Sumário

O rim é um órgão-alvo para a toxicidade de vários xenobióticos e também é altamente susceptíveis ao desenvolvimento de tumores malignos. Em ambos os casos,

in vitro

estudos fornecem uma visão para o dano celular, e representam modelos adequados para estudar tanto os mecanismos subjacentes aos efeitos tóxicos de várias nephrotoxicants ou abordagens terapêuticas no câncer renal. O desenvolvimento de métodos eficientes para o estabelecimento de modelos de células normais e de tumor renal humanos é, portanto, crucial. Neste estudo, um protocolo tecnicamente simples e rápido para o isolamento e cultura de células epiteliais tubulares proximais humanas e células de tumor renal humano a partir de espécimes cirúrgicos é apresentada. Os tecidos tumorais e normais foram processados ​​utilizando a mesma metodologia, com base na desagregação mecânica do tecido seguido de digestão enzimática e purificação de células através de uma peneira sequencial. O procedimento geral leva cerca de uma hora. As preparações de células resultantes têm excelentes viabilidades e rendimento. Estabelecimento de culturas primárias de todas as amostras foi realizada com sucesso. A origem da cultura de células primárias foi estabelecido através da avaliação morfológica. As células normais pureza foi confirmada por coloração de imunofluorescência e reverter análise de reação em cadeia de polimerase para a expressão de marcadores específicos

Citation:. Valente MJ, Henrique R, Costa VL, Jerónimo C, Carvalho F, Bastos ML, et al . (2011) A rápida e simples procedimento para o Estabelecimento de humanos normais e de cancro renal culturas de células primárias de espécimes cirúrgicos. PLoS ONE 6 (5): e19337. doi: 10.1371 /journal.pone.0019337

editor: Xin-yuan Guan, The University of Hong Kong, China

Recebido: 23 de dezembro de 2010; Aceito: 28 de março de 2011; Publicado em: 04 de maio de 2011

Direitos de autor: © 2011 Valente et al. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Licença Creative Commons Attribution, que permite uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o autor original ea fonte sejam creditados

Financiamento:. Os autores não têm apoio ou financiamento para relatar

Conflito de interesses:.. Os autores declararam que não existem interesses conflitantes

Introdução

As células humanas proximais tubulares epiteliais (HPTEC) correspondem a o principal tipo de célula do túbulo-intersticial cortical humano e, mais importante, para o principal objectivo de um grande número de xenobióticos, de drogas de abuso aos antibióticos, agentes antineoplásicos, metais e micotoxinas [1] – [5]. As culturas primárias de HPTEC pode fornecer um

in vitro

modelo bem caracterizado, representante fenotipicamente de HPTEC

in vivo

. Este

in vitro

sistema está aprovado para a investigação sobre a função das células do rim, processos de transporte e mecanismos celulares de lesão tubular proximal por xenobióticos, sem a interferência de outros fatores que estão associados ao

in vivo

experimentos . Para esse efeito, é essencial para alcançar as preparações HPTEC altamente enriquecido a partir de tecido de rim. Várias técnicas foram descritas para isolamento e cultura de HPTEC. Estes métodos têm sido baseados em técnicas morosas como centrifugação isopícnica ou Percoll com Nycodenz [6] – [9], ou mesmo protocolos complexos microdissecção com ou sem digestão enzimática [10], [11]. Os principais pontos fracos destas metodologias incluem baixos rendimentos e os procedimentos de trabalho intenso.

Em adição à toxicidade induzida xenobióticos-, o rim é também susceptível ao desenvolvimento de (por exemplo, oncocitoma) (por exemplo, célula renal benigno ou maligno, carcinoma, carcinoma de células renais) neoplasias. RCC compreende 85% de cancros renais em adultos, e mais de 3% das neoplasias malignas adultos. Com mais de 30.000 novos casos diagnosticados anualmente, é a sexta maior causa de morte relacionada ao câncer nos EUA, sendo responsável por cerca de 12.000 mortes por ano [12], [13]. De acordo com o seu aspecto histológico, RCC podem ser divididos em subtipos: pilha convencional ou claras, papilares, chromophobe e inclassificável RCC [14], [15]. Limpar célula RCC é a forma mais comum de câncer renal. Origina-se a partir do epitélio tubular proximal, e é responsável por 80 a 85% dos tumores de células renais [12], [15]. Papilar RCC é o segundo subtipo mais comum de cancro do rim, com uma prevalência de cerca de 10% dos tumores malignos renais, e é caracterizado por células de tumor dispostas em configuração papilar [16], [17]. Chromophobe é um subtipo raro de RCC, com uma prevalência de cerca de 5% dos tumores malignos renais. RCC celular tão clara, que se desenvolve no córtex renal [18], [19].

RCC etiologia é ainda não identificado, desenvolvendo tanto como uma forma esporádica ou como uma doença hereditária, e qualquer que seja o subtipo seja, é descrito como altamente resistente à radioterapia, quimioterapia e imunoterapia regimes convencionais [12], [15], [20]. Portanto, a descoberta de novas estratégias de intervenção terapêutica continua a ser uma prioridade. A este respeito, a cultura de células de células de tumor renal humano (HRTC) provou ser adequado um modelo in vitro para estudo de abordagens terapêuticas no CCR [15], [21] – [23]. Além disso, ao lado de estudos em culturas de células de tumor, é necessário testar a toxicidade de agentes terapêuticos potenciais em contrapartida as células normais. Portanto, é o principal objetivo deste estudo apresentar um método simples e rápido para o estabelecimento de culturas primárias de rim humano, tanto normal (HPTEC) e tumoral (HRTC), obtido a partir do mesmo órgão.

A procedimento aqui apresentado foi adaptado de métodos previamente estabelecidos [6], [9], [24] – [26], e usado para processar tecidos normais e tumorais. Baseia-se a desagregação mecânica do tecido seguido de digestão enzimática e purificação de células através de uma peneira sequencial. Esta técnica permite a separação de uma fracção celular que é altamente enriquecida em HPTEC ou HRTC a partir do córtex renal normal e, respectivamente, do tecido tumoral do rim, com muito maior rendimento e a viabilidade celular do que outros procedimentos de isolamento estabelecidos. O procedimento geral é tecnicamente simples, permitindo a sua fácil implementação em laboratórios de cultura de células.

Materiais e Métodos

Materiais

Os seguintes materiais foram obtidos de GIBCO ™ Invitrogen (Barcelona, Espanha), a menos que indicado de outra forma

meio de cultura celular:. de Dulbecco modificado por meio de Eagle com a mistura de nutriente F-12 (DMEM /F-12) e GlutaMAX-i ™ suplementado com soro fetal de bovino inactivado pelo calor a 10% (FBS ), penicilina /estreptomicina (50 U /mL /50 ng /ml), fungizona (2,5 ug /ml) e transferrina humana (5 ng /mL).

solução salina tamponada de Hank (HBSS) sem CaCl

2 e MgCl

2

solução de colagenase:. dissolvem-se 50 mg de colagenase tipo 2, 315 U /mg (Worthington, Lakewood, NJ) em 25 mL de meio não-suplementado cultura e esterilizado por filtração com filtro de 0,22 um. Usadas frescas

0,05% de tripsina-EDTA solução

solução de congelação:.. 90% FBS e 10% de dimetilsulfóxido

navio de incubação:. Autoclavado 250 mL Pyrex® vidro encamisado frasco (Vidrolab 2, Gandra, Portugal) com uma barra magnética nela. A temperatura da solução de colagenase no reservatório é mantido a 37 ° C por circulação de água quente através da camisa do balão

colagénio frascos revestidos (Fig. 1):. 75-cm

2 cultura de plástico frascos revestidos durante a noite a 37 ° C com uma solução /ml 40 ug de colagénio de pele de vitelo L bovina (Biochrom AG, Berlim, Alemanha) em PBS.

coadores de células esterilizado, com tamanhos de crivo de 100, 70, e 40 mm (BD Falcon ™, BD Biosciences, EUA).

0,4% Trypan solução de azul (Sigma Aldrich, St. Louis, MO).

AccuGENE® 1X PBS (Lonza Laboratories, Verviers , Bélgica)

imunocitoquímica coloração:.. monoclonal anti-pan anticorpo citoqueratina, o anticorpo anti-IgG de ratinho-FITC de cabra, e Hoechst 33258 (Sigma Aldrich, St. Louis, MO)

RT-PCR análise:. RNeasy Mini kit de isolamento de ARN (Qiagen, EUA) e RevertAid ™ H Minus primeiro carrinho Synthesis kit (Fermentas, Dinamarca)

Ética Declaração

este estudo foi aprovado pelo Comitê de Ética Institute-Porto o Português de Oncologia. Todos os pacientes entrevistados deram consentimento informado por escrito.

Recolha de Tecidos

amostras de tecido de rim humano foram obtidos a partir de um total de 6 pacientes (3 homens e 3 mulheres) submetidos a nefrectomia radical para carcinoma de células renais na português Instituto de Oncologia-Porto (IPO-Porto). A média de idade foi de 62 ± 5 anos de idade. Amostras de tecido (cerca de 10 g cada) foram recolhidas a partir de zonas macroscopicamente identificados como normal (no córtex) ou tumoral imediatamente depois da extracção da amostra, por um perito uropathologist. A natureza dessas áreas foi posteriormente confirmado por avaliação histopatológica das amostras de espelho. Os tecidos foram colocados em tubos de 50 mL estéreis separadas com meio de cultura gelado e em seguida transferidas para um laboratório de cultura de células em gelo.

Todos os espécimes foram submetidos a subsequente processamento de tecidos de rotina (fixação em formalina e embebidos em parafina). A análise histopatológica de secções para avaliar o tipo de câncer renal, classificação e estadiamento foi realizado no Departamento de Patologia da IPO-Porto.

HPTEC e Isolamento HRTC Protocolo

isolamento de células renais ocorreu dentro 30 minutos após a colheita de tecido renal. Todos os procedimentos subsequentes foram realizados numa câmara de fluxo de cultura de tecidos, em condições estéreis. Para evitar a contaminação cruzada celular, recomendamos manipular as amostras normais e tumorais em dois capuzes de cultura de tecidos individuais. Se isso não for possível, então, as seguintes orientações devem ser reforçados: apenas uma peça cirúrgica deve ser utilizado em um capuz de cultura de tecido em qualquer momento (durante este tempo manter a outros tecidos em gelo em um recipiente estéril), a capa deve ser limpa antes da introdução dos outros espécimes cirúrgicos, e garrafas ou alíquotas de meio deve ser dedicado para utilização com apenas as células normais ou tumorais.

no armário de cultura de laboratório, a transferência do tecido para um 60-mm Placa de Petri. Usando fórceps e tesouras, dissecar fora (i) a cápsula fibrosa e medula adjacente do tecido cortical e (ii) qualquer gordura, coágulos de sangue e tecidos conjuntivos a partir de tecidos tumorais.

corte da amostra de tecido em pequenos pedaços com bisturis.

Transfira os fragmentos de tecido para um tubo estéril de centrífuga de 50 mL, lave-os vigorosamente com HBSS gelada (contém EGTA que afrouxar junções celulares via ação quelante de cálcio) e decantar o sobrenadante. Repita este último passo até que a solução esteja livre de sangue.

Deitar fora o sobrenadante, transferir os fragmentos a um 60-mm placa de Petri limpo e finamente mediu o tecido em cerca de 1 mm

3 peças com bisturis.

Ressuspender os pequenos fragmentos em meio de cultura não complementado 25 ml pré-aquecido e combiná-lo com a solução de colagenase (1 mg /mL concentração final) no vaso de incubação. Incubar durante 20 minutos a 37 ° C com agitação suave.

Passe o tecido digerido para o primeiro crivo (100 um) para um tubo de centrífuga de 50 mL. O mesmo procedimento é então aplicado aos seguintes crivos (70 e 40? M). Peneiração através do crivo de 100 mícrons permite a remoção de qualquer tecido fibroso não digerido, enquanto que a função dos 70 e 40 mícrons é peneiras para remover contaminantes fragmentos tubulares e glomérulos, respectivamente.

Lavam-se as células por centrifugação peneiradas (400

g

, 5 min a 4 ° C), e ressuspender o pellet em HBSS. Repetir este processo mais duas vezes, e em seguida ressuspender o sedimento de células em meio de cultura com suplementos. Determinar o número e viabilidade celular em um hemocitômetro Neubauer usando a solução de azul de tripano.

A Figura 1 apresenta uma representação esquemática do procedimento geral.

celular Protocolo Cultura

semear as células isoladas no revestidos com colagénio 75 cm

2 frascos de cultura a uma densidade de 5 × 10

4 células /cm

2, e incubar numa atmosfera húmida de 95% de ar /5% de CO

2 a 37 ° C. (Nota: O meio RPMI 1640 com suplementos pode ser usado como alternativa para crescer HRTC)

Altere o meio de 24 h após a semeadura inicial e com intervalos de 48 depois

Permitir que as células a crescer até. -80% de confluência, antes de serem subcultivadas ou congelado.

Quando cultivados como descrito acima, as células atingem a confluência em aproximadamente 10-13 dias após a sementeira.

celular Subcultura Protocolo

Remover o meio de cultura de células e lava-se a monocamada de células, quer com HBSS pré-aquecido ou de PBS e 1 ml de tripsina-EDTA para enfraquecer a adesão celular à superfície dos frascos.

Adicionar suficiente solução de tripsina-EDTA para cobrir a superfície do balão e incubar a 37 ° C durante 3 min. Observe as células sob um microscópio óptico invertido para assegurar a separação celular adequada.

Terminar acção de tripsina, adicionando 10 mL de meio de crescimento suplementado e voltar a suspender as células isoladas pipetando repetidamente ao longo da superfície do frasco de cultura.

Transferência das células em suspensão para um tubo de centrifugação, lavar o balão com meio e adicione as células lavadas a um tubo de centrífuga. Semente da suspensão de células em um novo de 75 cm

2 frascos na proporção 01:03 subcultura.

Sob estas condições, HPTEC além da primeira confluência passagem alcance em 3-5 dias, e HRTC em 7 dias.

Criopreservação celular, descongelamento e Protocolo repique

Após tripsinização, transferir as células destacadas para um tubo de centrífuga e sedimentar as células por centrifugação (400

g

, 5 min a 4 ° C).

Ressuspender o sedimento de cada frasco em 3 mL de solução de congelamento.

Transfer suspensão de células de 1 ml para criotubos 2 mL e congelar imediatamente a -80 ° C .

para propagar novamente as suspensões, as células são rapidamente descongelados pela adição de meio pré-aquecido suplementado e transferido para um tubo de centrífuga de 15 ml.

sedimentar as células por centrifugação a 400

g

, por 5 minutos.

O pellet é ressuspenso em meio de cultura aquecido, e transferido para 75 cm

2 frascos, um frasco por frasco.

HPTEC e HRTC com sucesso são criopreservadas de ambas as células isoladas e suspensões de células obtidas após tripsinização, a manutenção de um crescimento normal após o descongelamento.

morfológica Avaliação

culturas em monocamada derivadas de todos os 12 isolados primários (6 normal, 4 claras RCC celular e 2 cromófobo RCC) e os correspondentes primeiros três passagens foram examinadas por microscopia de luz sob um microscópio óptico invertido. Uma linha imortalizada túbulo proximal células epiteliais derivadas de adulto normal de rim humano, HK-2 linha de células (ATCC, CRL-2190), foi também examinada para comparação.

imunocitoquímica coloração para Cytokeratin

Para investigar a origem epitelial das células renais normais e tumorais obtidas, a reactividade com o anticorpo anti-citoqueratina foi avaliada em suspensões de passagens 1 a 3. Duas linhas de células imortalizadas derivadas de normal (HK-2) e de tumor (a-498) de rim humano foram utilizadas como controlos positivos

Resumidamente, HPTEC ou HRTC foram cultivadas a cerca de semiconfluence em placas de 24 poços (densidade inicial: 1,0 × 10

5 células /poço)., lavou-se com PBS estéril, fixada para 20 minutos em 4%

P-

formaldeído e permeabilizadas durante 5 minutos em solução de 1% de Triton X-100. Após bloqueio com albumina de soro bovino a 1%, 0,4% de Triton X-100 e 4% de mistura de azida de sódio, as células foram incubadas durante a noite a 4 ° C com anticorpo anti-citoqueratina pan monoclonal de ratinho (1:100), e, em seguida, com cabra anticorpo anti-IgG de ratinho-FITC (1:100) durante 2 horas à temperatura ambiente. Após lavagem com PBS, os núcleos foram contrastadas com 5 ug /ml de Hoechst 33258 durante 5 minutos e em seguida lavadas com PBS mais uma vez. As imagens foram capturadas usando um microscópio de fluorescência (Nikon, Eclipse E400). controlos negativos apropriados foram incluídos para garantir a reactividade de anticorpo positiva.

Transcriptase Reversa-PCR (RT-PCR) Análise para marcadores específicos

suspensões (cerca de 3,0 x 10

6 células cada) de primeira passagem células normais a partir de 4 dadores foram analisadas por RT-PCR para confirmar a origem e a pureza dos isolados. Assim, avaliou-se a expressão do mRNA de três proteínas características: uromodulin (células tubulares distais), aquaporina 3 (células do dueto de recolha) e aminopeptidase A (células tubulares proximais). Resumidamente, o ARN foi extraído a partir de todas as amostras com RNeasy Mini kit de isolamento de ARN, e as concentrações foram determinadas usando um laser de Nd-1000 Nanodrop (NanoDrop Technologies, Wilmington, EUA). O ADNc foi preparado a partir de ARN usando o ™ H Minus RevertAid Primeira Síntese kit de suporte e, em seguida, amplificado por RT-PCR utilizando os iniciadores as sequências anteriormente publicadas e respectivas condições de recozimento [27]. Gliceraldeído 3-fosfato desidrogenase (GAPDH) foi utilizado como o gene de manutenção, uma mistura de células renais, como controlo positivo para todas as proteínas analisadas, e água como controlo negativo. produtos de RT-PCR foram carregados em não desnaturante 2% géis de agarose, corado com brometo de etídio e visualizados sob um transiluminador UV.

Resultados

Histopatologia

As culturas HRTC foram derivadas célula RCC clara (4 casos) ou chromophobe (2 casos) subtipos. Os casos de CCR de células claras foram compostas por células acinar ou um arranjo alveolar, que apresentou o citoplasma opticamente clara característica com membranas celulares distintos, tamanho nuclear variável e conspicuousness do nucléolo (Fig. 2A). Os casos RCC chromophobe foram caracterizados por células grandes, com citoplasma ligeiramente eosinofílica, as membranas celulares e os núcleos proeminentes de forma irregular (Fig. 2B). Ambos os casos corados difusamente no citoplasma com mancha de ferro coloidal de Hale.

(A) carcinoma de células renais Limpar celular, e (B) carcinoma de células renais chromophobe.

Características da célula primária culturas

a tabela 1 resume as principais características de cada doador, e os isolados correspondentes. O método proporciona preparações de células renais, com viabilidades excelentes celulares (96,5 ± 1,4% e 89,7 ± 4,1% para as células renais normais e de tumor, respectivamente) e o rendimento (18,7 ± 6,9 × 10

6 HPTEC /g de tecido cortical e 3,1 ± 4,7 × 10

6 HRTC /g de tecido tumoral). Tempo gasto, desde a coleta inicial dos espécimes rim para a semeadura de isolados, levou aproximadamente 1 hora.

O estabelecimento de culturas primárias foi atingido com sucesso de todas as amostras de tecido doze (6 a partir do córtex normal mais 4 a partir de células claras RCC e 2 da RCC chromophobe). Todos foram mantidas em cultura durante um mínimo de três passagens. células isoladas primárias, normal e de tumor-derivada, atingiram a confluência dentro de aproximadamente 10 dias. Após a primeira passagem, células epiteliais renais normais apresentaram uma maior propensão a proliferar

in vitro

do que as células tumorais. Todas as culturas primárias (primeira e subculturas) estavam livres de supercrescimento fibroblástica.

Na microscopia de contraste de fase, culturas primárias confluentes de células renais normais apresentaram uma morfologia muito homogénea. HPTEC em cultura apresentam uma aparência paralelepípedos (Fig. 3A), característica de células epiteliais, como as células HK-2 (Fig. 3B). A formação de cúpulas típicas (hemicysts) era visível quando as culturas se tornam altamente HPTEC confluentes, indicativa de transporte transepitelial do soluto pelas monocamadas.

(A) HPTEC primária, (B) HK-2 linha de células, (C) RCC primária clara celular, e (D) RCC chromophobe primário. Ampliação:. 400x

HRTC foram eficientemente isolado a partir de células RCC e cromófobo clara e caracterizados pela sua morfologia achatada e poligonal presença de vesículas lipídicas no citoplasma. Estes subtipos de tumor poderiam ser distinguidas pelo número e tamanho das vesículas: células claras apresentar todo o citoplasma ocupada por vesículas multidimensionais (Fig 3C.), Enquanto que em células chromophobe as vesículas apareceu em quantidades menores e dimensão, e o citoplasma não é ” vazia “, como em células claras RCC (Fig. 3D). aparência microscópica de luz de isolados primários (normais e tumorais) e os seguintes três passagens não era muito diferente. Cytokeratin foi expressa em todas as culturas primárias de RCC (Fig. 4), tendo a sua origem epitelial.

Hoechst 33258, coloração de anticorpos anti-citoqueratina, e fundiu imagens com dupla marcação de HPTEC cultivadas primário, de células claras e chromophobe células RCC. HK-2 e A-498 foram usadas como células de controlo de células de rim normal e de tumor epitelial humanas, respectivamente. Ampliação:. 200x

Para caracterizar adicionalmente as células tubulares proximais em cultura primária, a expressão de proteínas marcadoras específicas foi avaliada por coloração imunocitoquímica com anticorpo monoclonal de ratinho contra citoqueratina humana e análise por RT-PCR para uromodulin, aquaporina 3, e aminopeptidase A. Estas células expressaram citoqueratina uniformemente, o que era semelhante ao do HK-2 células (Fig. 4), confirmando assim a sua natureza epitelial. A análise de RT-PCR de culturas primárias HPTEC de 4 pacientes foi realizada. Todos os quatro isolados retiveram propriedades moleculares de HPTEC, que mostra expressão elevada de aminopeptidase A, a proteína característica das células tubulares proximais (Fig. 5). Além disso, as células tinham muito semana ou não tinham a expressão da tubular distal e recolhendo marcadores adesiva, uromodulin aquaporina e 3, respectivamente.

Uromodulin (marcador túbulo distal), aquaporina 3 (recolha marcador duto), e a aminopeptidase Um (marcador túbulo proximal) em HPTEC cultivadas primário derivado de 4 dadores e células HK-2. ARN isolado a partir de uma mistura de células renais foi usada como um controlo positivo e água como controlo negativo. Expressão da desidrogenase glyceraldehydes-3-fosfato (GAPDH) foi utilizado como um gene de manutenção da casa.

Discussão

Vários

in vitro

preparações renais têm sido usados para estudos fisiológicos e toxicológicos, incluindo rim isolado perfundido, fatias renais, os segmentos de nefrónios, linhas celulares e culturas primárias [28]. Entre estes, a cultura celular oferece as vantagens de uma maior disponibilidade do número de células e facilidade para executar várias experiências e repetidas durante períodos de tempo longos. A utilização de linhas celulares estabelecidas para estudos toxicológicos podem representar muitas limitações quando comparado com culturas primárias. Na verdade, o valor dos estudos toxicológicos realizados em células transformadas essencialmente pode ser questionável. É bem conhecido que linhas celulares imortalizadas submetidos a desdiferenciação (isto é, a perda da especificidade celular original), como resultado da passagem prolongada

In vitro

[29], e possuem características que não estão presentes no tecido de origem devido à sua imortalização. Portanto, uma resposta celular alterado a substâncias tóxicas pode ser visto. Em contraste, as culturas primárias retêm muitas das características fenotípicas do tecido original, incluindo as funções fisiológicas normais, e, portanto, pode ser modelos altamente relevantes para a descoberta de genes, validação de alvos, o teste de drogas, e do desenvolvimento de biomarcadores. Além disso, a utilização de vários doadores de amostras de tecido para gerar isolados independentes de células primárias permite que os investigadores demonstram respostas consistentes entre os indivíduos.

Apesar de vários autores têm relatado anteriormente métodos para isolamento e cultura primária de HPTEC [6], [9], [11] e HRTC [12], [14], a aplicação generalizada destes preparativos cultura humana tem sido prejudicada por rendimentos modestos e viabilidade celular prejudicada.

neste estudo, descrevemos um método otimizado para o estabelecimento de culturas de células primárias humanas de ambos os tecidos normais e tumorais, colhidas a partir de amostra do paciente imediatamente após o procedimento de nefrectomia radical. Digno de nota é que a coleta da amostra, logo após a ressecção possível é um fator importante para a obtenção de suspensões de células com alta viabilidade como há um claro declínio na quantidade de material cultivado com sucesso os mais longos os restos de tecido

ex vivo

[ ,,,0],24].

Dado que a localização túbulos proximal está totalmente confinada ao córtex renal, as culturas foram estabelecidas usando células isoladas por dissociação enzimática progressiva do córtex exterior extrema do rim humano normal. Triturar a amostra em pedaços pequenos permite uma boa remoção das células vermelhas do sangue durante as etapas iniciais de lavagem e maximiza a digestão enzimática. escolha apropriada de enzima, tempo de incubação, temperatura e concentração para melhor digestão são necessários para obter o melhor dissociação do tecido sem destruição excessiva. digestão de colagenase é conhecido por ser menos prejudicial para as células epiteliais que é a digestão com outras enzimas (como tripsina) e sob condições estabelecidas no nosso protocolo dá suspensões de células com maiores rendimentos e viabilidades do que as estabelecidas para os procedimentos de isolamento anteriores. filtração sequencial de colagenase digerir através de uma série de peneiros com tamanhos de malha decrescentes e remove os fragmentos tubulares glomérulos, e deixa material que produz crescimento de células epiteliais renais com um fenótipo proximal mais provavelmente devido ao seu elevado potencial proliferativo. Além disso, a primeira mudança de meio, 24 h após o plaqueamento, minimiza a ligação de outras células não epiteliais.

Um procedimento deve ser relativamente simples e rápido para minimizar os danos da membrana durante o isolamento e o tempo necessário antes de as células podem ser utilizado em experiências. Isto é conseguido no nosso método, uma vez que não inclui passos que consomem tempo, como de Percoll centrifugação em gradiente de densidade [6], [9], ou microdissecação complexo de [10], [11] ou técnicas imunomagnéticas [30]. O procedimento leva cerca de uma hora para realizar, permitindo, assim, um estabelecimento mais rápido de culturas de células primárias, quando comparado com HPTEC anterior ou protocolos de cultura HRTC.

O estabelecimento de culturas primárias foi atingido com sucesso de todos os espécimes cirúrgicos. Foi obtido um total de 12 culturas primárias renais diferentes. Entre essas culturas, 6 eram do córtex normal, 4 a partir de células claras RCC e 2 da RCC chromophobe. No nosso procedimento, as culturas de tumores primários levar mais tempo para chegar ao subconfluência além da primeira divisão do que as culturas córtex primários normais. As culturas primárias do córtex normal apresentaram uma morfologia homogênea, enquanto as culturas de tumor primário tinha uma morfologia mais heterogêneo. As culturas de células renais normais exibiu uma morfologia epitelial que foi consistente com as características relatadas para HPTEC [9], [24], [25]. análise microscópica óptica até a terceira passagem mostraram que essa morfologia diferenciada não alterou em subcultura. Nós não tentar verificar o tempo de vida das culturas normais ou tumores primários, pois é sabido que uma variação do fenótipo ocorre em passagens superiores [26], [29], [30]. O padrão de crescimento e morfologia de células HK-2 não difere daquela da HPTEC cultura primária, tal como avaliado por microscopia de luz. Importante, contaminação por fibroblastos não se observou nas nossas culturas primárias de curta duração, mas pode ser um problema após cultura primária mais longo ou mais subculturas. Para ultrapassar este problema, tem sido recomendada a substituição de L-valina por D-valina e L-arginina por L-ornitina em meio HPTEC [6] ou a utilização de meio de cultura livre de soro suplementado com hormonas [9].

a presença de marcadores específicos foi criado para caracterizar as culturas primárias HPTEC. Em particular, a natureza epitelial das culturas foi confirmado por HPTEC imunocitoquímica com coloração positiva para citoqueratina e a origem tubular proximal por RT-PCR com clara expressão do túbulo proximal escova fronteira enzima aminopeptidase A. Além disso, estas células mostraram muito fraca ou ausente expressão dos tubular distal e colector marcadores, uromodulin aquaporina e 3, respectivamente. Estes resultados indicam que as nossas culturas primárias HPTEC são originados a partir de células do túbulo proximal, sem contaminação significativa de células a partir de outras partes do nefrónio. Assim, o nosso método permite isolar e cultivar culturas primárias altamente diferenciadas, que expressam proteínas tubulares proximais específicos.

A homogeneidade citológico das nossas culturas primárias HPTEC foi avaliada por coloração imunocitoquímica para citoqueratina-se para a terceira passagem, e em todos os casos, as reações foram homogêneos em intensidade e tinha perfis idênticos.

caracterização celular realizado neste estudo corrobora outros estudos que mostram que as culturas HPTEC conservar as características diferenciadas do PTC para até três passagens [9], [31] . Este

in vitro

modelo pode ser utilizado para estudos sobre lesão renal, incluindo toxicidade induzida por xenobióticos em HPTEC, eliminando assim a necessidade de extrapolação a partir de culturas de células animais e mais representativa de células renais

in vivo

de linhas de células renais estabelecidos.

de nota é que estas células renais de túbulo proximal podem ser cultivadas em suportes de filtro de membrana permeável, resultando em células que morfológica e funcionalmente melhor representam sua

in vivo

homólogos. As células cultivadas em suportes de membrana estes são utilizados para estudar os sistemas de transporte proximal, bem como o efeito de diferentes xenobióticos em ambos os lados apical e basolateral da célula proximal tubular [32].

O procedimento foi também aplicado de forma eficiente para o isolamento de HRTC a partir de dois sub-tipos morfologicamente e geneticamente distintas de CCR, nomeadamente de células claras e RCC cromófobo. Ambos os tipos de desenvolver a partir de células corticais renais humanos. No entanto, CCRs células claras Acredita-se que se originam a partir do epitélio dos túbulos proximais convoluto, enquanto CCRs chromophobe parecem derivar do segmento cortical do ducto de recolha [33]. Enquanto as culturas primárias de células normais epiteliais de origem proximal apresentar uma morfologia muito homogénea, a heterogeneidade morfológica significativa entre as culturas de células claras RCC foram anotados. Este resultado está de acordo com relatórios anteriores que mostram variações de seu tamanho e forma [34]. As células apresentaram as características histológicas esperados descritos em estudos anteriores [18], [19], [35].

O método mostrou-se tecnicamente mais simples, mais rápido e com uma maior taxa de sucesso para o estabelecimento de tumor culturas primárias de espécimes cirúrgicos do que o estabelecido para os procedimentos anteriores de isolamento [12], [14]. As culturas primárias de cancros RCC são ferramentas úteis para estudar as alterações bioquímicas e moleculares associados com o status neoplásica. Além disso, o desenvolvimento das culturas RCC, a par com os seus homólogos normais correspondentes, pode produzir um modelo mais realista para o desenvolvimento e teste de novas modalidades terapêuticas.

Em conclusão, apresentamos um método útil e simples para o sucesso estabelecimento de culturas primárias derivadas de tecidos corticais e tumorais humanos normais frescos. Combina diferentes técnicas já descritas na literatura, e resulta num método de isolamento optimizado, obtendo-se preparações de células com excelente viabilidade e a recuperação.