Abstract

Objectivo

Para investigar a prevalência, genótipos, e os valores prognósticos de Epstein-Barr vírus (EBV) e do papiloma humano (HPV) em pacientes japoneses com diferentes tipos de câncer de cabeça e pescoço (CCP).

Métodos e Materiais

HPV e DNA EBV, genótipos de EBV e

LMP-1

variantes, e expressão do mRNA do HPV foram detectados por PCR de amostras de HNC fresco congelado. genótipos de HPV foram determinadas por sequenciação directa e RNA EBV codificada (

EBER

) foi examinado por hibridação in situ.

Resultados

Dos 209 pacientes HNC, 63 (30,1 %) tinham infecção por HPV, e HPV-16 foi o subtipo mais comum (86,9%). HPV

E6 /E7

expressão de mRNA foi encontrado em 23 dos 60 (38,3%) casos de DNA-HPV positivo detectados. O local de maior prevalência de HPV foi a orofaringe (45,9%). Entre os 146 (69,9%) HNCS em que o ADN de EBV foi identificado, 107 (73,3%) e 27 (18,5%) continham tipos A e B, respectivamente, e 124 (84,9%) mostraram a existência de

del-LMP- 1 |. No entanto, apenas 13 (6,2%) HNCS foram positivas para

EBER

, 12 (92,3%) dos quais deriva da nasofaringe. Co-infecção de HPV e

EBER

foi encontrada em apenas 1,0% dos HNCS e 10,0% dos NPCs. Kaplan-Meier análise de sobrevivência mostrou significativamente melhor-doença específica e sobrevida global no DNA HPV + /mRNA + pacientes orofaringe carcinoma espinocelular (OPC) do que nos outros pacientes OPC (

P

= 0,027 e 0,017, respectivamente). A análise multivariada mostrou que a fase T1-3 (

P

= 0,002) e status do HPV mRNA-positivo (

P

= 0,061) previu independentemente melhor sobrevida específica da doença. Não foi encontrada diferença significativa na sobrevida específica da doença entre o

EBER

-positivo e doentes com NPC -negative (

P

= 0,155).

Conclusões

Nossas descobertas indicam que a co-infecção com o HPV e EBV é rara em HNC. SCC orofaríngea com a infecção pelo HPV activo foi relacionado a um resultado altamente favorável, enquanto estado de EBV não foi prognóstica no grupo NPC

Citation:. Deng Z, Uehara T, Maeda H, Hasegawa M, Matayoshi S, Kiyuna A , et ai. (2014) do vírus de Epstein-Barr e Infecções por Papillomavirus Humanos e Genótipo Distribuição em cânceres de cabeça e pescoço. PLoS ONE 9 (11): e113702. doi: 10.1371 /journal.pone.0113702

editor: Jeffrey Chalmers, The Ohio State University, Estados Unidos da América

Recebido: 18 de julho de 2014; Aceito: 28 de outubro de 2014; Publicação: 18 de novembro de 2014

Direitos de autor: © 2014 Deng et al. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Licença Creative Commons Attribution, que permite uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o autor original ea fonte sejam creditados

Data Availability:. O autores confirmam que todos os dados subjacentes às conclusões estão totalmente disponíveis sem restrições. Todos os dados relevantes estão dentro do papel

Financiamento:. Este estudo foi apoiado pela concessão KAKENHI 26462610 (Japão Sociedade para a Promoção da Ciência) para Dr. Suzuki, conceder KAKENHI 26.462.611 (Japão Sociedade para a Promoção da Ciência) o Dr. Deng, uma concessão do Okinawa Medical Science Research Foundation para Dr. Deng, e uma subvenção do Centro de Tecnologia de Desenvolvimento Ciência e do Ministério da Educação da República Popular da China para Dr. Deng. Este estudo também foi apoiado e realizado em cooperação com a Sociedade Ryukyu para a Promoção da Oto-Rhino-Laringologia. Os financiadores não tiveram nenhum papel no desenho do estudo, coleta de dados e análise, decisão de publicar ou preparação do manuscrito

CONFLITO DE INTERESSES:.. Os autores declararam que não existem interesses conflitantes

Introdução

Head and neck cancer (HNC) é o câncer sexta maior do mundo, com mais de 600.000 novos casos a cada ano [1]. excessivo de álcool e consumo de tabaco são dois fatores de risco tradicionais e importantes para HNC. Nas últimas duas décadas, a incidência de HNC, tais como carcinoma da laringe ou hipofaringe, tem diminuído significativamente devido a estratégias preventivas de segmentação destes factores de risco. No entanto, a incidência de carcinoma de células escamosas da orofaringe (OPC) aumentou acentuadamente, em particular nos jovens de início HNC na ausência destes fatores de risco tradicionais, o que sugere o envolvimento de outros fatores. O papilomavírus humano (HPV) é agora também um fator etiológico estabelecido para a ocorrência e desenvolvimento de HNC, especialmente OPC. Um aumento na proporção de câncer de orofaringe relacionados com o HPV foi observado nos Estados Unidos 1973-2004 [2]. Da mesma forma, dois estudos de coorte retrospectivo de Estocolmo, na Suécia, mostrou aumentos na proporção de HPV-positivo câncer tonsilar de 23,3% em 1970 para 93% para o período de 2006-2007 e no de base de HPV-positivo de câncer de língua de 58 % de 1998-2001 a 84% para 2006-2007 [3], [4]. Além disso, o facto de que o HPV é detectado em HNC não orofaríngea sugere que o seu papel no desenvolvimento e progressão de HNC não se limita à orofaringe [5], mas inclui a nasofaringe, em que o vírus de Epstein-Barr (EBV) é consistente detectados em células de cancro a partir de regiões de alta e baixa incidência [6].

o EBV é um vírus do herpes ubíquo que afecta mais de 90% da população adulta do mundo e está associada com uma variedade de desordens malignas, incluindo a doença de Hodgkin, linfoma de Burkitt, linfoma de células B [7], [8], [9], carcinoma gástrico e [10]. Na cabeça e pescoço, o estabelecimento de uma infecção latente de transformação EBV e as potenciais alterações genéticas virais que ocorrem em células epiteliais podem contribuir para o desenvolvimento, o crescimento, e capacidades invasivas do carcinoma nasofaríngeo (CNP) [6]. A análise de ADN de EBV plasma provou ser útil na detecção precoce NPC em indivíduos quando não há suspeita clínica de tumores [11]. Várias proteínas virais de EBV incluem as proteínas associadas à latência, proteínas de membrana latentes-1 e -2 (

LMP-1 | e

LMP-2

), e os antigénios nucleares de EBV (

EBNA1-6

) [9], [12]. EBV é classificado como tipo A ou B com base no polimorfismo ligada em

EBNA Restaurant –

2

,

-3A

,

-3b

, e

-3c

[13].

LMP-1

foi encontrado para ser um oncogene EBV [14]. Compreende um curto citoplasmático de aminoácidos N-terminal (aminoácidos 1-23), seis domínios que atravessam a transmembrana (aminoácidos 24-186), e um C-terminal (aminoácidos 187-386). Os domínios transmembranares que atravessam a de

LMP-1 | C-terminal e são necessárias para activação máxima do factor nuclear-kapa B (NF-kB), a activação dos quais está ligado à inibição da apoptose [15 ], [16], [17]. Uma deleção de 30 pares de bases (pb) na região 3’C-terminal da

LMP-1

gene (

del-LMP-1 |) tem sido relatada em NPC em pacientes chineses . Esta eliminação pode resultar em perda de aminoácidos 346-355 no

LMP-1 | proteína. A proteína de supressão tem uma meia-vida mais longa e confere a actividade aumentada de sinalização JNK /AP1 NF-Kappa B e nas células epiteliais. Estas propriedades de

del-LMP-1 | variante está localizada para os domínios transmembranares que atravessam e pode contribuir para um fenótipo mais maligno de NPC [18]. Estudos anteriores descobriram

del-LMP-1 | para estar presente em mais de 75% dos pacientes NPC no sudeste da Ásia e África do Norte [19], [20], [21]. A predominância de determinado

LMP-1

variantes em NPC podem refletir diferenças nas propriedades biológicas ou moleculares de

LMP-1

variantes. Além disso,

del-LMP-1

tem imunogenicidade mais baixa do que a variante não-del, o que pode dar origem ao desenvolvimento de tumores em hospedeiros imunocompetentes através escapar imunovigilância [22]. No entanto, a prevalência eo papel de EBV em HNC em outros locais do que os nasofaringe são controversos. Enquanto DNA do EBV foi identificado pela reação em cadeia da polimerase (PCR) em 72-92% do SCC oral, CEC de laringe e faringe casos SCC [23], [24], [25], [26], a prevalência da infecção pelo EBV com base em hibridação in situ (ISH) segmentação de ARN de EBV codificada (

EBER

), a concentração de ouro-padrão para determinar se um tumor de biópsia é relacionada com o EBV, é significativamente inconsistente nestes cancros [23], [27 ], [28], [29]. Além disso, NPC incidência difere entre as regiões geográficas e, apesar de a infecção EBV ocorre amplamente em todo o mundo, isso indica que um subtipo de EBV está envolvido no NPC.

A co-infecção com vírus e interações virus /virus diretos ou indiretos ter sido encontrada em alguns tumores malignos, e um exemplo típico de um tumor maligno devido a interacções vírus /vírus herpesvírus é associado ao sarcoma de Kaposi (KSHV) induzida por sarcoma de Kaposi, em pacientes com SIDA [30], [31]. Evidências recentes indicam que os indivíduos com HPV estão em risco significativamente maior de contrair a infecção pelo vírus da imunodeficiência humana (HIV) [32], [33]. A co-infecção do VPH e do vírus simplex do herpes 1 (HSV-1) é também visto em um subconjunto de casos de HNC [5]. Como o HPV eo EBV são os dois vírus mais comuns em HNC, deve ser esclarecido se a co-infecção leva a sua interação no HNC e por que a prevalência do HPV tem aumentado ao longo das últimas décadas.

Este estudo prospectivo investigou a frequência de genótipos de EBV,

del-LMP-1

variantes, e genótipos de HPV em amostras de fresco congelado de pacientes com HNC, a fim de analisar os efeitos do EBV e HPV co-infecção em diferentes tipos de HNC. Os resultados foram, então, examinados para associações com características clínicas e prognóstico.

Materiais e Métodos

As amostras clínicas e linhas celulares

Foram recrutados 209 pacientes com HNC patologicamente confirmada pelo Departamento de Otorrinolaringologia, Cirurgia de Cabeça e Pescoço da Universidade dos Ryukyus, Japão, entre Dezembro de 2006 e Março de 2014. Escrito, o consentimento informado foi obtido de cada paciente e do protocolo de pesquisa foi aprovado pelo Comitê da Universidade do Ryukyus Ética. As amostras de tecidos obtidas por biópsia ou excisão cirúrgica foram congelados instantaneamente em azoto líquido e armazenado até análise posterior.

As linhas de células CaSki (ECACC, Salisbury, Reino Unido) e Raji (ATCC, Tóquio, Japão) foram usadas como controles para a amplificação do HPV

L1

e

E6 /E7

genes eo EBV

LMP-1 | e

EBNA-3C

genes, respectivamente , e cultivadas de acordo com as instruções do fornecedor.

extracção de ADN e PCR para a detecção de ADN de HPV e EBV do ADN

DNA foi extraído das amostras e células utilizando o Kit de purificação de tecido Gentra (Qiagen, Germantown, MD) de acordo com o protocolo do fabricante. A presença e a integridade do ADN em todas as amostras foi verificada por PCR uma amplificação do gene da globina utilizando iniciadores de PC04 e GH20 [34].

A presença de DNA de HPV foram analisados ​​por PCR utilizando os conjuntos de iniciadores de consenso geral

GP5 + /GP6 + Comprar e

MY09 /11

[35], [36]. Amostras de DNA negativos para o HPV utilizando

GP5 + /GP6 +

ou

MY09 /11

foram re-amplificado por (auto-) nested PCR usando o

GP5 + /GP6 +

par de iniciadores como previamente descrito [37]. Água (controlo negativo) e de ADN a partir de células CaSki-HPV-16 positivo (controlo positivo) foram incluídos em cada série de amplificação. Os produtos de PCR foram purificados e sequenciados directamente com um ABI Prism 3130 × G Genetic Analyzer (Applied Biosystems, Carlsbad, CA). As sequências foram alinhadas e comparadas com as dos tipos de HPV conhecidos na base de dados GenBank utilizando o programa BLAST.

presença de ADN de EBV e tipagem foi realizada por PCR utilizando iniciadores que abrangem o

EBNA-3C

gene como descrito anterior [13]. Devido aos locais de primers regiões de variação de tipo específico de acompanhamento, os produtos de PCR resultantes foram dois tamanhos diferentes derivados de

EBV-A

(153 pb) e

EBV-B

(246 pb) ( Figura 1). Como controlos positivos, as amostras positivas dois EBV do tipo A e tipo B, confirmados por PCR e sequenciação directa foram incluídos em cada reacção de PCR

Painel central:. uma banda específica 316 bp mostrou tipo selvagem

LMP -1

(amostras 3, 4, 6, 7 e controlo positivo PC-1) e uma banda específica 286 pb indicou a eliminação de 30 bp

LMP-1 | (amostras 1, 2, 5, e PC-2). Os produtos de controlos positivos foram confirmados por sequenciação directa. painel inferior: a sequência de eliminação de 30 pb do

del-LMP-1 | de tipo selvagem LMP-1 por análise da sequência

Nós também examinou o

LMP-1.

gene como relatado anteriormente [19]. O protótipo linha celular Raji (ATCC), que retém o carboxi terminal de 30 pb, produz um fragmento de 316 pb e foi utilizado como um controlo positivo para o tipo selvagem

LMP-1 |. Acredita-se que as amostras com um comprimento mais curto do produto PCR do que a observada com Raji para conter o

LMP-1 | eliminação (

del-LMP-1 |, 286 fragmento pb). Além disso, uma amostra com uma variante de deleção de 30 pb verificada por PCR e sequenciação directa foi também incluído em cada reacção de PCR.

A detecção de HPV

E6 /E7

ARNm por PCR de transcrição reversa

o ARN total extraído de amostras de tumores utilizando o kit de ARN total ™ (Ambion, Austin, TX) de acordo com os protocolos do fabricante foi suspenso em 50 ul de ultra-alta qualidade dietílico água tratada com pirocarbonato.

Antes a síntese de ADNc, qualquer ADN residual foi removido através de incubação com 1 U de DNase I (Ambion) à temperatura ambiente durante 25 min. O ADNc foi em seguida sintetizado a partir de ARN total livre de ADN utilizando o Kit RETROscript® (Ambion) de acordo com as instruções do fabricante. Para examinar a presença de ADN contaminante nas amostras de ARN, todos os ensaios foram realizados com e sem transcriptase inversa.

Para detectar de alto risco

E6 /E7

transcritos de ARNm, a PCR foi realizada com cDNA obtido a partir de HPV amostras de DNA positivos usando o TaKaRa PCR Papilomavírus Humano Typing Set (Takara Bio Inc., Otsu, Japão), que pode identificar tipos de alto risco de HPV 16, 18, 31, 33, 35, 52 e 58. para verificar os HPV-16

E6 /E7

transcritos de ARNm, os HPV-16 amostras de ADN-positivas também foram examinados usando uma abordagem semi-nested PCR com ADNc, como anteriormente descrito [38].

ISH para

EBER

A presença de EBV em células cancerosas foi confirmada por ISH para

EBER

. Resumidamente, secções de 4 um de espessura dos blocos embebidos em parafina formalina-fixação foram desparafinados, re-hidratados, e pré-digeridas com proteinase K. A solução de hibridação que continha isotiocianato de fluoresceína (FITC) -conjugated sonda de oligonucleótido de EBV (

EBER

sonda PNA, cocktails de

EBER 1 | e

2

; Dako, Glostrup, Dinamarca) foi aplicada durante 90 minutos a 55 ° C. Um kit de detecção de Dako ISH (código N ° S5201) com coelho F (ab ‘) 2 anti-FITC e anticorpo de enzima de substrato (5-bromo-4-cloro-3-indolilo e azul de nitrotetrazólio) foi utilizado para visualizar os produtos de hibridação. lâminas coradas foram contra-coradas com Fast Red Nuclear (Vector Laboratories, Burlingame, CA). sinais de azul-escuro que aparecem dentro do núcleo foram reconhecidos como

EBER

positivo.

A análise estatística

As estatísticas descritivas foram utilizadas para caracterizar características iniciais dos doentes. O U-teste de Mann-Whitney ou Kruskal-Wallis foi utilizado para variáveis ​​contínuas e teste de Pearson Chi-quadrado ou teste exato de Fisher foi utilizado para variáveis ​​categóricas.

sobrevida livre de recorrência foi definida como o tempo desde o fim do tratamento de recorrência do câncer ou o último follow-up. sobrevivência específica da doença foi definida como o tempo desde o fim do tratamento para subsidência da doença ou último seguimento. As curvas de sobrevida foram avaliados pelo método de Kaplan-Meier, e distribuições de sobrevivência foram comparadas pelo teste de log-rank.

P

valores inferiores a 0,05 foram considerados significativos. Todas as análises estatísticas foram realizadas utilizando software SPSS (SPSS para Windows versão 12.0; SPSS, Inc., Chicago, IL).

Resultados

características clínico-patológicos do paciente

Localização o tumor primário foi a nasofaringe em 20 pacientes (9,6%), orofaringe em 74 (35,4%), hipofaringe em 50 (23,9%), laringe em 28 (13,4%), e cavidade oral em 37 (17,7%). Dos 209 pacientes, 168 receberam tratamento curativo (quimioradioterapia concomitante em 73, cirurgia e radioterapia pós-operatória ou quimioradioterapia (dosagem de radiação, 50-54 Gy) em 51, a cirurgia sozinho em 27, e terapia de radiação sozinho em 17), 30 pacientes receberam tratamento paliativo, e 11 não teve tratamento. características demográficas e clínicas estão resumidos na Tabela 1.

infecção pelo HPV e genótipos em HNC

DNA do HPV foi detectado em 30,1% (63/209) dos 209 pacientes, ea orofaringe foi o local de maior prevalência (45,9%; 34/74). A genotipagem das neoplasias mostrou que a maioria das amostras de ADN de HPV-positivos continham de alto risco de HPV-16 (86,9%; 53/63 tumores). Os outros tipos de HPV incluídos HPV-33 (4 casos), o HPV-35 (2 casos), o HPV-56 (1 caso), o HPV-58 (2 casos), e HPV-67 (1 caso). Há vários tipos de HPV de infecção ou de baixo risco foram encontrados (Tabela 1).

Das amostras de ADN-positivas 63 de HPV, 60 estavam disponíveis para extração de RNA e HPV

E6 /E7

expressão de mRNA foi encontrada em 23 (38,3%) deles. Curiosamente, a maioria do HPV

E6 /E7

tumores ARNm-positivos (87,0%; 20/23) derivada da orofaringe. Enquanto 60,6% (20/33) de HPV OPCs ADN-positivas foram positivas para a expressão do mRNA do HPV viral, HPV

E6 /E7

transcritos de mRNA foram encontrados em apenas 3 de 27 (11,1%) HNCS não-orofaringe, decorrente da nasofaringe, laringe, ou a cavidade oral (Tabela 2).

a análise da correlação estatística entre o estado de infecção pelo HPV e características histoclínicos revelou nenhuma relação significativa entre a presença de DNA do HPV e sexo, idade , estágio TNM, ou estágio nodal. DNA HPV era mais provável de ser encontrado em não-fumantes ou fumantes leves (isto é, Brinkman índice 400;

P

= 0,030). Além disso, foram observadas correlações significativas entre o estado de HPV e localização do tumor (

P

= 0,002) e entre o estado de HPV e diferenciação tumoral (

P Art 0,001).

infecção por EBV, genótipos, e a eliminação de 30 bp

LMP-1 | variante na HNC

Tal como indicado na Tabela 2, amplificação por PCR da

EBNA-3C

gene mostrou EBV ADN em 146 (69,9%) das amostras de HNC 209: 107 (73,3%) continham tipo a, 27 (18,5%) continham tipo B e tipo a e tipo B, foram encontrados juntos em 12 (8,2%) casos. Nós também investigou a prevalência da

LMP-1 | variante e encontrado

del-LMP-1

em 124 (84,9%) do 146

EBNA

casos -positivas. Quase todo tipo A casos EBV (98,1%; 105/107) continha

del-LMP-1 |, enquanto pouco mais da metade dos casos do tipo B (63,0%; 17/27) continha tipo selvagem

LMP-1 | (

P Art 0,001).

A prevalência de DNA do EBV por subsite foi de 95,0% (19/20), 79,7% (59/74), 64,0 % (32/50), 50,0% (14/28) e 59.5% (22/37) em tumores da nasofaringe, orofaringe, hipofaringe, laringe, cavidade oral e, respectivamente. Dos 17 espécimes NPC contendo tipo A EBV, 16 (94,1%) apresentaram

del-LMP-1

, incluindo 6 OMS digite casos I, 6 OMS casos do tipo II, e 4 casos da OMS tipo III.

Para determinar a presença de infecção por EBV em células tumorais,

EBER

foi também examinada por ISH em todas as amostras HNC (Figura 2). Em contraste com a alta prevalência de DNA EBV identificado por PCR, apenas 6,2% (13/209) de HNCS foram positivas para

EBER

. infecção pelo EBV em HNC foi localizada principalmente na nasofaringe (92,3% [12/13] de

EBER

-positivas tumores; nasofaringe vs HNC não nasofaringe,

P Art 0,001).

EBER

foi detectado em 60,0% (12/20) dos pacientes com NPC, incluindo 2 (22,2%, 2/9) com a OMS tipo I, 6 (100%, 06/06) com a OMS tipo II , e 4 (80%, 05/04) com a OMS tipo III, mas em apenas 1,4% (1/74) dos pacientes com OPC. Nenhum dos

EBER

-positivas casos derivados da hipofaringe, laringe, ou a cavidade oral

Micrografia A:. A maioria das células neoplásicas foram positivas (carcinoma nasofaríngeo, × 100, bar = 100 ^ M), tal como indicado pela seta na ampliação elevada (200 ×). Micrografia B: apesar de alguns linfócitos positivos são aparentes (seta), não há células neoplásicas foram positivas. Micrografias C e D:. Cortes corados com hematoxilina e eosina (HE)

HPV e EBV co-infecção em HNC

Ambos HPV DNA e DNA EBV foram detectados por PCR em 45 (21,5%) do total de 209 pacientes. No entanto, dos 13

Eber

HNCS -positivas, apenas 2 foram HPV-16 positivo e ambos derivados da nasofaringe. Como a infecção EBV em HNC é definido como

Eber

células tumorais -positivas por ISH, as taxas de co-infecção de HPV e EBV em HNC e NPC eram apenas 1,0% e 10,0%, respectivamente (Tabela 3). Embora a infecção por HPV foi mais comum em OPCs, nenhum dos casos OPC ADN-positivas 34 do HPV foi co-infectados com EBV, como confirmado pelo

EBER

ISH.

A análise de sobrevida

uma vez que não havia tecido insuficiente para a detecção de mRNA em um caso, foram avaliados os resultados do tratamento de pacientes 73 OPC com base no status HPV. Cinquenta e quatro pacientes com OPC primário não tratado previamente tiveram remissão completa depois de receber tratamento curativo primário, 5 apresentaram doença persistente após o tratamento curativo, 10 foram submetidos a tratamento paliativo, e 4 tiveram nenhum tratamento. Mediana de seguimento para os pacientes cujos dados foram censurados foi de 41 meses (variação de 3-86 meses). No último acompanhamento, 18 (24,7%) dos 73 pacientes OPC tinha morrido da doença e 2 morreram de doenças não relacionadas. Kaplan-Meier análise mostrou que não há diferenças significativas na sobrevida específica de doença ou sobrevida global entre os doentes OPC com HPV DNA + e pacientes OPC com HPV DNA- (

P

= 0,332 e

P

= 0,378 , respectivamente; Fig. 3). No entanto, em comparação com pacientes OPC com HPV mRNA- (isto é, ambos os pacientes OPC com HPV DNA + /mRNA- e pacientes OPC com HPV DNA- /mRNA-), pacientes OPC com HPV DNA + /mRNA + tinham melhores taxas de sobrevida global de doença específica e (

P = 0,027

e

P

= 0,017, respectivamente). A taxa de sobrevida específica da doença em 3 anos foi de 95,0% (IC 95% = 85,5% -100%) na coorte com DNA HPV + /mRNA + e 73,8% (IC 95% = 61,4% -86,1%) na coorte com HPV DNA + /mRNA- ou HPV DNA- /mRNA-.

a doença específica sobrevivência e taxas de sobrevida global foi significativamente melhor em pacientes /OPC HPV DNA positivos mRNA-positivas do que em HPV DNA positivo /mRNA-negativos e ADN de HPV-negativo /ARNm-negativa pacientes OPC. No entanto, não foram encontradas diferenças significativas na sobrevida específica de doença ou sobrevida global entre HPV DNA-DNA positivo e negativo HPV pacientes OPC.

Para avaliar o valor preditivo independente de todos esses fatores para doença- sobrevida específica em multivariada OPC, uni e análises usando Cox modelos de riscos proporcionais de foram realizadas. Na análise univariada, pacientes OPC com o estatuto de HPV DNA + /mRNA + demonstrou significativamente maior sobrevida específica de doença (

P

= 0,029; taxa de risco (HR) = 0,12; intervalo de confiança de 95% (CI) = 0,01-0,99) do que os outros pacientes OPC (Tabela 4). pacientes OPC categorizado como estádio T4, estágio nodal 2-3, e alcoólatras pesados ​​(álcool por dia 50 g) tiveram uma sobrevida específica da doença significativamente menor (T4,

P

= 0,002, HR = 0,15, 95 % CI = 0,04-0,50; estágio nodal 2-3,

P

= 0,040, HR = 3,49, 95% CI = 1,01-12,03; pesado bebedor de álcool,

P

= 0,040, HR = 3,49, 95% CI = 1,01-12,03), em comparação com os pacientes classificados como estágio T1-3, estágio nodal 0-1, e fumantes leves e não-fumantes. O modelo final da análise multivariada, utilizando um modelo de riscos proporcionais de Cox para identificação da sobrevivência específica da doença justo de OPCs demonstraram que o estádio T1-3 (

P

= 0,002; HR ajustado = 0,22; IC95% = 0.08- 0,56) e status do HPV mRNA-positivo (

P

= 0,061; HR ajustado = 0,15; IC95% = 0,02-1,10) previu melhor sobrevida específica da doença (Tabela 4)

Além disso, avaliou-se prognósticos em 54 pacientes OPC que tiveram remissão completa depois de receber tratamento curativo primário. A sobrevida livre de recorrência em 3 anos foi de 100% para pacientes OPC com HPV DNA + e 75,1% (IC 95% = 59,1% -91,2%) para os pacientes OPC com HPV DNA- (

P

= 0,002) ( Figura 4A). Assim, a sobrevivência específica da doença de 3 anos em + pacientes OPC de DNA do HPV foi significativamente melhor do que nos pacientes HPV ADN (100% vs 88,9%,

P

= 0,015) (Figura 4B). Curiosamente, os pacientes mRNA HPV + OPC também exibiu significativamente melhor sobrevida livre de recorrência do que os pacientes HPV mRNA- OPC (

P

= 0,032) (Figura 4C), e as taxas de sobrevida livre de recidiva de 3 anos foram de 100% e 80,4%, respectivamente. No entanto, os pacientes OPC com HPV mRNA + demonstrou apenas uma tendência ligeiramente mais forte para a sobrevivência específica da doença justo em comparação com pacientes OPC com HPV mRNA- (100% vs 91,2%,

P

= 0,080) (Figura 4D).

Depois de tratamento curativo, HPV pacientes OPC ADN-positivas mostraram significativamente melhor sobrevida livre de recidiva e as taxas de sobrevivência para certas doenças em comparação com pacientes OPC HPV DNA-negativos. Resultados semelhantes foram encontrados em HPV pacientes OPC mRNA-positivos.

Para avaliar a influência do EBV na sobrevida para os pacientes com NPC, os pacientes foram estratificados de acordo com a detecção de

EBER

. Entre 20 pacientes com NPC, 18 foram tratados no local e detalhes do tratamento e os resultados estavam disponíveis a partir do momento do diagnóstico para estes pacientes. O tempo médio de acompanhamento foi de 21 meses (variação de 3-63 meses). Embora os pacientes com

EBER

-positivo NPC mostrou tendência a uma sobrevida específica da doença melhorou em comparação com pacientes com

EBER

-negative NPC, não houve diferença significativa entre essas duas coortes (

P

= 0,155) (Figura 5A). Da mesma forma, 16 casos receberam quimioradioterapia concomitante por carcinoma primário, e não foi encontrada diferença significativa na sobrevida específica da doença entre o

EBER

-positivo NPC e

EBER

-negative coortes NPC (

P

= 0,381) (Figura 5B).

Não foram encontradas diferenças significativas nas taxas de sobrevida específica de doença entre

EBER

-positivo (infecção EBV tumor) e

Eber

pacientes NPC -negative.

Discussão

a prevalência de HPV em HNC foi ligeiramente maior no presente estudo (30,1%) do que em estudos internacionais, que relataram 25,9% de casos-HPV-DNA positivo para estas entidades tumorais [39]. Além disso, nossos resultados do estudo foram consistentes com relatos anteriores que mostram que a orofaringe era o subsite da maior prevalência de HPV em HNC, eo genótipo viral mais comum em HNC associada ao HPV foi de HPV-16 [39], [40]. Ao contrário do câncer do colo do útero, onde HPV

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transcrições são identificados na maioria das amostras de DNA-HPV positivo [41], apenas 38,4% dos casos de HPV HNC DNA-HPV positivos mostraram

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positividade mRNA no presente estudo.

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ARNm é considerado como um marcador de transformação maligna de HPV, e demonstrando oncogénica

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transcrição pode sugerir que carcinogensis-driven HPV é mecanisticamente possível, enquanto que ADN de HPV-positivo /resultados de RNA-negativo pode simplesmente refletir tanto a transcrição de baixo nível ou não-transcricional ativo, e possivelmente uma infecção “passageiro”. O fato de que aproximadamente 90% dos casos com HPV transcricionalmente ativa originado na orofaringe apoiado o conceito de uma estreita relação entre HPV e OPC. Estudos anteriores têm demonstrado que a carga viral de ADN de HPV apresenta grande variação entre as regiões da cabeça e do pescoço, e os números de cópias de ADN em OPCs foram muito superiores em HNCS não orofaringe. A baixa multiplicidade relativa de infecção por HPV em locais da cabeça e pescoço não orofaringe, hipofaringe, incluindo, laringe, cavidade oral, e podem ser correlacionados para baixo

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expressão de mRNA em tumores nesses locais [42], [43]. Além disso, Wiest relataram que a maioria dos tumores que não expressam

E6 /E7

conter uma

gene p53 mutado

, em que o gene E6 é frequentemente perturbada. A falta de

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expressão pode ser devido à ruptura do gene E6 ou alterações no controle da transcrição [38].

Em estudos anteriores, os pacientes com NPC em Taiwan comumente mostrou uma prevalência mais elevada de HPV (35-51%) [44], [45], [46] do que na Europa e nos Estados Unidos (9-27%) [47], [48], [49]. Além disso, aproximadamente 22% dos casos de SCC cavidade oral em Taiwan porto de alto risco de HPV de ADN [50], [51]. Interessantemente, no presente estudo, uma incidência relativamente elevada de HPV foi também encontrada em alguns HNCS não orofaringe, tais como NPC (30,0%) e SCC cavidade oral (29,7%). A maioria dos nossos pacientes foram recrutados a partir de Okinawa, uma ilha do sul do Japão muito perto de Taiwan, o que pode sugerir geograficamente e racialmente características HPV distintas e que o HPV oncogênico pode estar associado a um subconjunto de carcinomas que envolvem a nasofaringe e cavidade oral. Dadas as baixas taxas de detecção de

transcritos E6 /E7

mRNA, no entanto, o papel do HPV nestas HNCS não orofaringe precisa de mais esclarecimentos.

Este estudo utilizando PCR em amostras fresco congelado de NPCs mostraram que o tipo EBV a é predominante e

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é comum na população japonesa, os resultados que estão de acordo com dados obtidos a partir do mesmo tipo de amostras recolhidas no sudeste da Ásia e África do Norte [19], [20], [52], [53]. O oposto foi observado em amostras de pacientes europeus associadas a EBV NPC e doadores saudáveis, onde selvagens

LMP-1 | isolados são mais proeminentes do que

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variantes [54 ]. A deleção de 30 pb

LMP-1 | variantes exibem actividade de transformação e induzir alterações tumorigénicas, e a proteína de supressão tem uma meia-vida mais longa e uma maior capacidade de activar o NF-kB e JNK /AP1 em células epiteliais, assim contribuindo para um maligno mais NPC fenótipo [18], [55]. As características de distribuição de variantes EBV pode sugerir maior potencial tumorigénico do

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em regiões endêmicas do sudeste da Ásia e Norte da África, em comparação com o tipo selvagem EBV. No entanto, conflitantes achados de não haver diferenças significativas na frequência de

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em amostras garganta de lavagem entre as regiões endêmicas e não-endêmicas na China [56] destacam a necessidade de futuras pesquisas para esclarecer se

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é de fato um polimorfismo correlacionado-fenótipo NPC e não um polimorfismo geographical- ou relacionados com a etnia.

Apesar de pouco mais de metade dos casos com EBV tipo B contido do tipo selvagem

LMP-1 |, a maioria dos casos com tipo A EBV continha

del-LMP-1 |. Nossos resultados estão em concordância com um estudo anterior da Coreia [19], em que a maioria (87%) do tipo A EBV exibiu o

del-LMP-1 | variante eo EBV tipo B exibiu wild- digite

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com mais frequência. Curiosamente, do tipo selvagem

del-LMP-1 | não só foi encontrada em 64,3% do tipo B EBV, mas foi predominante (64,1%) em tipo A EBV em células mononucleares do sangue periférico de portadores saudáveis ​​[57]. Além disso, Correa et al investigaram 7 pacientes com AIDS com linfoma no sistema nervoso central primário e descobriu que

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sempre foi detectado com o tipo B EBV [58], que era diferente dos achados em NPC. Tomados em conjunto, a forte associação do tipo EBV e

LMP-1 | variantes pode ser devido a características intrínsecas da EBV.