vezes, em Celastrol- e ABT-737-grupos, respectivamente), que foi em consistente com a observação na Fig. 2C, indicando ainda o sinergicamente apoptose induzida por ABT-737 e Celastrol. Em geral, estes dados demonstram que a combinação de ABT-737 e Celastrol resultou em apoptose aumentada em células Bel-7402 e HepG2.

2.2 Activação da via apoptótica mitocondrial-base foi desencadeada pela combinação de ABT-737 e Celastrol.

em seguida, o potencial de membrana mitocondrial na exposição células para ABT-737, ou a combinação Celastrol foi examinada por JC-1 coloração. O número de células mudando de vermelho para verde fluorescente indica a frequência de células que exibem a despolarização mitocondrial. Em 24 tratados com h células HepG2 Bel-7402 e, moderada fluorescência verde foi observada após os mono-tratamentos, enquanto fluorescência verde substituiu a maioria fluorescência vermelha após o tratamento de combinação de ABT-737 e Celastrol (Fig. 2E). Além disso, foram detectados os níveis de proteína de Bax, Bcl-2, Bcl-xL, bem como a libertação mitocondrial de citocromo c (Fig. 2F e 2G). Em ambos HepG2 e células Bel-7402, a acumulação da Bax foi detectado após tratamento de ABT-737 e Celastrol durante 24 h, em contraste, a Bcl-2 e Bcl-xL diminuíram após o tratamento combinado. Em seguida, avaliou a proporção de Bax /Bcl-2 e Bax /Bcl-xL em células HepG2, as quais desempenham um papel importante no aparecimento de apoptose [26]. A combinação de ABT-737 e Celastrol regulada positivamente de forma significativa a relação de Bax /Bcl-2 e Bax /Bcl-xL, aumentando 0,35-2,49 (Bax /Bcl-2) e 0,55-3,91 (Bax /Bcl-xL), respectivley (Fig. 2F). Além disso, a libertação do citocromo c evidente a partir mitocondrial para o citoplasma também foi induzido por ABT-737 mais a combinação Celastrol (Fig. 2G). Tomados em conjunto, estes resultados sugerem a via mitocondrial estava envolvida na apoptose desencadeada pela combinação de ABT-737 e Celastrol.

3 Cinética de Indução Noxas correlacionada com a activação da apoptose pela combinação de máquinas de ABT-737 e Celastrol

para a caracterização da maquinaria apoptótica sinérgica de ABT-737 e Celastrol, análise de western blot foi realizada em Bel-7402 e HepG2 células após a exposição a 10 mM ABT-737, 1,25 mM Celastrol ou a combinação de várias tempo intervalos. Em células Bel-7402, análise cinética apresentado que a indução de proteínas noxa se tornou detectável após exposição a 1,25 uM Celastrol ou a combinação durante 3 h. Enquanto isso, percebemos que a clivagem de PARP (indicando a ativação caspase) pela combinação tornou-se visível após 6 h (Fig. 3a). Em células HepG2, a indução de Noxas por 1,25 uM Celastrol ou a combinação, em comparação com células de Bel-7402, foi retardada com aparência após 24 h, seguido por clivagem de PARP menos sensíveis (Fig. 3B). Visivelmente, nas duas linhas celulares tumorais testadas, embora o tempo de activação da caspase e Noxas sobre-regulação eram diferentes um do outro, a indução Noxas foi seguramente observado anteriormente que a activação de caspases, o que implicava que no âmbito do tratamento de ABT-737, Celastrol ou a combinação, Noxas incremento foi desencadeada antes de a morte celular por apoptose, levantando a possibilidade de que a indução Noxas desempenhou um papel na apoptose induzida por ABT-737 mais Celastrol.

Além Noxas, notou-se que o expressão de uma outra duas BH3 somente proteínas Bim e PUMA também foi regulada pela combinação de ABT-737 e Celastrol (Fig. 3A e 3B), implicando que estes dois factores podem ajudar na promoção da apoptose por indução sinérgica pela combinação.

4 Noxa foi necessária em Augmentation potente de ABT-737 de matar por Celastrol

Como referido acima, Noxa provavelmente participar na apoptose induzida por tratamentos combinados de ABT-737 e Celastrol. Para identificar o envolvimento de Noxas e o seu papel na apoptose, que em primeiro lugar derrubado Noxas por transfecção com Noxas-specific siRNA em células HepG2 durante 48 h. A expressão de Noxas foi substancialmente reduzida por transfecção com Noxas siRNA (Fig. 4A). Em seguida, as células HepG2 transfecção Noxas siRNA foram tratadas com 10? M de ABT-737, Celastrol 1,25 uM ou a combinação de mais 48 h. FIG. 4B mostrou que siRNA específico-Noxas reduziu significativamente a clivagem de caspase-3 e PARP de ABT-737 em combinação com Celastrol. A partir de três experiências independentes, foram analisadas a proporção de clivada pela caspase-3 /β-actina e clivado-PARP /β-actina (Fig. 4C e 4D), que revelou que knockdown de Noxas evidentemente resultou no decréscimo dos rácios, sugerindo que a apoptose potente de ABT-737 mais Celastrol combinação reduzida em células Noxas-silenciados. Além disso, a transfecção de Noxas siRNA também cancelou o efeito anti-proliferativo sinergístico pela combinação de ABT-737 e Celastrol em células HepG2, com a fracção de sobrevivência das células engrandecimento de 57,14% a 93,56% (Fig. 4E). Estes dados demonstram que os efeitos anti-câncer de cooperação por ABT-737 e Celastrol necessário Noxa, dos quais knockdown atenuou os efeitos de citotoxicidade e apoptóticos de ABT-737, mais Celastrol.

5 Celastrol Promovido a Binding of Noxa para Mcl -1

a maior resistência a ABT-737 é pensado para ser a sua baixa afinidade com Mcl-1. Noxas é uma proteína única de BH3-que se podem ligar de forma eficiente a Mcl-1 e inibem os efeitos pró-sobrevivência de Mcl-1. Dada a indução de Noxas por Celastrol e o tratamento de combinação, foi possível determinar a interacção entre Noxas e o seu parceiro de alta afinidade de Mcl-1 que resultaram em complexos noxa /Mcl-1. Para esclarecer esta questão, imunoprecipitadas proteínas Mcl-1 e sondado para Noxa em células HepG2 tratadas com 10 mM ABT-737, Celastrol 1,25 mM ou a combinação de 24 h. Como revelado na Fig. 5A, Celastrol mono-tratamento aumentou a interacção de Mcl-1 e Noxas em células HepG2 e Noxas ligação a Mcl-1 significativamente elevados após o tratamento de combinação; nesse meio tempo, Mcl-1 níveis de proteína caiu em Celastrol-tratadas e células HepG2 tratadas com combinação. Realizamos ainda uma IP reversa usando anticorpos anti-Noxa, e também notou um incremento de Mcl-1 ligada com Noxa (Fig. 5B). Tomados em conjunto, a indução de Noxas por Celastrol encorajados a interacção de Noxas e Mcl-1, resultou na redução de Mcl-1, o que pode contribuir para a apoptose induzida por combinação melhorada ABT-737 e Celastrol.

6 -Celastrol causada Hsp90 inibição e ER-stress Response levou ao aumento de Noxa

6.1 Celastrol degradação induzida de proteínas cliente de Hsp90.

a fim de elucidar a relação entre os efeitos de metas de HSP90 [ ,,,0],27] e a indução Noxas em células Celastrol-expostas, a degradação de proteínas clientes Hsp90, tal como fosfo ERK1 /2 e CDK4, foi monitorizada por transferência de western, tanto Bel-7402 e células HepG2 com concentrações seriadas de Celastrol durante 3 h ( A Fig. 6A e 6B). Além disso, de acordo com o relatório anterior, Celastrol também o aumento da expressão de Hsp70, o qual é uma indicação de inibição da Hsp90 [28]. Desde proteínas clientes Hsp90 se tornar misfolded e ubiquitinada pela inibição de Hsp90 e são então regulada pela degradação proteossómica [29], nós então detectado se Celastrol poderia induzir ubiquitination proteína seguido por degradação proteossómica. Como mostrado na Fig.