Abstract

A microambiente hipóxico em tumores tem sido reconhecida como causa de doença maligna ou resistência a várias terapias contra o câncer. Em contraste com os recentes progressos na compreensão da resposta aguda de células cancerosas a hipoxia, as características das células tumorais em hipoxia crónica permanecem ainda desconhecidos. Nós identificámos uma linha celular de cancro pancreático, AsPC-1, que é excepcionalmente capaz de sobreviver durante semanas sob condições de oxigénio de 1%, enquanto a maioria testadas linhas celulares de cancro morrem depois de apenas alguns dias, sob estas condições. Em hipóxia crônica, as células AsPC-1 entrou em um estado de dormência caracterizada pela não proliferação, nenhuma morte, e supressão metabólica. Eles reversível ligado ao estado ativo depois de ser colocado novamente em condições ótimas de cultura. volume de negócios ATP, um indicador da procura de energia, foi marcadamente diminuída e acompanhada pela fosforilação AKT reduzida. activação forçada de AKT resultou em uma maior rotatividade ATP e morte celular maciça

in vitro

e uma diminuição do número de células dormentes

in vivo

. Em contraste com a maioria das linhas celulares de cancro, células de câncer colorretal primário-cultivadas entrou facilmente o estado dormente com supressão de AKT sob hipóxia combinada com as condições depleção de fator de crescimento. células de câncer colorretal primário em dormência eram resistentes à quimioterapia. Assim, a capacidade de sobreviver em um microambiente deteriorada entrando em dormência sob hipóxia crônica pode ser uma propriedade comum entre células cancerosas. Segmentação o mecanismo de regulação induzir este estado latente poderia fornecer uma nova estratégia para o tratamento do cancro

Citation:. Endo H, Okuyama H, Ohue M, Inoue M (2014) dormência das células cancerosas à supressão da actividade AKT Contribui para sobrevivência em hipóxia crônica. PLoS ONE 9 (6): e98858. doi: 10.1371 /journal.pone.0098858

editor: Pankaj K. Singh, University of Nebraska Medical Center, Estados Unidos da América

Recebido: 27 Janeiro, 2014; Aceito: 08 de maio de 2014; Publicação: 06 de junho de 2014

Direitos de autor: © 2014 Endo et al. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Licença Creative Commons Attribution, que permite uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o autor original ea fonte sejam creditados

Financiamento:. Este trabalho foi apoiado em parte por KAKENHI (25461937) (www.jsps.go.jp/j-grantsinaid/, HE, MI), o Charitable confiança Cancer Osaka (HE) Encontrado-pesquisador, Fundação Japão para Enzimologia Aplicada (www.mt- pharma.co.jp/jfae/, HE, HO, MI), Takeda Science Foundation (www.takeda-sci.or.jp/, MI), e da Fundação Naito (www.naito-f.or.jp/, MI). Os financiadores não tiveram nenhum papel no desenho do estudo, coleta de dados e análise, decisão de publicar ou preparação do manuscrito

CONFLITO DE INTERESSES:.. Os autores declararam que não existem interesses conflitantes

Introdução

O microambiente dentro de um tumor sólido pode ser altamente heterogênea [1]. Por causa das redes dos vasos sanguíneos incompletos e o desequilíbrio entre a proliferação e a angiogénese, o microambiente em algumas partes de um tumor sólido pode ser hipóxica e mal fornecido com nutrientes [2], [3]. Dependendo do seu microambiente, as células cancerígenas podem mostrar características bastante diferentes de actividade celular, incluindo a proliferação, a activação da via oncogénica, e metabolismo [4]. As células de tumor hipóxico em uma região distante de vasos sanguíneos mostram diminuição da proliferação [5] e a resistência à quimioterapia ou à radioterapia [6], [7]. Recentemente, usando um

in vivo

método gene-tagging, foi demonstrado que as células tumorais em regiões de hipóxia pode ser a origem de recidiva após radioterapia [8]. Também foi relatado que a mudança da expressão do gene em hipóxia crônica foi associada com altas taxas de recidiva em pacientes com câncer colorretal [9]. Investigar a biologia de células tumorais em condições de hipóxia poderá ser crítico para melhorar a eficácia terapêutica e para a erradicação do cancro. Após a descoberta do factor-1α indutível por hipoxia (HIF-1α), a regulação da transcrição em resposta a hipoxia aguda tem sido muito bem elucidado [10]. Em contraste com as respostas das células cancerosas a hipoxia aguda, no entanto, como as células cancerosas responde ao importante mas diferente condição de hipóxia crónica [11] permanece elusiva.

sinalização PI3K /AKT desempenha um papel central na sobrevivência, a proliferação e o metabolismo das células cancerosas [12]. Por causa da activação inapropriada de receptor tirosina cinase (RTK) ou PI3K, ou perda de função PTEN, activação constitutiva de AKT é frequentemente observado em vários cancros humanos [12]. Activado AKT promove vias glicolíticas ou biossintéticas, activando GLUT1, hexoquinase 2, ou liase de ATP-citrato. Uma das moléculas a jusante de PI3K /AKT é complexo mTOR 1 (mTORC1), o qual promove a síntese de proteína e o crescimento celular. Assim, AKT /caminhos mTORC1 desempenham papéis importantes para o crescimento do tumor e do metabolismo; No entanto, os materiais disponíveis para a biossíntese não são sempre abundantes no microambiente tumoral heterogénea. Na região hipóxica distantes dos vasos sanguíneos, sustentada activação da Akt /mTORC1 poderia conduzir a depleção de nutrientes essenciais e crise energética.

A capacidade de suprimir a taxa metabólica basal e entrar num estado é uma hipometab�ico salva-vidas para muitos organismos quando a fonte de energia, como oxigênio e nutrição são limitados [13], [14]. De facto, downregulation da atividade mTORC1 na hipóxia aguda é amplamente conhecido [15] – [17], e supressão de mTORC1 é declaradamente importante para a sobrevivência de células tumorais sob condições estressantes [4], [18], [19]. No entanto, como se referiu, a resposta crônica das células cancerosas é menos bem compreendido.

Um factor que impede uma melhor compreensão da resposta das células cancerosas à hipóxia crônica é a falta de

in vitro

modelos estabelecidos . A maioria dos estudos utilizando linhas celulares de cancro foram realizados dentro de 24 horas ou até poucos dias, porque a maioria das linhas celulares de cancro não podem sobreviver a depleção severa de oxigénio ou nutrientes, por um período mais longo. No presente estudo, verificou-se que uma linha de células de câncer de pâncreas, AsPC-1, pode sobreviver de forma estável por entrar em um estado inactivo, dormência, por semanas sob condições de hipóxia. Ao examinar a resposta celular a esta hipóxia crônica, descobrimos que a fosforilação de AKT foi regulada negativamente, permitindo que as células AsPC-1 para reduzir a demanda de energia e sobreviver sob condições estressantes. Além disso, descobrimos que células de câncer colorretal primário poderia facilmente entram em dormência em condições de privação de fator de hipóxia e de crescimento, em que eles mostraram personagens quimiorresistentes notáveis.

Resultados

Sobrevivência de células linhas sob crônica hipóxia

para investigar o efeito da hipóxia prolongada sobre as células cancerosas

in vitro

, examinamos várias câncer de pâncreas e linhas celulares de cancro colorrectal cultivadas em 1% de oxigénio durante mais de uma semana para representar a crônica condição, em oposição à estrutura mais curta de um ou dois dias para a condição aguda (Figura S1). A maioria das linhas de células testadas, não mostraram diminuição notável na proliferação celular e morreram dentro de 7 dias. Assim, foi geralmente difícil de linhas celulares de cancro da cultura durante uma semana sob condições hipóxicas.

Em contraste, AsPC-1, uma linha celular de cancro pancreático, foi excepcionalmente capaz de sobreviver sob condições de hipóxia prolongadas (Figura 1A e C). Na fase aguda, células AsPC-1 em hipoxia cresceram, bem como em condições de normóxia, mas a taxa de proliferação celular diminuiu gradualmente até 7 dias, e o número de células estabilizou em torno do dia 10 a menos de 80% de confluência nas condições experimentais. As células em normoxia mostrou morte celular massiva após 14 dias, provavelmente devido ao esgotamento de factores de crescimento ou nutrientes (Figura 1B e C). Em contraste, as células em hipoxia eram viáveis ​​durante mais de três semanas sem qualquer sinal de morte celular, enquanto o meio não foi alterado em tudo. Análise do ciclo celular revelaram que as células em fase S drasticamente diminuída no dia 7 em comparação com hipóxia no dia 1 em normoxia ou hipoxia (Figura 1D). As células foram acumulados em qualquer G0 /ou uma fase G2 /M. Esta diminuição da proliferação era reversível; uma vez re-oxigenado e re-plaqueadas em meio fresco, as células AsPC-1 mostrou uma recuperação da taxa de proliferação para controlar os níveis com um pequeno atraso, mesmo depois de ter sido cultivadas durante 14 dias em hipoxia (Figura 1E). Estes resultados indicaram que as células AsPC-1 poderia reversível inserir um estado inactivo, dormência, em condições de hipóxia prolongados.

número viável de células (A) e morte celular por cento (B) de células AsPC-1 cultivadas em normoxia ( 20% O

2) ou hipoxia (1% O

2). C) Fase-contraste e imagens manchadas de PI de células ASPC-1 cultivadas nas condições indicadas. Barra de escala = 50 mm. D) a análise do ciclo celular de células AsPC-1 no dia 1 em normoxia ou o dia 1 e no dia 7 em hipóxia. As células foram pulsadas com BrdU durante 2 h, e analisadas por citometria de fluxo, após coloração com anticorpo anti-BrdU e PI. As percentagens de células em fase S são indicadas. E) Re-crescimento de células ASPC-1 em um estado de dormência. células AsPC-1 foram cultivadas em hipoxia, durante 14 dias, e as contagens de células foram monitorados após a re-semeadura em condições de normóxia.

Como a maioria das drogas de quimioterapia alvo proliferação de células cancerosas, as células remanescentes em dormência seria resistentes a estes reagentes citotóxicos. Com efeito, as células AsPC-1 cultivadas em condições hipóxicas foram resistentes a todas as três drogas quimio examinados (Figura S2a). Ambos os níveis de oxigênio e taxa de proliferação influenciar a eficácia da radioterapia [20]. ASPC-1 em células estado dormente foram mais resistentes à irradiação de raios-X em comparação com as células em normoxia ou em hipoxia aguda (Figura S2B). Assim, AsPC-1 em células estado dormente eram resistentes à quimioterapia convencional ou radioterapia.

Avaliação do metabolismo energético em condições de hipoxia crónica

Foram avaliados ainda mais o estado do metabolismo energético das células cancerosas no estado dormente. Como esperado, as células AsPC-1 consumido mais glicose e lactato produzido mais na fase aguda de hipoxia em comparação com normóxia. Em contraste, após 7 dias de hipóxia, a absorção de glucose e produção de lactato gradualmente atenuada (Figura 2A, S3A e S3B). A taxa de consumo de oxigénio também foi reduzida em condições de hipoxia crónica (Figura 2A). Calculou-se o volume de negócios ATP a partir de taxa de produção de lactato e taxa de consumo de oxigênio (Figura 2A) e constatou que o volume de negócios diminuiu ATP sob hipóxia crônica. Esta conclusão foi também confirmada por uma diminuição mais lenta nos níveis de ATP celular após a adição de um cocktail de inibidores de glicólise e fosforilação oxidativa (Figura S3C e S3D) [21].

A) taxa de produção de lactato (esquerda) foi calculada a partir da concentração de lactato e número de células integrante em períodos indicados. O

2 taxa de consumo (médio) foi medida usando um eletrodo tipo de oxigénio Clark. volume de negócios ATP (à direita) foi calculado a partir da taxa de produção de lactato e O

2 taxa de consumo (cinza escuro: lactato; cinza claro: oxigênio). N1, normoxia um dia; H1, hipoxia 1 dia; H7, hipoxia 7 dias. **

p Art 0,01, ***

p Art 0,001. B) RT-PCR quantitativo de um transportador de glicose e as enzimas glicoliticas em células AsPC-1 cultivados em hipoxia para os dias indicados.

Para além destes ensaios, foram examinados os níveis de expressão do gene enzimas glicolíticas e transportadores (Figura 2B). Após a exposição à hipóxia aguda, a expressão de

GLUT1

,

HK2

, e

PDK1

aumentado. Em contraste, os níveis de expressão destes genes diminuiu nas células cancerosas em dormência. Estes resultados eram consistentes com a captação de glicose diminuiu em hipóxia crónica (Figura S3A). Tomados em conjunto, os resultados indicaram que as células cancerosas dormentes produziu menos ATP com menor consumo de ATP em comparação com as células em divisão ativa, sugerindo uma demanda de energia diminuiu. Assim, a supressão do processo metabólico é outra característica das células cancerosas no estado dormente.

sinalização intracelular em células do estado dormente

Em seguida, investigamos a sinalização intracelular no câncer de dormentes de estado células (Figura 3A). A fosforilação de AKT diminuiu após 7 dias de hipóxia, mesmo sob activação sustentada das RTK a montante (Figura S4A). A fosforilação de S6, uma molécula de jusante mTORC1, foi diminuída de um ponto temporal anterior, como foi relatado anteriormente [15], [16]. A sobre-regulação de fosfo-p38MAPK e regulação negativa de fosfo-ERK foram relatados para ser um interruptor molecular para a indução do estado dormente em várias linhas celulares de cancro [22], [23], mas observou-se pouca alteração nos seus níveis, e fosfo-p38MAPK foi bastante diminuído em hipoxia crónica. A fosforilação de eIF2α, que regula negativamente a síntese de proteínas subsequentemente mundial [24], foi regulado positivamente em hipoxia aguda, mas reduzido em hipóxia crónica (Figura S4A), sugerindo uma diferença fundamental na resposta de células sob estas duas condições. Os níveis de PHLPP, uma fosfatase específica de AKT Ser473-[25], [26], foram mutuamente aumentou com AKT-de fosforilação (Figura 3A).

A) de imunotransferência da AKT /mTORC1 ou ERK /p38 MAPK via em células AsPC-1 cultivados em hipoxia. B) Immunoblot de sinalização AKT e HIF-1α em células AsPC-1 com controle de vetores, AKT-peso, ou AKT-3A (inativo). C) estado do ciclo celular das células no dia 7 em hipoxia. Percentagens de células em fase S são indicados acima do enredo e no gráfico à direita. rotatividade D) ATP medida por adição de cocktail de inibidor para a glicólise e a fosforilação oxidativa. N1, normoxia um dia; H1, hipoxia 1 dia; H7, hipoxia 7 dias. E, F) o número de células viáveis ​​(E) e morte celular por cento (F) de células AsPC-1 cultivados em hipoxia. *

p Art 0,05, **

p Art 0,01, ***

p

. 0,001

Uma vez que o diminuiu a fosforilação de AKT coincidiu com a indução do estado inactivo, que examinaram o papel funcional da fosforilação de AKT em dormência. Nós transduzidas três AKT constrói em AsPC-1 células: wt-AKT, AKT-3A (forma inativa da AKT), e AKT-mΔPH (forma activa constitutiva da AKT) [27]. Quando wt-AKT ou AKT-mΔPH foi overexpressed, AKT fosforilação foi sustentado mesmo em hipóxia crônica (Figura 3B, S4B). Nas células de controlo, a expressão de GLUT1 aumentada em hipóxia aguda, mas diminuiu em hipóxia prolongada, novamente destacando uma resposta adversária nas duas condições. Em contraste, em células que sobre-expressam WT-AKT, níveis GLUT1 manteve-se elevada mesmo em hipóxia crónica (Figura 3B), acompanhada de consumo contínuo de glicose (Figura S4C). Por outro lado, S6 fosforilação em hipóxia crónica foi diminuída mesmo em células que sobre-expressam WT-AKT (Figura 3B). Análise do ciclo celular revelaram que a AKT-WT-sobre-expressando células em hipoxia crónica apresentaram uma taxa de proliferação mais elevada em comparação com células de controlo (Figura 3C, Figura S4D). Em células ASPC-1 expressando vetor de controle ou inativo AKT-3A, o volume de negócios ATP diminuiu após 7 dias de cultura em hipóxia (Figura 3D); No entanto, as células que expressam-AKT wt sustentada alta rotatividade ATP, mesmo em hipóxia crônica. Estes resultados indicaram que a ativação sustentada de AKT sinalização células inibidas AsPC-1 de entrar em um estado dormente em hipóxia crônica, o que implica um papel para a supressão de AKT em entrar de dormência. O número de células viáveis ​​diminuído, enquanto que a taxa de mortalidade aumentou após 14 dias em células WT-expressando-AKT (Figura 3E e F). células de AKT-mΔPH-expressam mostrou morte celular massiva em pontos de tempo iniciais sob condições hipóxicas (Figura S4E e S4F). Finalmente, quando PTEN, uma fosfatase de PI3K, foi derrubado, foi observado um ligeiro aumento da fosforilação de Akt, acompanhada por um aumento na morte de células em hipoxia crónica (Figura S5). Tomados em conjunto, estes resultados indicam que a supressão da fosforilação de Akt é funcional na sobrevivência das células cancerosas no estado dormente.

HIF-1a parcialmente contribui para a indução do estado dormente no hipóxia crónica

em seguida, examinou-se o contributo do HIF em células cancerosas inactivos (Figura S6). Os níveis de proteína de HIF-1α foram aumentadas após exposição a hipoxia e mantida até ao dia 7 (Figura S6D). Quando os níveis de HIF-1α foram forçados diminuiu shRNA (Figura S6A), o número de células viáveis ​​diminuiu após 7 dias, enquanto que a taxa de mortalidade aumentou (Figura S6B e S6C), sugerindo que sustentado HIF-1α também contribuiu para a sobrevivência celular em hipóxia crônica. Knockdown de HIF-1α teve pouco efeito sobre a sinalização de Akt /mTORC1 e pouco aumento dos níveis PS6 (Figura S6D), mas a sobre-expressão de AKT não teve nenhum efeito sobre a indução de HIF-1α (Figura 3B). Estes resultados indicaram que HIF-1α e AKT regulada de forma independente do estado dormente em hipóxia crônica.

A alteração do estado dormente

in vivo

pela ativação forçada de AKT

Em seguida, examinou as características de tumores derivados de AKT-mΔPH-expressam AsPC-1 células

in vivo

(Figura 4). A fosforilação de AKT foi detectável apenas nos tumores-AKT mΔPH mas não nos tumores de controlo (Figura 4A). Observou-se a regulação negativa da fosforilação S6 e bromodesoxiuridina absorção (BrdU) na área de pimonidazole-positiva e sua zona proximal em tumores de controlo, consistente com o nosso relatório anterior usando uma outra linha celular de cancro [4]. Estas áreas sugerem a existência de uma zona de dormência induzida por hipoxia

In vivo

. Em contraste, tumores AKT-mΔPH-expressam raramente continha a zona dormente na região pimonidazole-proximal. As células pS6- ou BrdU-positivas foram observadas, mesmo no limite de necrose (Figura 4A).

A) Imuno-histoquímica de células de xenotumors AsPC-1 que expressam o vector de controlo (superior) ou AKT-mΔPH (inferior) . N, necrose; barra de escala = 100 mm. B) percentagem de células positivas para BrdU na área distai ou proximal em relação pimonidazole-positivo zona. C) Largura da zona pimonidazole-positivo em tumores de vector ou AKT-mΔPH; *

p Art 0,05, ***

p

. 0,001

Foram quantificados ainda mais as células positivas para BrdU nas áreas proximal ou distal ao a zona pimonidazole-positivo (Figura 4B). A percentagem de células positivas para BrdU foi notavelmente diminuída na área proximal da região pimonidazole em comparação com a área distai em tumores de controlo. Em contraste, tumores AKT-mΔPH-expressam continham níveis elevados de células em proliferação mesmo na área proximal. Além disso, em tumores AKT-mΔPH, a área das células pimonidazole-positivas foi reduzida em relação aos tumores de controlo (Figura 4C), indicando que as células de AKT-mΔPH não poderia entrar num estado dormente

in vivo e

eram mais propensas à morte sob condições de hipóxia.

indução do estado dormente nas células de câncer colorretal primário

em seguida, examinamos se também foi observada a indução do estado dormente sob hipóxia crônica em células cancerosas cultivadas primárias . Recentemente, estabeleceu um novo sistema de cultura primária, CTOS (cancro originado esferóide-tecido), no colo-rectal, do pulmão, cancro urotelial e [28] – [30]. Preparamos amostras CTOs de pacientes com câncer colorretal e cultivaram-

in vitro

(Figura 5A e B). CTOS crescimento foi completamente inibida sob uma combinação de condições de privação de factor de crescimento e de hipoxia, hipoxia, embora por si só não foi suficiente para eliminar o crescimento. Testamos CTOS de três pacientes com cancro colo-rectal, e todas as amostras re-cresceu bem imediatamente após re-exposição ao oxigénio e Meio de Crescimento contendo fator (Figura 5C). Assim, a indução de dormência não foi restrita a células AsPC-1, mas também foi observada em células de cancro primário.

A) o crescimento foi medido por CTOS tamanho relativamente ao dia 0. amostras C45 CTOS foram cultivadas em meio com (GF +) ou sem fatores (GF) de crescimento. B) Imagens representativas de C45 CTOS cultivadas em condições indicadas. Barra de escala = 100 pm. C) Regrowth de CTOS no estado dormente após a re-oxigenação e exposição ao crescimento do meio contendo fator. D) A imuno-histoquímica de C45 CTOS cultivadas em condições indicadas durante 1 dia. TUNEL coloração foi no dia 14. Scale bar = 50 mm. E) de imunotransferência da sinalização AKT /mTORC1 e HIF-1α em C45 CTOS cultivadas em condições indicadas.

Além disso, nós examinamos sinalização intracelular em CTOS por imuno-histoquímica e imunotransferência (Figura 5D e E). A hipoxia combinado com o factor de crescimento depleção de sinalização AKT completamente bloqueada. Estes resultados eram consistentes com o crescimento CTOS (Figura 5A). Também medimos oxigênio e consumo de glicose em amostras de CTOs (Figura S7). A hipoxia e condições de privação de factores de crescimento atenuado severamente estes processos metabólicos, como também foi observada em células AsPC-1.

, em seguida, examinada a quimio-sensibilidade de CTOS em estado latente (Figura 6). amostras CTOs foram pré-cultivadas em condições de privação de fator de hipóxia e de crescimento durante 7 dias. Depois disso, eles foram expostos a 5-FU ou SN38, o metabolito activo de irinotecano, durante 7 dias, seguido de lavagem e de cultura em células estaminais embrionárias humanas StemPro fresco. As amostras CTOS no estado dormente mostrou recrescimento depois de ser devolvido para condições óptimas de cultura para uma dobra em 10 dose mais elevada do que as amostras CTOS no estado activo (Figura 6A e B). Estes resultados indicaram que as células cancerosas no estado dormente foram mais resistentes às quimioterapias do que aqueles em um estado ativo.

A) amostras CTOs foram cultivadas em meio com (GF +) ou sem (GF) fatores de crescimento, e menos de 20% O

2 ou 1% O

2 condições. 5FU ou SN38 foram adicionados a meio e tratou-se durante 7 dias (indicados por barras pretas). No dia 7, o meio foi alterado para fresco StemPro hESC contendo fatores de crescimento (setas pretas), e as amostras CTOs foram autorizados a voltar a crescer menos de 20% O

2. B) Imagens representativas de amostras CTOs em (A). Barra de escala = 100 mm.

Discussão

Foi demonstrado no presente estudo que a linha de células de um câncer e células de câncer colorretal primário alterar proliferação e estado metabólico em condições de hipóxia prolongados. Sob hipóxia crônica, as células poderiam entrar em um estado dormente envolvendo quatro características:. 1) não proliferação, 2) nenhuma morte, 3) supressão metabólica, e 4) recuperação ao estado ativo após a restauração das condições de cultivo óptimas

AKT é uma chave de proliferação celular molécula reguladora, a sobrevivência, e metabolismo. É amplamente aceito que a ativação de AKT contribui para a célula de sobrevivência e resistência aos medicamentos na hipóxia aguda [1], [31] – [33]. Em contraste, como se demonstrou aqui, em hipóxia crónica, a supressão da actividade de AKT é necessária para a indução de dormência e sobrevivência das células cancerosas. Porque o fornecimento de oxigênio e nutrientes seria restrita em uma área longe dos vasos sanguíneos em um tumor maligno, preservando a fonte de energia, diminuindo a demanda de energia pode ser uma estratégia de células cancerosas para sobreviver em um microambiente cronicamente deteriorada.

O mecanismo pelo qual a atividade AKT é suprimida em hipóxia crônica permanece uma questão em aberto. candidatos possíveis incluem 1) a inactivação de quinases a montante tais como PI3K RTKs e, 2) pelo circuito fechado de realimentação de activação S6K, ou 3) a activação de fosfatases, tais como PTEN e PHLPP. As duas primeiras possibilidades são pouco provável dadas as seguintes conclusões do trabalho atual: 1) fosforilação das RTK da família erbB e MET manteve-se elevada mesmo em hipóxia crônica (Figura S4A), e 2) a atividade mTORC1 é suprimida tanto na hipóxia aguda e crônica (Figura 3A). A terceira possibilidade é apoiada por nossas descobertas de que os níveis de aumento PHLPP em paralelo com a inactivação de AKT (Figura 3A) e que a supressão de morte forçado PTEN promovido em hipóxia crónica (Figura S5B). Um estudo mais aprofundado irá elucidar o mecanismo exacto.

Na resposta ao estresse em hipóxia, regulação negativa da actividade mTOR, a resposta proteína desdobrada, e ativação da transcrição do HIF foram bem estudados [10], [34]. REDD1 suprime a actividade mTORC1 através TSC1 /2 em hipóxia, resultando na inibição da tradução do mRNA Cap-dependente [15], [16]. Na resposta proteína desdobrada, uma quinase ER residente, Perk, fosforila eIF2α e suprime mRNA tradução [24]. Uma vez que a síntese de proteínas é um processo consumidor de energia, as vias de supressão pode desempenhar um papel na indução de dormência sob condições hipóxicas crónicas. Com efeito, observou-se supressão da actividade mTORC1 e um aumento da fosforilação de eIF2α em hipoxia aguda (Figura 3A, Figura S4A). Porque a proliferação celular e metabolismo foram sustentados na hipóxia aguda, que pode ser necessária, mas não suficiente para induzir a dormência em hipóxia crônica. HIF-1α e HIF-2α são fatores-chave de transcrição que regulam a resposta hipóxica [10]. Em hipoxia aguda, proteínas HIF são estabilizados e activar a transcrição de vários genes a jusante. Por outro lado, em hipóxia prolongada, proteínas HIF são supostamente reprimidos por mecanismos de feedback. Nos nossos resultados, no entanto, a expressão de HIF-1α manteve-se em estado dormente durante hipoxia prolongada (Figura S6D), e knockdown de HIF-1α resultou num aumento da morte de células em hipoxia crónica (Figura S6A e S6B), indicando que a expressão sustentada de HIF-1α também foi necessário para a sobrevivência de células AsPC-1 sob hipóxia crônica.

Apesar de proliferação descontrolada é uma característica marcante do câncer, os tumores humanos, bem como xenoenxertos de tumores humanos exibem índices de proliferação tão baixas como 20% [ ,,,0],35]. Estas células não proliferam em tumores têm sido, por vezes, referidas como células quiescentes. Recentemente, a teoria de células-tronco do câncer, em que são assumidos tumores a ser mantido por suas próprias células-tronco, tem sido intensamente testado [36]. Porque quietude é uma característica marcante de células-tronco adultas normais, as células-tronco do câncer de repouso ter sido especulado, mas a sua existência em tumores sólidos humanos não foi diretamente explorada [36]. Em células estaminais adultas, quiescência é definida como uma fase do ciclo celular, G0 [37], enquanto as células AsPC-1 no estado dormente estavam presentes no trabalho em curso, tanto G1 /G0 e G2 /M fases (Figura 1C). O estado dormente neste estudo pode ser diferente da quietude, mas as associações permanecem questões abertas.

dormência tumor tem sido estudada como a condição na qual os tumores permanecer assintomática por um longo período, anos em alguns casos [37], [38]. Dois modelos existem para a dormência tumor, dormência massa tumoral e dormência das células tumorais. O primeiro assume um estado de equilíbrio entre a proliferação celular e a morte celular, enquanto que no último caso, as células de tumor entrar paragem do ciclo celular e permanecer em repouso. A letargia induzida por hipoxia identificado no presente estudo, resultante de hipoxia em vez de crónica aguda, pode partilhar recursos com este último, mas as principais moléculas aqui identificadas diferem. Numa linha de células de carcinoma epidermóide, por exemplo, o saldo de fosfo-ERK e de fosfo-p38 MAPK tem sido relatada como sendo o interruptor molecular para a indução de dormência de células de tumor [39]. Sinalização a partir de uma receptores microambiente ou superfície celular desfavoráveis ​​regula positivamente fosfo-p38 MAPK e células, em seguida, entrar na fase G1 /G0. Em contraste, o evento chave para a indução do estado inactivo no presente trabalho foi a regulação negativa de pAKT mas não a activação da MAPK p38 (Figura 3A).

Entre as cinco linhas celulares testadas, apenas as células ASPC-1 podia inserir o estado dormente sob condições de hipóxia crónica (Figura 1 e S1). Em contraste, todas as três células de cancro colorrectal primário examinados poderia entrar num estado dormente sob uma combinação de crescimento e depleção de hipoxia fator (Figura 5). Porque linhas celulares de cancro são células selecionadas com uma vantagem de crescimento em condições de cultura com alta de oxigênio, nutrição e fatores de crescimento, eles poderiam ter perdido a capacidade de suprimir a proliferação em condições deterioradas. Assim, CTOS poderia oferecer uma plataforma para investigar a dormência das células cancerosas. Embora as células cancerígenas latentes não contribuem directamente para o crescimento de tumores, que pode ser um reservatório e uma fonte de células tumorigénicas e quimioresistência. O mecanismo de pAKT downregulation sob hipóxia crônica poderia ser um alvo de novas drogas destinadas a superar a resistência terapêutica.

Material e Métodos

Ética Declaração

Preparação e cultura de colorectal primário cancer de pacientes foram aprovados pela Comissão de Ética, Osaka centro médico para câncer e doenças cardiovasculares (OMCCCD) e espécimes cirúrgicos foram obtidos mediante consentimento informado por escrito. Os estudos em animais foram aprovados pelo Comitê Animal Care e Use o OMCCCD Institucional, e realizado em conformidade com as diretrizes institucionais.

Células e cultura de células

A linha de células de câncer de pâncreas, AsPC-1, foi obtida a partir da American Type Culture Collection (ATCC, Rockville, MD). AsPC-1 foi cultivada em meio RPMI 1640 suplementado com soro fetal bovino a 10%. cultura hipóxica foi conseguida por incubação das células com 1% de O

2 e 5% de CO

2 em uma incubadora Multigas (ASTEC, Fukuoka Japão). As células foram semeadas a uma densidade de 1 × 10

5 células por 35 mm prato para o número de células contagem e 2,5 × 10

5 células por 60 mm prato para RT-PCR e Western blot. A viabilidade celular foi avaliada pelo ensaio de exclusão de corante azul de tripano ou iodeto de propídio coloração (PI).

cultura primária do câncer colorretal

Preparação e cultura de células de câncer colorretal primário foram realizadas utilizando o método CTOS [28]. Resumidamente, as amostras cirúrgicas ou tumores de xenoenxertos de ratinhos NOD /SCID foram parcialmente digeridos com DH Liberase (Roche, Mannheim, Alemanha) e filtrado através de filtros de células. Fragmentos sobre a 100 mícrons ou 40 mícrons filtro de células (BD Falcon, Franklin Lakes, NJ) foram coletadas e cultivadas em StemPro hESC (GIBCO). Para a cultura hipóxica, as amostras CTOS foram embebidos em BD Matrigel Factor de Crescimento matriz reduzida (GFR) (BD Biosciences, San Jose, CA) e cultivadas em StemPro células estaminais embrionárias humanas ou meio basal (DMEM F12 /Glutamax, 0,1 mM de 2-mercapthoethanol, 2% bovina albumina de soro). Para o ensaio de quimio-sensibilidade durante o período inactivo, CTOS amostras foram pré-cultivados em meio basal inferior a 1% O

2 sub condições durante 7 dias, e depois tratada com 5-FU ou SN38. Após 7 dias de exposição a esses fármacos, as amostras foram re-CTOS oxigenado, e o meio de cultura foi alterado para células estaminais embrionárias humanas frescas StemPro.

ASPC-1 células

ciclo celular análise

foram cultivadas durante os períodos de tempo indicados, e marcado com 10 uM de BrdU para a duração de uma hora de cada tratamento. As células foram coradas com 5 ug /mL de anticorpo PI e anti-BrdU (BD Pharmingen). As células foram analisadas utilizando um Citómetro de Focagem Attune acústica (Life Technologies, Carlsbad, CA).

Medição de glicose e lactato

A concentração de glucose no meio de cultura foi medida através do teste de glucose 2 (Wako Puré Chemical Osaka, Japão). O lactato foi medida usando o ácido L-láctico (Roche, Darmstadt, Alemanha).

A medição de consumo de oxigénio

O oxigénio dissolvido foi medida usando um eléctrodo de oxigénio do tipo Clark (Modelo 203 F-Kit , Instech Laboratories). **

p Art 0,01.