Abstract

Paclitaxel desempenha um papel importante no tratamento de câncer de ovário; Contudo, a resistência ao paclitaxel é frequentemente observada. Assim, a nova terapia que pode superar a resistência paclitaxel será de importância clínica significativa. Foram avaliados os efeitos antiproliferativos de um agente anti-mitótico e antivascular BPR0L075 em células de cancro do ovário de paclitaxel-resistente. BPR0L075 exibe potente e de largo espectro de citotoxicidade a concentrações nanomolares baixas (IC

50 = 7/2 nM) contra ambas as células de cancro do ovário parentais sublinhas (OVCAR-3, SKOV-3, e A2780-1A9) e paclitaxel-resistente ( OVCAR-3-TR, SKOV-3-TR, 1A9-PTX10), independentemente dos níveis de resistência a múltiplas drogas transportador de P-gp e classe III β-tubulina ou mutação de β-tubulina de expressão. BPR0L075 ciclo de blocos de células na /fase G2 M em células de paclitaxel-resistentes, enquanto igual concentração de tratamento paclitaxel foi ineficaz. BPR0L075 induz a morte celular por um mecanismo de dupla em células de cancro do ovário parentais e paclitaxel-resistente. Nas células parentais (OVCAR-3 e SKOV-3), BPR0L075 apoptose induzida, evidenciado pela poli (ADP-ribose) polimerase (PARP) clivagem e formação de segmento característico de ADN. BPR0L075 morte celular induzida em células de cancro do ovário resistentes paclitaxel (OVCAR-3-TR e SKOV-3-TR) é principalmente devido a uma catástrofe mitótica, evidenciado pela formação de gigante, células multinucleadas e ausência de clivagem de PARP. A análise de imunotransferência mostra que o tratamento BPR0L075 induzida sobre-regulação da ciclina B1, BubR1, MPM-2, e os níveis de proteína de survivina e Bcl-XL fosforilação em células parentais; No entanto, em células resistentes, as expressões endógenos de BubR1 survivina e foram esgotados, tratamento BPR0L075 não conseguiu induzir MPM-2 de expressão e fosforilação de Bcl-XL. BPR0L075 morte celular induzida tanto em células de cancro do ovário parentais e paclitaxel-resistente prosseguir através da caspase-3 mecanismos independentes. Em conclusão, BPR0L075 exibe efeitos citotóxicos potentes em células de cancro do ovário com potencial para superar a resistência paclitaxel, ignorando transportadores de efluxo e induzindo catástrofe mitótico. BPR0L075 representa um romance terapêutica microtúbulos para superar a resistência a múltiplas drogas e desencadear a morte celular alternativa pela catástrofe mitótico em células de cancro do ovário que são resistentes à apoptose

Citation:. Wang X, Wu E, Wu J, Wang TL, Hsieh HP , Liu X (2013) An antimitóticos e antivascular agente BPR0L075 vence a resistência a múltiplas drogas e induz Catastrophe mitótico em células de cancro do ovário de paclitaxel-resistente. PLoS ONE 8 (6): e65686. doi: 10.1371 /journal.pone.0065686

editor: Qiang Wang, Cedars-Sinai Medical Center, Estados Unidos da América

Recebido: 21 de novembro de 2012; Aceito: 24 de abril de 2013; Publicação: 06 de junho de 2013

Direitos de autor: © 2013 Wang et al. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Licença Creative Commons Attribution, que permite uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o autor original ea fonte sejam creditados

Financiamento:. Este trabalho foi financiado pela Texas tech University Health Sciences Center (TTUHSC) Escola de Farmácia (X. Liu). O financiador não teve nenhum papel no desenho do estudo, recolha e análise de dados, decisão de publicar ou preparação do manuscrito

CONFLITO DE INTERESSES:.. Os autores declararam que não existem interesses conflitantes

Introdução

o câncer de ovário, o tumor maligno mais letal do câncer ginecológico, resulta anualmente em mais de 14.000 EUA e 114.000 mortes em todo o mundo. Apesar dos avanços no diagnóstico e tratamento, a taxa de sobrevivência de cinco anos para pacientes estágio IV é de cerca de 18% [1], [2]. A incapacidade para superar a resistência à droga e inibir a metástase representa a principal causa de fracasso do tratamento [3]. Inovadoras e eficazes novas terapias que superar a resistência aos medicamentos são extremamente necessárias para melhorar a sobrevivência ea qualidade de vida dos pacientes com esta doença.

-microtúbulos agentes estabilizadores, tais como taxanos, epotilonas, e agentes de desestabilização de microtúbulos tais como

vinca alcalóides

estão entre os mais eficazes agentes quimioterapêuticos utilizados na clínica [4]. No entanto, um dos maiores obstáculos evoluíram na clínica é multirresistência (MDR). Especialmente para o paclitaxel, apesar resposta inicial significativa para o cancro do ovário avançado utilizando paclitaxel e terapia de combinação de cisplatina com base, a grande maioria dos doentes com recaída e desenvolver resistência aos medicamentos [5], [6]. resistência paclitaxel é multifactorial, incluindo a regulação positiva de membrana droga transportador de efluxo de P-glicoproteína (P-gp) [7], [8], mutações no gene β-tubulina [9], [10], [11], [12 ], as alterações na expressão de isotipos beta-tubulina [13], [14], aberrantes vias de transdução de sinal [15], [16], e alterações nas proteínas reguladoras apoptóticos tais como Bcl-2 [17], [18] e inibidor de proteína survivina apoptose [19]. A identificação do novo agente anti-mitótico que podem superar a resistência taxano, exibir actividade suportável em tumores do taxano refratário poderia trazer benefícios clínicos para pacientes com câncer de ovário avançado.

BPR0L075 [6-metoxi-3- (3 ‘, 4 ‘, 5’-1H-indole-trimetoxi-benzoil)] é um novo composto de indole sintética que inibe a polimerização da tubulina através de ligação ao local de ligação da colchicina-tubulina [20]. BPR0L075 está estruturalmente relacionado com o agente de combretastatina interromper a ligação-tubulina e vascular clássica. BPR0L075 demonstrou actividade anti-mitótico e antiangiogênico

in vitro

e

in vivo

[20], [21]. Nós relatamos que BPR0L075 apresentaram atividade de desregulação vascular induzindo rápida, ainda, o desligamento vascular tumoral temporária e levando a redução da perfusão do tumor em xenoenxertos de cancro da mama humano ortotópicos [22]. BPR0L075 prende células de carcinoma cervical humano KB no checkpoint mitótico G2 /M, e induz a apoptose celular (IC

50 = 3,6 nM) através da perturbação potencial de membrana mitocondrial e activação da cascata de caspase-3 [20]. BPR0L075 possui boa seletividade entre células normais e cancerosas, com IC

50 valor em células normais de fibroblasto Detroit 551 superiores a 1? M [20]. BPR0L075 exibe actividade antitumoral único agente contra o crescimento de xenoenxertos de carcinoma gástrico e cervical humano [20]. Ele também aumenta sinergicamente a actividade antitumoral contra o pulmão humano, colorectal, e xenoenxertos de tumores cervicais, quando combinado com cisplatina [21].

No presente estudo, observou-se que BPR0L075 era altamente ativo em células de cancro do ovário de paclitaxel-resistente e suas células parentais com IC

50 valores em baixas concentrações nanomolares único dígito. BPR0L075 apoptose induzida em células de cancro do ovário parentais. Em contraste, induziu uma catástrofe mitótica nas células de cancro do ovário de paclitaxel-resistentes evidenciado pela formação de células poliplóides grandes, multinucleadas. BPR0L075 representa um romance e microtúbulos promissora terapêutica para superar a resistência taxano e desencadear a morte celular alternativa pela catástrofe mitótico em células que são resistentes à apoptose.

Resultados

BPR0L075 Exibe citotoxicidade potente in Human Paclitaxel-resistant células de carcinoma do ovário

Foi testada a citotoxicidade da BPR0L075 em linhas celulares de cancro do ovário humano SKOV-3, OVCAR-3, e A2780-1A9, bem como as sub-linhas resistentes à paclitaxel SKOV-3-TR, OVCAR-3 -TR, e 1A9-PTX10, que foram seleccionados sob uma exposição contínua de 0,25 uM paclitaxel (SKOV-3-TR), 0,5 ^ M de paclitaxel (OVCAR-3-TR), e 15 ng /ml de paclitaxel e de 5 mg /mL de verapamil ( 1A9-PTX10), respectivamente. A Figura 1A mostra que, como o paclitaxel, BPR0L075 exibiram actividade antineoplásica comparável em matar células de cancro do ovário parentais em baixas concentrações nanomolares. No entanto, BPR0L075 foi mais eficaz do que o paclitaxel contra as células de cancro do ovário de paclitaxel-resistente, mantendo quase completamente a sua potência citotóxica contra estes sublinhas resistentes, onde o paclitaxel era praticamente ineficaz. A Figura 1B resume o IC

50 valores de BPR0L075, paclitaxel, doxorrubicina e contra o crescimento destas células cancerosas do ovário humano e suas sublinhas resistentes após 4 dias de exposição contínua. células TR-OVCAR-3 A SKOV-3-TR e mostrou razões de alta resistência ( 400 vezes) de paclitaxel em comparação com as células parentais correspondentes. células 1A9-PTX10 exibida razão de resistência moderada (98 vezes) para o paclitaxel. Estas células de paclitaxel-resistente também mostrou resistência cruzada a doxorubicina (1,8-12-vezes). BPR0L075 apresentaram sensibilidade semelhante em todas as linhas de células de ovário parentais e paclitaxel-resistente emparelhados com IC

50 valores que variam 2-7 nM (Figura 1B).

(A), proliferação de células de cancro humano do ovário (SKOV- 3, OVCAR-3, e A2780-1A9) e paclitaxel sublinhas resistentes (SKOV-3-TR, OVCAR-3-TR, e 1A9-PTX10) foram tratados com BPR0L075 (círculo vermelho) ou paclitaxel (quadrado azul) em três -15 concentrações nM durante 4 dias e a citotoxicidade foi avaliada pelo ensaio de SRB. Fração de sobrevivência celular em relação aos controles representa a média ± SD de 12 determinações. (B) Síntese da expressão da P-gp, expressão βIII-tubulina, e a sensibilidade de linhas de células do cancro do ovário emparelhado com o paclitaxel, doxorrubicina, e tratamento BPR0L075. Os números entre parênteses representa o grau de resistência (x-vezes), expressa como a razão do IC

50 valores, em comparação com as linhas parentais correspondentes. Todos os experimentos foram repetidos três vezes.

BPR0L075 não é um substrato para efluxo Transportadores e activa nas células do cancro do ovário com expressões Altered βIII-tubulina e β-tubulina mutação

análise Immunoblotting mostrou que as células resistentes OVCAR-3-TR e SKOV-3-TR têm alta expressão de proteína P-gp, enquanto as células parentais OVCAR-3 e SKOV-3 não apresentam qualquer expressão (Figura 2A) P-gp. Para confirmar que BPR0L075 não é um substrato para bombas de efluxo, foram medidos os níveis BPR0L075 intracelulares nos dois pares de linhas de células OVCAR-3 /OVCAR-3-TR e SKOV-3 /SKOV-3-TR utilizando um LC sensível /MS /MS método (Figura 2B). Ambos os pares de células obtidas concentrações intracelulares BPR0L075 semelhantes após o tratamento BPR0L075 (20 nM durante 6 horas, figura 2C) sem diferença estatística (

P Art 0,05). BPR0L075 não é um substrato para outro ATP de ligação a proteína de resistência do cancro da mama transportador de cassete de efluxo (BCRP), evidenciado pela citotoxicidade comparável em células MCF-7 do cancro da mama humanas (

50 = 3,5 nM IC) e células MX mitoxantrona resistente MCF7 /(IC

50 = 4,0 nM), as células MCF7 /MX são conhecidas por sobre-expressar BCRP [23], [24], [25]. Em conjunto, os resultados mostram que o transportador de efluxo de P-gp contribuiu para a resistência paclitaxel seleccionado em células-TR OVCAR-3 SKOV-3-TR e, mas BPR0L075 não é um substrato para bombas de efluxo, o que contribui para a sua capacidade para ultrapassar a resistência de paclitaxel .

(a) análise Western blot da P-gp e expressões βIII-tubulina nas linhas celulares de cancro do ovário emparelhados. Pan β-tubulina e β-actina foram carregar os controles. (B) A análise LC /MS /MS dos níveis intracelulares BPR0L075, com cromatograma LC mostrando o tempo de retenção do padrão interno [1- (1H-indol-3-ilcarbonil) -1H-imidazol] e BPR0L075 como 2,2 e 2,8 min, respectivamente . As transições de massa m /z 212 → 144 para o padrão interno e m /z 342 → 195 para BPR0L075 foram monitorizados para efeitos de quantificação. (C) Os níveis intracelulares BPR0L075 nas linhas celulares do cancro do ovário emparelhados. As células foram incubadas com 20 nM BPR0L075 durante 6 horas, em seguida, as células foram lavadas, colhidas, lisadas e para medição LC /MS /MS. As barras representam SD ± média de três testes independentes. Não foi observada diferença estatisticamente significativa (

P Art 0,05, estudante

t

-teste)

fenótipo de resistência Paclitaxel é frequentemente associada com alteração da classe. III expressão isotipo β-tubulina [26]. Observamos expressões diferenciais de tubulina-isótipo βIII-tubulina em células de cancro do ovário parentais e paclitaxel-resistente. Ambas as células OVCAR-3 e SKOV-3 têm altas expressões de βIII-tubulina, mas após a selecção com o paclitaxel, a expressão de βIII-tubulina marcadamente diminuída (Figura 2A), a alteração das expressões βIII-tubulina em células resistentes não fez afectam a sensibilidade à BPR0L075. As células 1A9-PTX10 são conhecidos por apresentar um fenótipo de resistência não-MDR1, eles abrigam mutação β-tubulina com paclitaxel auditivos interacção com a tubulina [27], [28], [29], [30] (Figura 1B). A mutação de β-tubulina não afectam negativamente a citotoxicidade induzida BPR0L075 em células 1A9-PTX10 (Figura 1). Juntos, BPR0L075 é citotóxico para células com alta P-gp e expressões BCRP; a citotoxicidade é independente da βIII-tubulina níveis de expressão ou estado de mutação β-tubulina.

BPR0L075 Induz G2 /M detenção em ambas as células do cancro do ovário dos Pais e paclitaxel-resistentes

seguido do ciclo celular progressão em ambas as células parentais e paclitaxel-resistentes após tratamento BPR0L075. Como mostrado na Figura 3, o tratamento BPR0L075 (10-100 nM, os níveis da droga pode ser conseguida em xenoenxertos de rato [22]) durante 24 horas resultou em perdas de população de células a partir de fases G0-G1, com a acumulação concomitante de células em G2 /fase M em ambas as células OVCAR-3 e OVCAR-3-TR. Em comparação com o robusto paragem do ciclo celular por BPR0L075, células de paclitaxel-resistente exibindo uma resposta mitótico defeituoso para o paclitaxel, que falhou para prender na mitose, mesmo tratada com 100 nM de paclitaxel (dados não mostrados). No caso de células OVCAR-3-TR, as células poliplóides ( DNA 4N) apareceu após o tratamento BPR0L075 comparação com células OVCAR-3. Investigou-se também o tempo de curso do BPR0L075 paragem do ciclo celular induzida quando tratadas com 10 nM BPR0L075. BPR0L075 começou a bloquear as células OVCAR-3 em fase G2 /M tão cedo quanto 12 horas, e progrediu para completar detenção de 24 a 48 horas em ambas as células OVCAR-3 e OVCAR-3-TR. BPR0L075 tratada células OVCAR-3-TR deu origem a uma fracção significativa de células poliplóides (conteúdo de DNA 4N) a 24-48 horas (Figura 3, setas). Da mesma forma, o tratamento BPR0L075 também induziu fase da sua concentração e paragem do ciclo celular em G2 dependente do tempo /M em ambas as células SKOV-3 e SKOV-3-TR, com elevada fracção de células poliplóides em SKOV-3-TR (Figura S1 ). morte celular mitótica ou catástrofe mitótica é muitas vezes associada com a interrupção de crescimento na fase G2 /M do ciclo celular, seguida pela formação de células poliplóides grandes [31], [32], estas células poliplóides observada sugere que BPR0L075 induzida mitótico catástrofe em paclitaxel As células resistentes ao cancro do ovário.

OVCAR-3 e células OVCAR-3-TR foram tratados com veículo ou etanol BPR0L075 (10-100 nM) durante 24 horas ou 10 nM BPR0L075 por períodos indicados (0-48 horas ), coradas com iodeto de propidio, e analisados ​​por citometria de fluxo. Os perfis do ciclo celular estão apresentados como sobreposição tridimensional. O eixo dos X mostra a intensidade de fluorescência de iodeto de propídio, o que indica o teor de ADN celular em diferentes fases do ciclo celular. O eixo dos Y representa a contagem de células; e eixo dos z mostra a concentração ou do tempo de tratamento BPR0L075 pontos. 2N, as células residentes na fase G0-G1 do ciclo celular; 4N, as células na fase G2 ou mitose. BPR0L075 induz G2 significativa H prisão /seguido pela aparência de uma população sub-G1, em ambas as células parentais e resistentes, com células poliplóides (setas) apenas nas células resistentes. Os resultados são representativos de três experiências independentes.

BPR0L075 perturba o microtúbulos citoesqueleto e induz mitótico Catastrophe em paclitaxel-resistentes células cancerosas ovarianas

Foi examinado o efeito do BPR0L075 sobre a organização dos microtúbulos redes de células de cancro do ovário por imunofluorescência de α-tubulina (verde). Como mostrado na Figura 4, veículo etanol tratado OVCAR-3 e SKOV-3 células tinham bem organizado matrizes típicas de rede de microtúbulos radial; Em contraste, BPR0L075 (20 nM durante 18 horas) as células tratadas OVCAR-3 e SKOV-3 tinha forma arredondada, cromossomas condensados, com o rompimento das fibras de microtúbulos de células que acompanhados por deformação celular. Para as células SKOV-3-TR OVCAR-3-TR paclitaxel-resistentes e, as fibras longas de microtúbulos foram raramente observados em células tratados com veículo, com ainda menos a coloração após o tratamento de BPR0L075. BPR0L075 tratada células resistentes também apresentaram características de catástrofe mitótica, tal como definido pela formação de células gigantes multinucleadas, (Figura 4, setas).

As lamelas contendo as células SKOV-3 resistentes a paclitaxel parental e OVCAR-3 e foram expostos para meio contendo veículo de etanol ou 20 nM de BPR0L075 durante 18 horas. As células foram fixadas, lamelas foram depois coradas com anticorpo anti-tubulina α (AlexaFluor 488, verde) para microtúbulos e 4,6-diamidino-2-fenilindole (DAPI, azul) para os núcleos das células, e observado por fluorescência Olympus IX81 microscópio . As células parentais de controlo apresentaram matrizes típicas de microtúbulos radiais. tratamento BPR0L075 interrompido microtúbulos do citoesqueleto em ambas as células de cancro do ovário parentais e resistentes. setas brancas mostram as células gigantes, multinucleadas característicos da catástrofe mitótico. Barra de escala, 10 ^ m.

As células do cancro do ovário de paclitaxel-resistentes Mostrar desregulamentado mitótico Response e Exaustão de sobreviver

Foram analisados ​​os eventos moleculares chave associados BPR0L075 parada do ciclo celular induzida. Ciclina B1 é uma proteína reguladora do ciclo celular envolvidas na mitose e expresso predominantemente durante a fase G2 /M do ciclo celular. A análise Western blot mostrou que as expressões basais de ciclina B1 em paclitaxel-resistente OVCAR-3-TR e SKOV-3-TR células foram significativamente mais baixos do que aqueles em OVCAR-3 e as células SKOV-3. tratamento BPR0L075 (10-100 nM durante 24 horas) provocou um aumento dependente da concentração nos níveis de ciclina B1 em ambas as linhas celulares parentais e paclitaxel sublinhas resistentes (Figura 5A, B). tratamento BPR0L075 também induziu aumento da regulação do mitótico proteína spindle checkpoint BubR1 em OVCAR-3 dos pais e células SKOV-3. Em 3 OVCAR-TR-paclitaxel e células resistentes SKOV-3-TR, a expressão endógena de BubR1 tornou-se indetectável (Figura 5A, B). Nós também monitorizada a proteína de MPM-2, um marcador estabelecido de células mitóticas que reconhece um grupo de formas fosforiladas de proteínas que são fosforiladas apenas em mitose [33], [34]. tratamento BPR0L075 (10-100 nM durante 24 horas) provocou indução imediata da MPM-2 em células progenitoras, mas não nas sublinhas resistentes que têm defeitos de mitose (Figura 5A, B). Observou-se também a expressão endógena de survivina, um regulador de mitose e inibidor da proteína de apoptose, em OVCAR-3 e SKOV-3 células (Figura 5A, B). BPR0L075 paragem da mitose mediada está associada com a indução de survivina de uma maneira dependente da concentração, em células parentais, o que preserva uma via de sobrevivência para as células cancerosas. Em contraste, a expressão de survivina foi empobrecido nas sublinhas de OVCAR-3-TR e SKOV-3-TR, tratamento BPR0L075 não conseguiu induzir survivina sobre-regulação nas células resistentes a paclitaxel (Figura 5A, B).

tratamento BPR0L075 (10-100 nM durante 24 horas) induziu alterações na ciclina B1, BubR1, MPM-2, e expressões de survivina em OVCAR-3 /OVCAR-3-TR células (a) e SKOV-3 /SKOV-3- células TR (B). tratamento BPR0L075 (10 nM) induziu alterações no PARP, BCL-XL e Bcl-2 proteínas no tempo diferente (0-72 horas) em OVCAR-3 /OVCAR-3-TR células (C) e SKOV-3 /SKOV- células 3-TR (D). 50? G de lisado de proteína foi carregada na SDS-PAGE e as experiências foram repetidas e blots representativos são mostrados.

BPR0L075 induz a fosforilação de Bcl-XL em células parentais, mas não no ovário paclitaxel-resistentes Câncer Cells

proteínas da família Bcl-2, são reguladores-chave da apoptose, e os seus níveis de expressão têm sido sugeridos para se correlacionam com sensibilidade a paclitaxel [35], [36], [37]. As linhas de OVCAR-3 e SKOV-3 de células não expressam a proteína Bcl-2 a um nível imunodetectáveis, mas foram encontrados para expressar níveis elevados de Bcl-XL. Em contraste, para a sub-linhas OVCAR-3-TR-TR e SKOV-3, o nível de proteína Bcl-2 foi facilmente detectável que está relacionado com a diminuição da expressão de Bcl-XL (Figura 5C, D). Quando as células parentais tratados com 10 nM BPR0L075, a forma fosforilada de Bcl-XL apareceu em 12-72 horas, evidenciado pelos deslocamentos de mobilidade electroforética em imunomarcações (Figura 5C, D). No entanto, a exposição semelhante de BPR0L075 não induziu a Bcl-2 ou Bcl-XL fosforilação em OVCAR-3-TR e sublinhas-TR SKOV-3. BPR0L075 tratamento reduziu os níveis de Bcl-XL em células SKOV-TR-3 OVCAR-3-TR, sem afectar os níveis de Bcl-2 (Figura 5C, D).

BPR0L075 morte celular induzida é independente de caspase-3 em tanto as células do cancro do ovário parentais e paclitaxel-resistente

BPR0L075 tratamento induziu a clivagem proteolítica da poli (ADP-ribose) polimerase (PARP) a partir de um PM de 116 kDa a um polipéptido MW de 85 kDa no fragmento de OVCAR-3 e SKOV-3 em células de um tempo- (Figura 5C, D) e concentração-(Figura 6A, B) forma dependente. No entanto, a clivagem de PARP não foi observado nas células OVCAR-3-TR e SKOV-3-tr (Figura 5C, D, 6A, B), apesar do facto de o tratamento BPR0L075 matou tanto células parentais e resistentes com semelhante IC

50 valores (Figura 1). Observou-se também que o tratamento induziu a formação BPR0L075 escada do ADN, uma característica da apoptose celular, nas células SKOV-3 e OVCAR-3, mas não no SKOV-3-TR e OVCAR-3-TR sublinhas (Figura 6C). Utilizando a análise de Western Blot, não se observou a activação de caspase-3 (perda de procaspase 3 ou a aparência da caspase-3 clivada) em ambas as células parentais e resistentes após o tratamento BPR0L075 utilizando tanto anticorpos específicos reconhecidos pro-caspase-3 ou caspase-3 ( A Figura 6A, B). Para confirmar ainda uma via de morte celular independente de caspase-3, pré-tratadas as células com um inibidor da caspase-3 específico e irreversível (20 uM de Z-DEVD-FMK) ou inibidor de controlo negativo (20 uM de Z-FA-FMK) 24 horas antes a adição de BPR0L075. foi observada nenhuma diferença estatisticamente significativa da citotoxicidade para cada par de linhas celulares (Figura 6D,

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t

-teste); inibidor da caspase-3 não preveniu a morte celular em ambas as células progenitoras e resistentes. catástrofe mitótica é conhecido por resultar em morte celular por caspase-2 e dependente da caspase-3 e mecanismos independentes [38]. Nós verificamos a activação de caspase-2, após tratamento com BPR0L075, caspase-2, a clivagem não foi detectada em ambas as células parentais e resistentes (Figura 6A, B). Em conjunto, os dados indicam que a caspase-2 e caspase-3 morte celular independente foi envolvido em ambas as células de cancro do ovário parentais e paclitaxel-resistente; a via de morte celular predominante foi através da apoptose em células parentais, e catástrofe mitótica em células de cancro do ovário resistentes.

análise por Western blot da PARP, caspase-2, caspase-3 e depois BPR0L075 (10-100 nM) tratamento durante 24 horas nas células OVCAR-3 /OVCAR-3-Tr (a) e as células SKOV-3 /SKOV-3-Tr (B). β-actina estava carregando controle. ensaios (C) escada de DNA em células tratadas com 10 nM BPR0L075 durante 72 horas. O ADN genómico foi submetido a electroforese em gel de agarose a 1%. O gel foi corado com brometo de etidio e as bandas de ADN foram visualizadas sob um transiluminador ultravioleta. (D) Efeito do inibidor de caspase-3 em citotoxicidade induzida BPR0L075. As células foram pré-tratadas com o inibidor de caspase-3 (20 uM de Z-DEVD-FMK) ou inibidor de controlo negativo (20 uM de Z-FA-FMK) durante 24 horas antes da incubação com 10 nM BPR0L075 durante mais 72 horas. Após a conclusão da incubação, a viabilidade celular foi determinada pelo ensaio de SRB. Não foi observada diferença estatisticamente significativa da citotoxicidade para cada par de linhas de células (

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-teste). Os dados representam a média ± DP.

Discussão

O paclitaxel é um dos agentes quimioterapêuticos mais bem sucedidas e usado para o tratamento de uma larga variedade de malignidades humanas, incluindo tumores sólidos e doenças malignas hematológicas [4], [39]. O paclitaxel é conhecido por se ligar ao p-tubulina e promove a sua montagem em microtúbulos [40], o que conduz a paragem do ciclo celular na fase G2 /M, activa do fuso mitótico “ponto de verificação”, e, eventualmente, leva a morte celular por apoptose [4]. O paclitaxel é um agente de primeira linha para a quimioterapia do cancro do ovário, juntamente com os agentes de platina. No entanto, o tratamento do cancro avançado do ovário com paclitaxel é dificultado pelo desenvolvimento de resistência ao fármaco. Identificação de novos agentes que superar a resistência paclitaxel é urgentemente necessário. BPR0L075 é um agente desestabilizadores do microtúbulo 3-aroylindole heterocíclico, que interfere com a dinâmica dos microtúbulos de células de tumor, conduz a paragem do ciclo celular de cancro e morte celular por apoptose caspase-3 mediada [20] e os efeitos anti-angiogénicos [21]. Além disso, BPR0L075 perturba a vasculatura do tumor e desliga perfusão sanguínea tumor

in vivo

[22]. No presente estudo, foi testada a eficácia e mecanismo de BPR0L075 no tratamento de células de cancro do ovário de paclitaxel-resistente.

Nossos resultados mostram que linhas celulares de cancro do ovário que resistente ao de estabilização dos microtúbulos agente de paclitaxel podem permanecer sensíveis a microtúbulos agente -destabilizing BPR0L075. BPR0L075 exibido potente citotoxicidade em ambas as células de cancro do ovário parentais e suas sublinhas resistentes a paclitaxel com IC

50 valores de cerca de 5 nM, enquanto igual concentração de tratamento de paclitaxel foi ineficaz nas células de cancro do ovário altamente resistentes (Figura 1). Estas células de cancro do ovário resistentes paclitaxel também mostrou resistência cruzada a outros agentes quimioterapêuticos, tais como doxorrubicina (Figura 1B). Esta observação é consistente com o relatório anterior que BPR0L075 é eficaz contra células de carcinoma KB multirresistentes cervicais humanos que são resistentes à vincristina, paclitaxel, e colchicina [20]. Os nossos resultados indicam que BPR0L075 é um agente útil no controlo de potencial células de cancro do ovário resistentes a múltiplas drogas.

Os nossos dados mostram que supera BPR0L075 dois principais mecanismos de resistência ao paclitaxel, ou seja, resistência MDR1 atribuível a sobre-expressão de P-glicoproteína e alteração da expressão do isotipo da classe III β-tubulina. O paclitaxel-resistente OVCAR-3-TR e SKOV-3-TR sublinhas mostraram a sobre-expressão de P-gp (Figura 2A), uma bomba de efluxo capaz de impedir a retenção de taxanos e outros fármacos catiónicos [41]. BPR0L075 não é um substrato para as bombas P-gp e de efluxo BCRP, evidenciado pelos BPR0L075 níveis intracelulares semelhantes obtidos nas sublinhas parentais e resistentes (Figura 2C) e IC comparável

50 valores nas células MCF7 e MCF7 /MX. Ambas as células OVCAR-3 e SKOV-3 tem elevada expressão de classe III β-tubulina, enquanto que o OVCAR-TR e SKOV-3-TR mostrou expressão acentuadamente diminuída de classe III β-tubulina (Figura 2A), o que sugere que a alteração de classe III expressão β-tubulina afeta a sensibilidade ao paclitaxel, mas não BPR0L075. BPR0L075 é também altamente eficaz para matar células 1A9-PTX10 com mutação do gene β-tubulina [27], [28] (Figura 1). Os nossos resultados apoiam os relatórios anteriores de que as mutações em β-tubulina e alterações na expressão de classe III isotipos p-tubulina induzir resistência a agentes de estabilização de microtúbulos e hipersensibilidade a agentes de desestabilização dos microtúbulos através de uma alteração na montagem de microtúbulos e dinâmica em células cancerosas [42]. Juntos, nossos resultados sugerem que o paclitaxel e ligam BPR0L075 em diferentes locais de tubulina; ter mecanismo de resistência que não se sobrepõe, portanto, potencialmente permitir a utilização de BPR0L075 para aqueles pacientes de cancro do ovário recidiva após quimioterapia baseada em paclitaxel.

BPR0L075 induzida paragem do ciclo celular na fase G2 /M no ovário parentais e paclitaxel-resistentes células de cancro quando o tratamento com paclitaxel era praticamente ineficaz (Figura 3, Figura S1). A citometria de fluxo de dados que mostram BPR0L075 não causa paragem da mitose completa em células de paclitaxel-resistentes, indicando que as células resistentes podem ser submetidos ainda a síntese de DNA, apesar de a divisão celular falha. BPR0L075 tratada células resistentes deu origem a uma fracção significativa de células poliplóides (Figura 3, Figura S1), sugerindo que a morte celular induzida BPR0L075 em células de paclitaxel-resistente prosseguir através catástrofe mitótica. catástrofe mitótica é uma outra forma de via de morte celular que é causada por mitose anormal e /ou danos irreparáveis ​​cromossómico [32], [43], [44], [45]. catástrofe mitótica ocorre durante ou logo após um mitose desregulada ou não e pode ser acompanhada por alterações morfológicas, tais como micronucleação (o aparecimento de cromossomas ou material cromossómico fora do núcleos filha dois) e multinucleação (o aparecimento de dois ou mais núcleos semelhante ou heterogéneo em tamanho, resultando numa separação deficiente durante citocinese) [43], [44], [45]. A formação de células gigantes multinucleadas é um fenótipo de catástrofe mitótica em células induzidas por radiação [46] ionizante, [47] ou fármacos anti-cancerígenos que influenciam a estabilidade de microtúbulos [43], [48], [49], [50]. imunofluorescência mostra a aparência do gigante, células multinucleadas (Figura 4) a seguir ao tratamento BPR0L075 das células resistentes, o que sugere que a segregação cromossoma não ocorrer, pelo menos em certa medida em células de paclitaxel-resistentes, mas falhou citocinese.

O nosso estudo mostra que vias de resposta mitóticas são altamente desregulado nas células cancerosas OVCAR-3-TR e SKOV-3-TR, evidenciado por sub-regulação da ciclina B1, depleção de mitótico proteína fuso checkpoint BubR1, e a incapacidade para activar epitopo mitótico MPM-2 em células resistentes quando comparados com as células parentais (Figura 5A, B). As observações são consistentes com relatórios de que a diminuição da expressão de ciclina B1 e BubR1 está associado com o ponto de verificação enfraquecida fuso e resistência paclitaxel em células de carcinoma do ovário [51]; depleção de BubR1 com siRNA resultou na perda da função do ponto de verificação montagem do fuso e resistência ao paclitaxel [52].

depleção de Survivina em células de cancro do ovário resistentes paclitaxel poderiam desempenhar um papel na catástrofe mitótica induzida BPR0L075. Survivina é uma proteína bifuncional que actua como um supressor da apoptose e um regulador mitótico [53], [54], [55]. Survivina inibe a apoptose interagindo com proteínas caspase e Smac /DIABLO, suprimir a activação de caspases a jusante, o que preserva uma via de sobrevivência [56]. Survivina também modula diversos eventos mitóticos, incluindo fuso e interfase organização de microtúbulos, o fuso montar ponto de verificação e a citocinese [44]. Observou-se a perda de expressão basal de survivina em células de paclitaxel-resistentes quando comparados com as células parentais (Figura 5A, B), sugerindo que o enfraquecimento do checkpoint do fuso nas células resistentes. O paclitaxel é conhecida por ser ineficaz no tratamento de células cancerosas empobrecido de survivina [57], [58].