Abstract

atividade androgênica desempenha um papel fundamental na progressão do cancro da próstata. receptor de androgénio (AR) é o principal mediador da actividade de androgénio na próstata, através da sua capacidade para actuar como um mediador de transcrição. Aqui foi realizada uma análise do genoma humano de AR ligação aos promotores na presença de um agonista ou antagonista de uma linha celular de cancro da próstata dependentes de androgénio. Muitos dos promotores AR ligados são ligados em todas as condições analisadas, enquanto outros estão ligados apenas na presença de um agonista ou antagonista. Vários motivos são enriquecidos na AR promotores ligados, incluindo o elemento de resposta AR (ARE) metade local e elementos de reconhecimento para os fatores de transcrição OCT1 e SOX9. Isto sugere que estes 3 fatores podem definir um módulo de fatores de transcrição que colaboraram na próstata. Curiosamente, os promotores AR ligados são preferencialmente localizado na AT regiões genômicas ricos. Análise da expressão de ARNm do factor de transcrição a montante do promotor-identificado de ovalbumina de galinha 1 (COUP-TF1) como um gene alvo AR directa que é regulada negativamente por ligação pelo agonista liganded AR. COUP-TF1 imunocoloração revelou localização nucleolar de COUP-TF1 em epitélio de cancro da próstata dependentes de androgénio humano, mas não no epitélio da próstata benigna adjacente. células do estroma tanto no show de próstata humana e do rato nuclear coloração COUP-TF1. Mostramos ainda que existe uma correlação inversa entre a expressão COUP-TF1 em células estromais da próstata e o aumento dos níveis de androgénio com o avanço da puberdade. Este estudo estende o conjunto de alvos AR putativos reconhecidos e identifica um alvo regular negativamente de AR – COUP-TF1 – que poderia desempenhar um papel no câncer de próstata humano

Citation:. Perets R, Kaplan T, Stein I , Hidas L, Tayeb S, Avraham E, et al. (2012) Análise de Genoma-Largo de Metas de receptor andrógeno revela COUP-TF1 como um jogador Novel no câncer de próstata humano. PLoS ONE 7 (10): e46467. doi: 10.1371 /journal.pone.0046467

editor: Jean-Marc A. Lobaccaro, Clermont Université, França |

Recebido: 31 de março de 2011; Aceito: 03 de setembro de 2012; Publicação: 04 de outubro de 2012

Direitos de autor: © Perets et al. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Licença Creative Commons Attribution, que permite uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o autor original ea fonte sejam creditados

Financiamento:. Esta pesquisa foi financiado pelo Dr. Miriam e Sheldon G. Adelson Medical Research Foundation (AMRF), Israel Science Foundation e da Fundação do cancro da próstata (EP). TK foi apoiada por uma Organização Europeu de Biologia Molecular (EMBO) de longo prazo bolsa de pós-doutoramento. Os financiadores não tiveram nenhum papel no desenho do estudo, coleta de dados e análise, decisão de publicar ou preparação do manuscrito

CONFLITO DE INTERESSES:.. Os autores declararam que não existem interesses conflitantes

Introdução

o câncer de próstata é o câncer mais comum não-pele em homens em os EUA, com um número estimado de 217,730 novos casos em os EUA em 2010 [1]. terapia de privação de andrógeno é atualmente o esteio de tratamento avançado de câncer de próstata. Privação de androgénio pode ser alcançado através da depleção de androgénios (por exemplo, o tratamento com agonistas da GnRH), por vezes em combinação com antagonistas de androgénio, tais como flutamida e bicalutamida [2] -. [4]

efeito de andrógeno em células da próstata normais e malignas é mediada através da sua capacidade para entrar nas células e se ligar ao seu receptor – o AR. Na ausência de um ligando do AR está localizado no citoplasma num complexo com proteínas de choque térmico (HSP) e co-chaperonas [5] – [7]. Após a ligação da AR androgénio sofre rearranjo estrutural que resulta na dissociação de HSP, a exposição do seu sinal de localização nuclear e a translocação para o núcleo. AR nuclear se liga ao ADN, recruta co-activadores e facilita a transcrição de genes alvo. A transcrição de genes alvo é considerada como sendo o principal meio pelo qual a AR afecta as células. Ligandos de receptores de esteróides ligados foram Acredita canonicamente de se ligar uma sequência de consenso de ADN que é composta por dois semi-sítios hexaméricas da sequência de consenso 5′-TGTTCT-3 ‘, disposta como repetições invertidas, separados por três nucleótidos [8] – [ ,,,0],15]; No entanto, este dogma foi recentemente sustentou que diz respeito à AR. Recentemente, foi sugerido, como suportado pelos nossos dados, que a metade local é suficiente para a ligação de AR com ADN na presença de androgénio [16] – [18]

Na presença de um antagonista de AR, tais. como flutamida, o complexo de transcrição AR ainda formas, ainda a transcrição de genes alvo AR bem conhecidos não ocorre possivelmente através do recrutamento de co-repressores. Por exemplo, por adição do antagonista de bicalutamida, AR desloca para dentro do núcleo, liga-se o promotor de PSA seu gene alvo bem conhecido e recruta co-repressores, tais como SMRT e NCoR [19], [20]. A formação do complexo de transcrição ligado AR antagonista foi amplamente estudada em promotores simples [19] – [21]. No entanto, a ocupação promotor de todo o genoma de antagonista ligado AR não foi estudado antes. Nossa hipótese é que em andrógeno células cancerosas da próstata dependente antagonista ligado AR liga um único conjunto de genes-alvo, que pode diferir dos genes-alvo de agonista AR ligado.

Utilizamos a análise de localização de todo o genoma da AR na presença de agonista, antagonista ou nenhum ligando para estudar as diferenças e semelhanças entre os genes-alvo AR nessas condições. Vimos vários promotores que são constitutivamente ligada na presença de um agonista e antagonista, bem como os promotores que são ligadas apenas na presença de qualquer um dos dois. Nós caracterizar ainda mais um romance AR gene alvo regulada negativamente COUP-TF1, que o promotor é obrigado apenas na presença do antagonista.

Resultados

genes alvo do andrógeno receptor em células cancerosas humanas da próstata

LAPC4 células cancerosas da próstata expressam tipo AR selvagem [22], o que reflecte o estado de AR dos cancros da próstata depende mais de andrógenos. Em algumas linhas de células de cancro da próstata, certos antagonistas de AR podem servir como agonistas, provavelmente devido à presença de um AR mutante [23] – [27]. Assim, temos primeiro testado o efeito de androgénio, ou antagonista de AR em crescimento de células LAPC4 in vitro quando comparada com células tratadas com veículo sozinho. LAPC4 células proliferaram na presença de androgénio, mas não na presença de um antagonista. Quando combinadas flutamida antagoniza o efeito proliferativo de androgénio (figura S1). Estes resultados confirmam a dependência de androgénio células LAPC4, flutamida mostram que serve como um antagonista do efeito proliferativo do AR e exclui a possibilidade de que a flutamida pode servir como um agonista de AR funcional nesta linha celular.

Para identificar o directa genes-alvo de AR nas células de cancro da próstata em presença de um agonista de AR, antagonista de AR, ou na ausência de ambos, as células foram primeiro LAPC4 andrógeno ablação durante três dias. As células foram então incubadas com veículo sozinho, 10 nM R1881 ou 40 uM flutamida durante 16 horas. Os comprimentos de activação e concentração R1881 foram escolhidos de acordo com o tempo de recrutamento AR máxima para o seu melhor PSA gene alvo estudados [28]. A cromatina de imuno-precipitação (ChIP) da cromatina AR ligado foi efectuada tal como descrito em materiais e métodos. A fracção precipitada imuno-e uma amostra de ADN de entrada foram hibridadas com uma micromatriz representando 19.000 promotores de genes humanos. Ligação de dados de três experiências ChIP-chip foi analisado e sondas que foram amarrados com valor de p . 0.001 foram considerados como promotores AR ligados (ARBs)

Uma análise dos genes-alvo AR só com veículo, R1881 e flutamida revelou três grupos de ARBs. Existe alguma sobreposição entre os genes-alvo, em que estas três condições, bem como os ARBs específicos para cada condição (Figura 1A e tabela S2). As listas de genes alvo revelou alguns genes que foram se sabe serem reguladas por AR tais como HOXB13 [29], [30]. Alguns genes alvo AR bem conhecidas, tais como PSA não foram recuperados nestas matrizes apesar do facto de que o gene de chips específico indicou que está ligado preferencialmente pela AR (figura S2a). Isto implica uma certa taxa de resultados falsos negativos. No entanto, como todo o conjunto de metas é desconhecida a taxa de falso negativo não pode ser estimado.

células LACP4 foram andrógeno privados durante 72 horas e depois tratados com o veículo (etanol), um andrógeno sintético (R1881) ou o antagonista de AR flutamida. As células foram fixadas 16 horas após o tratamento e chip na análise chip foi realizada para identificar AR promotores ligados. A. Número de AR ligado promotores em cada grupo de tratamento, e entre os grupos de sobreposição são apresentados no diagrama de Venn. Em cada grupo de tratamento foi analisada a sequência de sonda do promotor na matriz para a presença do elemento de resposta de AR clássica (ARE) ou a metade local. São mostrados frequências de sequências que contêm o site são ou meia encontrados em cada grupo de tratamento e da frequência em todas as sondas no array (de fundo). Um valor p de enriquecimento foi calculado com base na frequência de grupo em comparação com o fundo da matriz usando o teste t de estudante padrão. caixa de inserção mostra a sequência clássica elemento de resposta AR. B. Tabela mostrando o enriquecimento da ARE e metade site na sobreposição entre os grupos. Para cada par de condições experimentais a frequência de ARE e meia local é calculado em sobreposição promotores, e em todos os promotores de ambos os grupos. P-valor do enriquecimento em promotores sobrepostas em comparação com todos os promotores é calculada usando a distribuição hipergeométrica. C. Co-imunoprecipitação de AR e SOX9 em células LAPC4.

Genome-largos resultados da análise local foram validados utilizando gene da cromatina específica IP para oito dos ARBs em todos os três tratamentos (ver figura S2 e figura 2c). Cromatina IP foi realizada como descrito em Materiais e Métodos e PCR foi usado para quantificar a quantidade de um fragmento de ADN específico na fracção precipitada. Quantificação de enriquecimento foi feito por um método computacional imparcial. Usamos três enriquecimento vezes como o nosso corte de ligação (com base na ligação PSA-promotor, ver figura S2a). Temos validado vinculativo para oito locais genómicos, cada um na presença de veículo, agonista ou antagonista. Das 24 condições testadas 18 mostraram-se vinculado por AR na matriz. Desses, 16 foram ligados também por IP específico do gene. Portanto, concluímos que em 16/18 (89%) do promotor-condições testadas, os dados específicos de genes confirmou os dados da matriz, indicando uma taxa de falsos positivos de 11%.

A. LAPC4 células foram privadas de andrógeno durante 72 horas e, em seguida, tratada com um androgénio sintético (R1881), um antagonista de AR (flutamida) ou veículo (etanol) durante 24 horas. PCR em Tempo Real foi utilizado para quantificar os níveis de mRNA dos genes indicados. Cada nível de expressão foi ajustado a nível de ARNm de GAPDH e mostrado como mudança de dobragem de controlo tratado com veículo. Cada barra representa pelo menos quatro experimentos cada feito em triplicado. P-valor foi calculado utilizando o teste t de Student, em comparação com tratamento com veículo. B. análise de mancha ocidental mostrando COUP-TF1 e AR os níveis de expressão após tratamento com Flutamida ou R1881 durante 48 horas. Cada grupo de tratamento foi realizada em duplicado e mostrado. C. Análise da AR ligação ao locus genómico COUP-TF1. LAPC4 células foram privadas de andrógeno durante 72 horas e, em seguida, tratada com um androgénio sintético (R1881), um antagonista de AR (flutamida) ou veículo (etanol) durante 16 horas. Chip com um anticorpo anti AR foi realizada. PCR para as áreas indicadas rodeiam o local de início da transcrição COUP-TF1 em relação ao gene não ligado são apresentados para 3 diluições de entrada e fracção imunoprecipitada. Enriquecimento de se ligar a cada região em relação a um promotor não ligado (GAPDH) é quantificada por baixo de cada imagem. PCR para a UTR 5 ‘de COUP-TF1 é apresentada no painel superior (COUP-TF1 5’UTR), a ligação ao promotor COUP-TF1 é apresentado no painel do meio e da ligação a uma região a montante do promotor (COUP-TF1 a montante) é apresentada no painel mais inferior. D. representação esquemática de locais de ligação de AR no locus genómico circundante COUP-TF1 TSS, mostrado na Figura C. Verde barras representam áreas analisadas para a ligação ao AR. localizações genômicas de AR de ligação na presença de flutamida e R1881 são marcadas pelo verde e laranja triângulos respectivamente.

Nossos experimentos revelaram ligação constitutiva da AR ao promotor PSA na presença de veículo, R1881 ou flutamida (figura S2a), como esperado [20]. A ligação AR constitutiva foi validado por vários outros genes, como os novos ARBs

sox5

(Figura S2B),

dock1

(figura S2c) e

slitrk3

(figura S2E).

IL1R2

é um romance ARB, ligado na presença de qualquer um agonista ou antagonista, mas não sem um ligante (figuras S2F).

B3gnt5

promotor é obrigado pela AR apenas na presença de um agonista (figura S2D).

genes alvo AR estão uniformemente distribuídas ao longo das diferentes cromossomos para todos os ligantes testados, como analisado por Webgestalt [31] (figura S3).

Gene ontologia de anotação (GO) análise foi realizada para encontrar grupos funcionais que são enriquecidos dentro ARBs. Em todas as configurações ligando examinadas, apesar de grande variação de genes-alvo, as categorias enriquecido, foram as categorias envolvidas no DNA de ligação e actividade de transcrição (tabela 1).

são metade site é prevalente em sítios de ligação AR

Nós procuramos a prevalência do elemento de reconhecimento de andrógeno canônica no conjunto ARB identificamos, em comparação com todos os 18,051 sondas no array. Nós permitido por até dois desfasamentos nos 15 pb elemento de resposta andrógeno (ARE) de sequência. O ARE foi encontrada em 4% de todas as sondas sobre a matriz. Ao digitalizar a ARE nas três listas de ARBs havia apenas o enriquecimento leve são comparados com os de fundo no R1881 e grupos flutamida (Figura 1A). Ao digitalizar para ARE nos promotores que estavam presos em duas das condições, em comparação com a sua prevalência nos promotores de ambos os grupos, não houve enriquecimento (Figura 1B). Resultados semelhantes foram descritos por outros, tanto em promotores AR ligados e potenciadores AR ligados [16] – [18]. Assim, nossos resultados suportam a noção de que a canônica dogmática SÃO local não, por conta própria, desempenhar um papel fundamental nos processos de recrutamento AR.

Em seguida, perguntou se o estão a meio do site (5′-AGAACA-3 ‘) é enriquecida em qualquer dos grupos, sem desemparelhamentos. A meia-site foi pesquisado em ARBs em comparação com o fundo da matriz. A meia-site são verificou-se ser altamente enriquecido em todos os três grupos de ARBs (Figura 1A). Por conseguinte, a metade local previamente relatado que é prevalente em ARA na presença de um agonista [16] – [18] é também enriquecida na presença de um antagonista. O local de metade é enriquecido nos promotores que estão ligados em duas condições, em comparação com a sua prevalência em ambos os grupos em conjunto (Figura 1B). Por conseguinte, nas condições examinámos a metade local é um elemento de reconhecimento universais para o receptor de androgénio, independentemente do ligando.

e SOX9 OCT1 são AR putativo co-factores

A análise da sequência de BRAs foi usado para revelar factores de transcrição co-AR que poderia ser normalmente associadas com ela. A fim de procurar elementos de reconhecimento de fatores de transcrição conhecidos que usamos CIS [32] para digitalizar as ARBs para elementos de reconhecimento previamente definidos de factores de transcrição conhecidos. Os elementos enriquecido em cada grupo de ARBs podem ser vistos na Tabela 2. Entre esses elementos, alguns, tais como OCT e as famílias forkhead de factores de transcrição, foram anteriormente referida como estando envolvida na actividade de AR [17].

Nós encontramos elemento SOX9 a ser significativamente enriquecida em ARBs em todas as três condições testadas. Especificamente, no grupo tratado flutamida de BRAs elemento de reconhecimento SOX9 foi encontrado em 15% de ARA (p = 0,0003). Curiosamente, SOX9 foi recentemente descrito como activo na carcinogénese da próstata e embriogénese [33], [34] [35] e activada em resposta ao tratamento de androgénio no desenvolvimento precoce da próstata [34]. Assim SOX9 e co-imunoprecipitado AR nas células LAPC4 (Figura 1C). Tomados em conjunto, os nossos dados sugere SOX9 como um co-factor AR putativo.

Nós ainda desejava que procurar novos motivos que foram enriquecidos em ARBs através de

de novo

pesquisa motivo. Weeder [36], um

de novo

pesquisa motivo algoritmo, revelou a GCAAATCA motivo para ser enriquecido significativamente no grupo vinculado agonista, e uma análise mais aprofundada revelou que ele seja enriquecido em todos os grupos ARB (tabela 3 parte superior enumerative ). Esta sequência se sobrepõe ao reconhecimento OCT1 elemento ATGCAAAT canônico. O elemento de reconhecimento OCT1 canônica também é prevalente em nossa lista de ARBs embora não tão significativa como GCAAATCA (tabela 3 parte inferior).

ARBs são localizado na rica em AT regiões genômicas

para caracterizar ainda mais os ARBs foi calculado o teor de GC de todos os ARBs, e comparou-o para o conteúdo fundo GC da matriz. Surpreendentemente, descobrimos que as ARBs são altamente e significativamente AT rico. O conteúdo GC de toda a matriz é de 54,3%, enquanto o teor de GC do agonista e ARBs antagonistas são 46,4% (p = 1.6 * 10

-13) e 48,5% (p = 3.4 * 10

-5 ), respectivamente. De modo a confirmar que este fenómeno não é um viés de selecção da matriz, que comparou com o teor de GC das sondas ligadas MLL1 que foram publicados utilizando a mesma matriz [37]. sondas MLL1 ligados continha 56,1% GC, semelhante ao fundo da matriz. Para validar ainda mais este resultado foi calculado o teor de GC de previamente publicados promotores AR ligados. No Massie

et al. Conjunto

dados que analisados ​​andrógenos promotores ligados na presença de andrógeno [16] encontramos um conteúdo GC de 52,6% em comparação com 53,6% em toda a matriz (p = 0,0004). A fim de determinar que este não é um fenómeno geral de factores de transcrição examinámos o teor de GC de locais de ligação de p53 em resposta a irradiação [38]. O conteúdo de GC dos locais de ligação de p53 é de 55,7% em comparação com 52,5% para o fundo. Portanto, podemos concluir que AR tende a associar com a AT promotores ricos.

AR ligação ao promotor não é suficiente para a regulação de andrógeno de genes adjacentes

Para avaliar a relevância da AR ligação a transcrição medimos a expressão de mRNA de vários genes ARB sob as 3 diferentes tratamentos de andrógenos onde foram encontrados para ligar, usando PCR em tempo real. Como esperado, alguns BRAs mostraram a expressão aumentada mediante tratamento de androgénio e a diminuição da expressão após a adição do antagonista de flutamida. No entanto, outros, tais como ARA e Gli3 DOCK1 não exibir uma resposta androgénica nas condições do ensaio (Figura 2A). COUP-TF1, que foi sugerido por nossa análise de todo o genoma a ser vinculado pela AR em vários locais ao redor do local de início da transcrição (TSS), é regulado negativamente por andrógeno (figura 2a).

sintaxina 6 ( STX6) é uma proteína de vesícula transportador que foi recentemente mostrado ser regulado por p53 e necessária para a aderência de células de cancro e sobrevivência [39]. STX6 foi revelado pela nossa análise de localização de todo o genoma em se comprometer com AR na presença de qualquer R1881 ou flutamida. níveis de mRNA STX6 foram ligeiramente reprimidos por R1881, embora esta não atingiu significância estatística. No entanto, STX6 foi significativamente regulada pela flutamida (figura 2a).

Como esperado, o bem conhecido PSA alvo AR é regulada por andrógenos e para baixo regulada por flutamida.

Assim, AR ligação ao promotor sites podem estar associadas a qualquer regulação positiva, regulação baixa ou nenhuma mudança de transcrição.

regulação COUP-TF1 por agonistas e antagonistas AR

Nós ainda queria perguntar se obrigado flutamida AR tem um papel transcricional funcional . Para responder a esta pergunta que escolheu para se concentrar em um promotor activado flutamida – o promotor de ovalbumina de galinha Upstream Promotor – Fator de Transcrição 1 (COUP-TF1). COUP-TF1 é um receptor nuclear, órfão, que actua essencialmente como um repressor de transcrição [40], [41]. Nosso

in vivo

análise de ligação sugeriu que a RA se liga a sequência genómica a montante do local de início da transcrição de coup-TF1 em vários locais e da região 5 ‘não traduzida (UTR) do

coup-TF1

gene. A fim de estudar a regulação da COUP-TF1 por AR que primeiro ainda validado ligação do AR para as sequências genómicas que rodeiam o local de início da transcrição COUP-TF1. Na presença da flutamida antagonista de AR AR está ligado na área 2/1 kb a montante do TSS, no promotor COUP-TF1 e na direcção 5 ‘UTR do gene. No entanto, na presença de andrógenos a AR liga o kb área de 1-2 a montante da TSS, mas não o promotor ou 5’UTR (figura 2C e 2D).

Como descrito acima, os níveis COUP TF1-mRNA são regulados negativamente por andrógeno e regulada positivamente pela flutamida. Nós ainda validado esta observação ao nível da proteína por análise de Western blot. Os níveis de proteína COUP-TF1 em células LAPC4 não mudam após a adição de R1881 por 48 horas ao andrógeno células privadas. No entanto, na presença de flutamida, durante 48 horas, os níveis de proteína COUP-TF1 subir (figura 2b). Curiosamente, concomitantemente à regulação positiva de COUP-TF1, expressão AR é regulada negativamente pela adição de flutamida, demonstrando um loop de feedback negativo de ativação AR em células LAPC4. Em conclusão, como evidenciado por quantitativo em tempo real, PCR e análises de Western blot, antagonista de AR ligado regula positivamente COUP-TF1 em células LAPC4.

COUP-TF1 é expressa em células epiteliais da próstata maligno e não em epitélio normal da próstata

para examinar o padrão de expressão de COUP-TF1 na próstata humana e câncer de próstata foi utilizado imunohistoquímica para detectar COUP-TF1 em 28 amostras de tumores humanos. Detectamos COUP-TF1 no epitélio maligno de 21 dos 28 amostras primárias de câncer de próstata examinados. Não foi possível encontrar uma correlação entre a coloração COUP-TF1 e Gleason score ou recorrência da doença em ambos as células epiteliais ou do estroma. No entanto, conseguimos encontrar níveis significativamente mais elevados de coloração COUP-TF1 no epitélio da próstata neoplásicas e nos neoplasia pré-malignas da próstata intra-epitelial (PIN) em comparação com a coloração do epitélio da próstata benigno adjacente (Figura 3A e 3B). Isto sugere que a COUP-TF1 poderia desempenhar um papel nas fases iniciais de tumorigénese da próstata. Curiosamente, COUP-TF1 foi distribuído em células epiteliais em uma distribuição nucleolar, enquanto as células do estroma em torno das neoplasias epiteliais mostrou um padrão nuclear de coloração.

A. a coloração imuno-histoquímica de amostras de cancro da próstata humano e glândulas benignas adjacentes para COUP-TF1 mostra uma distribuição nucleolar de COUP-TF1 em células malignas (superior esquerdo) e nenhuma coloração COUP-TF1 na glândula benigno adjacente (inferior direito). As células estromais mostram coloração nuclear de COUP-TF1. Um representante de 28 amostras analisadas é mostrado. B. prostática neoplasia intra-epitelial (PIN) mostra a distribuição nucleolar de células estromais adjacentes COUP-TF1 e mostrar coloração nuclear. C. imunocoramento xenoenxertos LAPC4 mostra nucleolar coloração COUP-TF1.

A fim de confirmar COUP-TF1 especificidade do anticorpo temos manchado xenoenxertos LAPC4 para COUP-TF1 e encontrou uma distribuição nucleolar de COUP-TF1 ( Figura 3c) semelhante ao mostrado na distribuição epitélio cancro da próstata humano. análise de Western blot dessas células com o mesmo anticorpo COUP-TF1 revelou uma única banda de 46 KD, correspondendo a COUP-TF1.

Para validar a regulação negativa entre AR e COUP-TF1 na próstata nós usados ​​na pré-puberdade ratinhos Balb /c. ratinhos pré-púberes têm um baixo nível de testosterona em três semanas, com níveis aumentando à medida que o mouse atinge a puberdade [42] – [44]. Foram examinados os níveis COUP-TF1 nas próstatas de ratos em idades 3, 5 e 7 semanas. Consistente com as nossas observações, em amostras humanas, não houve coloração COUP-TF1 em epitélio normal da próstata do rato. No entanto, nós especificamente interessado em níveis COUP-TF1 no estroma da próstata (mesênquima uro-genital), por causa do papel crucial da bem reconhecido AR estromal da próstata em desenvolvimento [45], [46]. De células do estroma níveis COUP-TF1 diminuiu com a idade do rato (figura 4a). Especificamente, nós poderíamos ver uma correlação negativa entre os níveis de AR e COUP-TF1 em dutos de próstata individuais em todas as lâminas examinadas (compare figura 4b e 4c). Esses resultados mostram uma relação inversa entre a ativação AR e expressão COUP-TF1 no desenvolvimento normal da próstata.

próstatas de ratos pré puberal Balb /c em idades 3, 5, 7 semanas foram obtidos e uma mancha de imuno-histoquímica para COUP- TF1 foi pré-formada. Para cada grupo de idade, foram analisados ​​pelo menos 4 ratos. coloração de células do estroma para A. COUP-TF1 foi quantificada por um patologista como a percentagem de células do estroma coradas. Uma média de todos os lobos foi calculada para cada ratinho e utilizada para posterior análise. P-valor foi calculado utilizando o teste t de estudante em comparação à idade de 3 semanas. B. Um normal de três semanas de próstata do rato velho foi manchado por AR e c. COUP-TF1. Cortes seriados da mesma glândula são mostrados. As células epiteliais são positivos para AR e negativo para COUP-TF1. células do estroma peri-epiteliais, entre as linhas azul e amarelo, são negativas para AR e positivo para COUP-TF1. células estromais mais distantes da glândula, entre as linhas amarelas e verdes, são positivos para AR e negativo para COUP-TF1. Semelhantes padrões de coloração inversamente correlacionados foram vistos em todas as lâminas examinadas.

Discussão

A transição de câncer de próstata para o estado hormônio refratário é um importante ponto de viragem na progressão do câncer de próstata, e AR desempenha um papel importante nesta transição. Actualmente utilizada antagonistas de AR, tais como flutamida e bicalutamida, assumir o papel dos agonistas do receptor quando a doença torna-se hormona do refractário. A primeira evidência de esta transição de antagonista agonista foi inferida a partir da observação clínica de que pacientes com câncer de próstata tinha uma resposta significativa de 30% para a retirada de um antagonista da hormona esteróide como a primeira manobra após falha da terapia hormonal primário [47]. Este fenômeno levou os cientistas a explorar como antagonista de AR pode atuar como agonistas no câncer de próstata hormônio refratário. Dois estudos mostraram que, em HRPC, antagonistas de AR recrutar coativadores (em vez de co-repressores) ao PSA genes alvo AR ligado e KLK2 dar uma explicação mecanicista para este fenómeno [19], [20]. Nossa hipótese é que, para além desta mudança que está ocorrendo no nível do gene alvo único, há uma mudança global em genes alvo AR que poderia adicionar outra explicação para a observação clínica. Para este fim, em primeiro lugar desejado para comparar a ligação de AR associado ou a flutamida ou androgénio ADN in vivo.

A ligação do AR para o DNA, embora dependente de ligando, não é dependente de co-activadores. Por indução com flutamida, AR se liga ao promotor de PSA. O promotor de PSA também foi demonstrado em experiências diferentes para ser ligadas por AR sem qualquer ligando (Figura S2a), enquanto que o intensificador de não se liga unliganded AR [28]. Isto levou-nos para definir o espectro de ARBs entre AR unliganded, agonista AR ligado (R1881) e antagonista do AR liganded (flutamida).

Em nossa análise de localização de todo o genoma dos genes-alvo AR nós descobrimos promotores que são obrigado constitutivamente com ligando agonista, ligando antagonista ou nenhum ligando em todos (figura S2). Nenhum dos poucos genes que foram pensados ​​para ser vinculado apenas na presença de veículo de acordo com a nossa

in vivo análise de ligação

, foram validados em análise de imunoprecipitação de cromatina específicos de genes; Assim, é menos provável que induz a ligação do ligando de AR dissociação da cromatina.

Vários genes foram diferencialmente ligado por AR, na presença do agonista ou antagonista (Figura 2C e figura S2D). A fim de avaliar o efeito de se ligar a AR em transcrição foi medida a expressão de vários desses genes ARB 3 sob as diferentes condições de tratamento. Alguns dos genes constitutivamente ligados foram andrógeno regulados (por exemplo STX6 e PSA). Outros foram expressos em LAPC4 mas não regulada por androgénio, nas condições em que eles se ligam. Portanto, a ligação AR não é suficiente para a ativação da transcrição do ARBs ou para a regulação de andrógeno. É provável que as condições adicionais são necessários, tais como o recrutamento de co-activadores, factores de transcrição adicionais ou modificações de histonas. Alternativamente, AR poderia ser responsável pela iniciação da transcrição, mas não para o alongamento da transcrição que é necessário para genes transcritos activamente [48].

Esta ligação na presença de flutamida diferencial pode ser de importância especial quando se considera a antagonista agonista conversão no câncer de próstata hormônio refratário. É razoável supor que esses genes podem ser facilmente induzida na transição ao hormônio refractoriness uma vez que já estão vinculados por uma AR, e só necessitam de mais recrutar co-ativadores e da maquinaria de transcrição basal. Esta descoberta também poderia ter significado terapêutico que utiliza o conceito de letalidade sintética:. Esses genes alvo que só são ativadas em células flutamida tratados poderiam servir como alvos terapêuticos em combinação com flutamida

A fim de obter informação sobre a actividade da AR em androgénio cancro da próstata dependente de uma análise bioinformatical de genes alvo AR foi realizada. análise GO dos BRAs sugere que a AR exerce o seu efeito celular ligando-se a promotores de outros factores de transcrição na presença de todos os vários ligandos (Tabela 1). Isto sugere que a AR é um regulador mestre de células epiteliais da próstata.

Em seguida, olhou para o conhecido e

de novo

motivos em ARBs. Esta análise poderia identificar fatores de transcrição que atuam como co-reguladores da transcrição juntamente com a AR. Nossa análise revelou um motivo OCT1 não-consenso de que foi relatado anteriormente para ser envolvido em AR transcrição [49]. Análise de todos os motivos TRANSFAC conhecidos revelaram os dois motivos brachyury e SOX9 para ser altamente enriquecido em ARA de todos os grupos (Tabela 2).

Brachyuri é um membro da família de proteínas T box que é amplamente envolvidos na embriogénese [ ,,,0],50], e embora tenha sido relatado para ser expressa na próstata em expressão em larga escala analisa [51], e em várias linhas celulares de cancro da próstata [52], a sua função exacta não foi relatada.

SOX9, é um factor relacionado com Sry Grupo alta mobilidade (HMG) que foi previamente relatado para desempenhar um papel no desenvolvimento da próstata. Exprime-se o desenvolvimento de brotos epiteliais da próstata com expressão mais forte nas pontas distais dos gomos. Um defeito grave no desenvolvimento da próstata ventral foi observada em animais mutantes SOX9 [53]. O possível papel do SOX9 como um co-regulador AR deve ser mais avaliada. uma.