Abstract

A quimioterapia é comumente usado em tratamentos de câncer, no entanto, apenas 25% dos cancros são sensíveis e uma proporção significativa desenvolve resistência. O supressor de tumor p53 é crucial para o desenvolvimento e terapia do câncer, mas tem sido menos passíveis de aplicações terapêuticas, devido à complexidade da sua acção, refletida em 66.000 artigos descrevendo a sua função. Aqui nós fornecemos uma abordagem sistemática para integrar esta informação através da construção de um modelo lógico de grande escala da interactome p53 usando extensa base de dados e integração literatura. O modelo contém 206 nós que representam genes ou proteínas, entrada danos no DNA, apoptose e saídas senescência celular, ligados por 738 interações lógicas. Previsões de

in silico

knock-outs e constante análise de modelo de estado foram validados utilizando pesquisas bibliográficas e experimentos baseados

in vitro

. Identificamos uma regulação positiva de Chk1, ATM e ATR vias em p53 células negativas e 61 outras previsões obtidas por testes knockout imitando mutações. A comparação das simulações do modelo com os dados de microarray demonstraram uma taxa significativa de previsões de sucesso variando entre 52% e 71%, dependendo do tipo de cancro. factores de crescimento e receptores de FGF2, IGF1R, PDGFRB e TGFA foram identificados como factores que contribuem para o controlo selectivo de U2OS do osteossarcoma e crescimento de células de cancro do cólon HCT116. Em resumo, nós fornecemos a prova do princípio que este modelo versátil e preditiva tem grande potencial para uso no tratamento do câncer através da identificação de vias em pacientes individuais que contribuem para o crescimento do tumor, definindo uma população sub de respondedores “altas” e identificação de mudanças nas vias levando a resistência à quimioterapia

Citation:. Tian K, Rajendran R, Doddananjaiah M, Krstic-Demonacos M, Schwartz JM (2013) Dynamics de DNA danos Pathways induzido a Câncer. PLoS ONE 8 (9): e72303. doi: 10.1371 /journal.pone.0072303

editor: Peter CSERMELY, Universidade Semmelweis, Hungria

Recebido: 20 de maio de 2013; Aceito: 09 de julho de 2013; Publicação: 04 de setembro de 2013

Direitos de autor: © 2013 Tian et al. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Licença Creative Commons Attribution, que permite uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o autor original ea fonte sejam creditados

Financiamento:. Os autores graças a Universidade de Manchester propriedade intelectual para financiamento. Os financiadores não tiveram nenhum papel no desenho do estudo, coleta de dados e análise, decisão de publicar ou preparação do manuscrito

CONFLITO DE INTERESSES:.. Os autores declararam que não existem interesses conflitantes

Introdução

a proteína p53 tem sido uma das proteínas mais estudada desde a sua descoberta em 1979. Ela desempenha um papel central na regulação da sobrevivência das células e o desenvolvimento do cancro; mutações de p53 são encontrados em mais de 50% dos tumores humanos e as alterações ou a falta da função de p53 tem sido associada com a maioria dos tipos de células cancerosas. A proteína p53 actua como um factor de transcrição que regula a expressão de um grande número de genes a jusante por mecanismos complexos [1]. Tem efeitos anti-proliferativos, tais como a paragem do ciclo celular, a apoptose, senescência celular e em resposta a vários sinais de stress. Além disso, a p53 é um nó crítica do circuito celular envolvidos na resposta fisiológica para factores de crescimento ou estímulo anormal oncogénicos. Pós-translacional modificações, as interacções proteína-proteína e a estabilização de proteínas são considerados cruciais níveis de controlo da actividade de p53.

No entanto, apesar do seu papel essencial de p53 tem sido menos propícios a aplicações terapêuticas de outros genes ou proteínas alvo que são utilizados com êxito em tratamentos contra o cancro [2]. A compreensão dos mecanismos da via p53 tem tanto interesse académico e comercial para a concepção de novas terapias contra o câncer e a seleção dos candidatos mais seguras drogas câncer [3]. Uma das principais razões por que tem sido tão difícil de explorar o nosso conhecimento de p53 para aplicações terapêuticas é de fato a complexidade da sua acção. Existem mais de 66.000 documentos sobre p53 na literatura científica, e mesmo assim ainda estamos longe de compreender os detalhes de sua função. Essa observação exige uma abordagem mais sistemática para integrar esta vasta quantidade de informação em representações consistentes que irá permitir uma melhor compreensão dos mecanismos dos sistemas à escala regulação da função p53.

Rede e Sistemas de abordagens de biologia está oferecendo novas ferramentas promissoras para estudar os mecanismos complexos envolvidos no desenvolvimento de doenças [4].

In silico

modelos podem integrar grandes conjuntos de interações moleculares em representações consistentes e passíveis de testes sistemáticos e simulações preditivas. Todos os modelos de várias escalas e complexidade computacional estão sendo desenvolvidos, de representações de rede qualitativas para quantitativas modelos cinéticos e estocásticos [5] – [7]. No caso de p53, a enorme quantidade e complexidade das interacções moleculares envolvidos faz um modelo de cinética de grande escala para fora do alcance. No entanto, uma grande quantidade de conhecimento biológico está disponível em p53 que não está na forma de dados de cinética quantitativa, mas sob a forma de informação qualitativa. Por exemplo, numerosos relatos indicaram que o ATM (Ataxia-telangiectasia mutada) afecta de p53 em resposta a danos no ADN [8]. Apesar de 1350 publicações descrever a ligação entre a ATM e p53 em PubMed, 57 documentos indicam que ATM fosforila p53 e apenas 11 papéis incluem as informações que ATM fosforila e ativa p53. De igual modo, exemplos de genes alvo p53 a jusante, tais como Bax (associada-BCL2 proteína X) que controlam o processo da apoptose ou CDKN1A (quinase inibidor 1A dependente de ciclina (p21 Cip1)) que controla a paragem do ciclo celular são bem estudados [9], [10]. No entanto, a cinética detalhada de apenas um subconjunto destas interacções é conhecido [11].

Por esta razão, a hipótese de que a nossa compreensão da função de p53 pode ser aumentada pela integração sistemática de tal conhecimento qualitativa em um grande -scale, modelo lógico consistente. Ao contrário dos modelos cinéticos, modelos lógicos não usam equações cinéticas que representam o mecanismo dinâmico detalhado de cada interação individual, mas ao contrário das redes qualitativos, eles incorporam informações sobre os efeitos das interações. Esta informação é geralmente representado sob a forma de lógica Booleana: cada nó (gene /proteína) no modelo lógico pode ter dois estados determinados, 0 ou 1, que representam uma forma inactiva ou activa, respectivamente; cada interacção pode ter dois efeitos determinados, a activação ou inibição do nó de destino. As vantagens de modelos lógicos são de que as simulações são rápido, mesmo para grandes modelos, que permitem uma exploração extensiva do espaço de estados do nó com a identificação de estados estacionários ou atratores de ciclismo, e eles fornecem uma aproximação da dinâmica não-linear reais de todo o sistema . Por exemplo, o grupo de Schlatter construída uma rede booleano com base em pesquisas na literatura e descrito o comportamento de ambas as vias intrínsecas e extrínsecas da apoptose em resposta a diversos estímulos. Seu modelo revelou a importância de loops de crosstalk e de feedback no controle vias apoptóticas [12]. Rodriguez et ai. construiu uma grande rede booleana para a FA /BRCA (Fanconi /Breast Cancer Anemia) via e simulado a reparação de ICLs DNA (intercadeias ligações cruzadas). Este modelo revelou a relação entre a via de reparo de DNA ativado e defeitos na via FA /BRCA [13].

Neste artigo, apresentamos um modelo lógico do sistema de p53 que integra 203 genes /proteínas, DNA entrada danos, apoptose e senescência celular saídas, ligados por 738 interações lógicas compilados a partir de bases de dados existentes e da literatura científica. O modelo, daqui em diante chamado PKT206 (PKT pé para o modelo de p53 construído por Kun Tian, ​​e o número que indica a população de nodos de proteína ou gene incluídos no modelo) pode ser utilizado para prever os efeitos de vias de danos de ADN sobre o destino celular. Nós apresentamos uma análise funcional deste modelo e investigar os efeitos de nocautes usando o software CellNetAnalyzer [14]. Várias previsões produzidas pelo modelo foram validados a partir da literatura externa e novos dados experimentais, acrescentando novas contribuições para o nosso conhecimento do sistema p53. O desempenho do modelo foi testada por análise de microarray e mostra-se que a proporção de bons prognósticos substancialmente excede a de previsões aleatório, variando entre 52% e 71%. Verificou-se que o modelo PKT206 é uma ferramenta de previsão promissora que pode aumentar a nossa compreensão dos complexos mecanismos de vias p53 e oferece uma nova abordagem para a terapia do câncer personalizado.

Resultados

construção Modelo

a fim de organizar o conhecimento do interactome p53 num quadro coerente, foi construído um modelo lógico do sistema de p53 (Figura 1, Tabela S1 S1 Arquivo). Neste modelo, os nós representam genes ou proteínas associadas que interagem com p53, e arestas representam as interacções entre elas. Dois tipos de processos que interagem são considerados: activação ou inibição. Em uma interacção de activação, o resultado é uma indução da actividade de nó (s) alvo, e em uma interacção inibidora, o resultado é uma repressão de actividade do nó de destino (s) [14]. Por exemplo, a indução de p53 estimula a expressão de MDM2 (Mdm2, p53 ubiquitina-ligase E3 proteína homólogo (rato)) [15], que é representada por uma interacção de activação de p53 MDM2. Ao mesmo tempo, a activação de MDM2 conduz à diminuição da regulação da proteína p53, o qual é representado por uma interacção de MDM2 inibir a p53 [16].

programas de interface Java foram criados para extrair interacções p53 a partir da base de dados STRING . Em seguida, com curadoria manualmente os dados e usou anotações Gene Ontologia para conectar a rede à entrada de danos ao DNA e saída de apoptose. CellNetAnalyzer foi utilizado para análise e simulações, e os resultados foram validados por meio de pesquisas bibliográficas e abordagens experimentais, incluindo análise de transferência e microarray ocidental.

Apesar de existirem inúmeros bancos de dados de gravação de interações genéticas e proteína-proteína, poucos registro

o efeito da interacção tem sobre o nó de destino. Uma exceção notável é a string (Search Ferramenta para Recuperação de interagir Genes /proteínas) do banco de dados [17], que distingue entre diferentes modos de acção, incluindo a ativação, a inibição e vinculativa. registros de interação da interactome p53 humano foram obtidos automaticamente a partir do primeiro banco de dados STRING (ver Materiais e Métodos). As interacções foram filtrados por retenção pontuações de confiança mais alta, tal como definido por STRING (mais do que 0,7). No entanto, por causa das limitações dos métodos de extracção de texto correntes em identificar modos de acção, o mesmo grupo de interacções de confiança elevada foi encontrada para conter alguns erros. Para evitar dados incorretos sendo incluídos no modelo, todos os registros de interação foram, assim, com curadoria manualmente através do levantamento da literatura associada e busca de provas adicionais. Exemplos dos tipos de erros encontrados e detalhes de interações que foram corrigidos após o processo de curadoria manual são apresentados na Tabela 2 e Figuras S1-S4 em S1 Arquivo.

Uma questão recorrente na construção de

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modelos é definir os limites do sistema. A fim de obter uma cobertura completa da interactoma p53, ainda assim, manter o tamanho do sistema dentro de limites aceitáveis ​​para a simulação, que incluiu todas as interacções de elevada confiança com genes /proteínas que interagem directamente com o p53, e adicionou todas as interacções entre estes genes /proteínas que não envolvem p53 diretamente. Este processo garantiu que loops de feedback reguladoras foram incluídos no modelo. Em alguns casos, as proteínas diferentes foram combinados em um único nó refletindo o fato de que a literatura anterior não fez distinção entre eles: este foi o caso de HRAS (v-Ha-ras, Harvey rato sarcoma viral homólogo oncogene), KRAS (v- Ki-ras2, Kirsten sarcoma de rato homólogo viral oncogene), de ARN (RAS neuroblastoma virai (v-Ras) homólogo oncogene) e RASD1 (RAS, 1 induzida por dexametasona), representada como uma única RAS nó; CCNA1 (ciclina A1) e CCNA2 (A2 ciclina) representada como CCNA; CSNK2A1 (caseína quinase 2, alpha 1 polipeptídeo) e CSNK2A2 (caseína quinase 2, alfa polipeptídeo prime) representada como CSNK2.

As células respondem a vários estímulos de estresse, incluindo as radiações ionizantes e UV (ultravioleta), a ativação do oncogene, calor choque, hipóxia, etc [18]. O DNA danos resposta mediada por p53 é bem estudada e de maior relevância clínica, pois a maioria das estratégias de tratamento do câncer envolvem as vias de danos ao DNA. Portanto, danos no ADN foi adicionado como um sinal de entrada através da ligação da rede para um nó de entrada única que representa danos no ADN. Da mesma forma, a apoptose e senescência celular foram selecionadas como as saídas melhor estudados e mais clinicamente relevantes entre inúmeras outras possibilidades, incluindo a parada do ciclo celular, reparo do DNA e angiogênese. Assim, a rede foi ligado a dois nós de saída que representam a apoptose e senescência. Links de danos no DNA e no sentido de apoptose e senescência foram curadoria usando termos Gene Ontology (Tabelas S3-S5 em S1 Arquivo), bem como curadoria manual adicional. O modelo resultante, chamado PKT206, composto 203 nodos gene /proteína, um nó de entrada (de danos ao DNA), dois nós de saída (apoptose e senescência) e 738 interações. listas completas de genes /proteínas e interacções com referências a provas de literatura baseada são fornecidos nas Tabelas S1 e S3-S5 em S1 Arquivo.

Estrutura do modelo lógico p53

O nó p53 está conectado para 202 genes ou proteínas na rede e participa em interacções 225 (Figura 2). Cinco camadas podem ser distinguidas na rede de acordo com a relação de nodos para p53: o sinal de entrada, danos no ADN; nós a montante de p53; p53 e MDM2 em si; nodos jusante de p53; e as saídas, a apoptose e senescência. Verificou-se que os nós 67 funcionava como gânglios a montante de p53. Por exemplo, ATM funciona como um dano ao DNA nó inducible a montante do p53 [19]; p53 activa directamente, bem como através CHEK2 (cinase de ponto de verificação 2) sobre-regulação [20] – [22]. 146 nodos funcionava como alvo genes p53, incluindo bem estudados genes pró apoptóticas tais como BAX [9] e CDKN1A que controla a paragem do ciclo celular [23]. 11 genes funcionava tanto como nós a montante ea jusante de p53 e estavam envolvidos em duas etapas loops de feedback.

O modelo PKT206 representado por Cytoscape inclui 203 nós gene /proteína, um nó de entrada (de danos ao DNA), dois nós de saída (apoptose e senescência celular) e 738 bordas. conexões de activação e inibição estão representados por setas azuis e vermelhos, respectivamente. O nó de entrada foi marcada pelo verde; os nós a montante do p53 foram marcados por amarelo; p53 e MDM2 foram marcados pelo vermelho, os nós jusante da p53 foram marcados por luz nós azuis e de saída foram marcados por laranja.

Foi calculado o grau de conectividade dos 206 nós na rede (Figura 3). O grau de ligação de um gene indica o número de interacções para este gene. O gene mais ligada foi p53, que participou em 225 interações no modelo PKT206. Havia 30 genes com grau de conectividade entre 10 e 100 e os restantes genes estavam envolvidos em menos de 10 interações

A distribuição grau de 206 nós do modelo foi obtida pelo plugin NetworkAnalyzer para Cytoscape.; ambos os eixos na figura são em escala logarítmica.

A rede contém 30 feedback em duas etapas laços no total, com 14 envolvendo p53. Alguns deles desempenhar um papel significativo na regulação de p53; por exemplo, o feedback laços envolvendo p53, MDM2 e MDM4 (ligação Mdm4 p53 homólogo de proteína (mouse)), que incluem cinco interacções: p53 ativa MDM2; MDM2 inibe p53; MDM2 inibe MDM4; MDM4 ativa MDM2 e MDM4 inibe MDM2 [24]. Laços de realimentação desempenhar um papel crucial na regulação de p53 e são pensados ​​para aumentar a robustez do sistema, em resposta a perturbações [25].

P53 tem sido implicado em numerosas respostas celulares ao stress incluindo IR (radiação ionizante), UV, a activação do oncogene, e hipoxia. Para este modelo para ser capaz de prever o destino celular, em resposta ao stress, que ligada 20 nós para o dano de ADN sinal de entrada (Tabela S3 no ficheiro S1). A maioria dos links de danos no DNA são ativações e apenas 3 são inibições (danos no ADN inibe PTTG1 (pituitária tumor de transformação 1), MYC (v-myc, mielocitomatose homólogo oncogene viral (aviária)) e AURKA (aurora quinase A). Da mesma forma , controles de p53 numerosas respostas celulares ao estresse tais como parada do ciclo celular, reparação de danos ao DNA, senescência e apoptose. Encontramos 95 ligações entre os nós de genes a jusante e apoptose e 77 nós de interagir com o nó de apoptose. Entre eles, 18 nós ambos promovidos e impediu apoptose, 38 nós somente induziu apoptose e 21 nós só tinha a função anti-apoptótica. Nós encontramos 52 genes ligados à senescência por 61 ligações, entre os quais 28 promovam e 33 impedem a senescência.

Análise de dependências no modelo de p53

dependências lógicas entre os genes /proteínas são representados pela matriz de dependência [14], que representa os efeitos entre todos os pares de nós no modelo. Seis tipos de efeitos são definidos por CellNetAnalyzer baseada na existência (ou não ) de caminhos positivas e negativas entre dois nós: nenhum efeito, factor ambivalente, inibidor fraco, ativador fraco, forte inibidor e ativador forte (ver Métodos para detalhes). Há 42,436 (206 × 206) elementos na matriz de dependência, dos quais 23.468 correspondem a interações que têm nenhum efeito; 16.540 são fatores ambivalentes; 1100 são inibidores fracos; 1240 são activadores fracos; 33 são inibidores fortes e 55 são activadores fortes (Tabela S6 em S1 Arquivo). A maioria dos elementos da matriz de dependência são nenhum efeito ou fatores ambivalentes. O grande número de factores ambivalentes é devido à complexidade dos efeitos de regulação, entre nodos, que são afectadas por ambas as espiras e vias de feedback positivo e negativo. Por exemplo, existem dois caminhos positivos e negativos a partir de ATM para CHEK2: o caminho positivo é uma activação directa de CHEK2 pelo ATM, enquanto que o caminho negativo é uma inibição indirecta, como ATM activa p53, p53 inibe MYC, MYC activa E2F1 (E2F fator de transcrição 1), e E2F1 ativa CHEK2. Como resultado, a interação entre esses dois nós é determinado pela oposição ativando e os efeitos da inibição, resultando em ele ser classificado como ambivalente (Figura S5 em Arquivo S1).

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simulação de efeitos de mutação

a fim de avaliar a capacidade do modelo PKT206 prever os efeitos de perturbação, foi realizada

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testes knock-out, em que um determinado nó foi removido da rede imitando, assim, em efeitos de mutação in vivo. Como 85% dos genes ou proteínas no modelo PKT206 foram mal conectado, p53 e esses 30 genes com mais de 10 interações foram selecionados para realizar

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knock-out testes. Por exemplo, simulamos uma p53 knock-out, removendo o nó p53 a partir da rede e analisados ​​os efeitos dessa perturbação. Através da comparação da matriz de dependência após o nó de p53 foi removido com o caso de tipo selvagem, as alterações de elementos de matriz revelou como as relações entre os nós foram afectadas pela eliminação. 11785 para fora dos (205 × 205) 42,025 elementos na matriz alteradas como resultado da remoção de p53 (Figura 4A). Grandes mudanças estão listadas na Tabela S7 em S1 Arquivo. As alterações mais significativas eram de factores ambivalente com activadores ou inibidores, reflectindo o facto de que a p53 desempenha um papel importante na modulação de efeitos do sistema. 11 out of 31

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testes knock-out teve grandes mudanças na nova matriz de dependência quando um determinado nó foi removido (Tabela S6 em S1 Arquivo). 63 potenciais previsões de grandes mudanças em células de dependência foram obtidos a partir dos 11

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testes knock-out (Tabela 1). Não houve grandes mudanças do efeito encontrados em outros 20

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knock-out testes.

(A) Distribuição de mudanças na matriz de dependência do p53

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knock-out em comparação com o tipo selvagem. O ciclo de cinza representa nenhum efeito elementos, o círculo laranja representa fatores ambivalentes, o círculo verde-claro representa ativadores fracos, o círculo rosa representam inibidores fracos, o círculo vermelho escuro representa inibidores fortes, eo círculo verde escuro representa ativadores fortes; a direcção da seta representa a direcção de mudanças na knock-out. (B) Chk1 (CHEK1) activação está aumentada em p53 fundo negativo. células U2OS que têm p53 funcional e células SAOS2 que carecem de p53 funcional foram tratadas com 10? M de etoposido durante 16 horas. Os extractos celulares foram analisados ​​por SDS-PAGE e análise Western blot utilizando anticorpos contra total de Chk1, ATR e ATM. ATM e ATR fosforilada Chk1 em Ser 345.

Foi confirmada em 4 desses 63 previsões através de pesquisas bibliográficas, com foco em grandes mudanças causadas pela eliminação p53, que eram esperados para ter efeitos mais fortes experimentais . Por exemplo, o efeito de dano de DNA para o FAS (FAS (superfamília de receptores de TNF, membro 6)) foi alterado de um factor ambivalente no modelo de p53 de tipo selvagem para um activador forte quando p53 foi removido. O efeito de dano de DNA para o FAS foi classificada como ambivalente nas células de tipo selvagem porque existem caminhos potenciais negativos de danos ao DNA através de FAS myc e PTTG1, para além de um caminho directo positivo de danos no ADN ao FAS. Quando p53 é eliminado, apenas o caminho positivo subsiste. Manna et ai. ter determinado que, em células menos p53, os níveis de proteína Fas estão elevados sob a danos no DNA em comparação com p53 células do tipo selvagem, que está de acordo com nossa previsão [26]. De modo semelhante ao FAS, o efeito de LATS2 (LATS, grande supressor de tumor, homólogo 2 (Drosophila)) sobre apoptose foi alterado de um factor ambivalente no modelo de p53 de tipo selvagem para um activador forte quando p53 foi removido. Verificou-se que em ambos p53 do tipo selvagem (A549) e as células p53 minus (H1299), LATS2 foi capaz de induzir a apoptose e que a apoptose é ligeiramente aumentada em H1299 conforme medido por PARP e a caspase 9, clivagem [27]. Observou-se que o efeito de dano de DNA para o CHEK1 (cinase de ponto de verificação 1) alterado de um factor ambivalente no p53 de tipo selvagem para um activador forte quando p53 foi removido. Os níveis de proteína CHEK1 foram encontrados para ser mais elevada em p53 – /- células que em p53 + /+ HCT116 células cancerosas colorectal tratados pela daunorubicina [28], o que também corresponde a nossas previsões (Tabela 1). Foi relatado que KLF4 (-Kruppel como factor de 4 (intestino)) causou redução de mais CCNB1 expressão (ciclina B1) em p53 – /- do que nos HCT116 células p53 + /+ HCT116 [29] e que combinava a previsão do modelo. No entanto, uma previsão para fora desses 63 previsões foi encontrado em frente à evidência literatura. A previsão indicou que IFNA1 (interferão alfa 1) reforçada TLR3 (Toll-like receptor 3) em células mutantes de p53 em comparação com células de p53 do tipo selvagem. Mas este foi oposto ao facto relatado por Taura et ai. que IFNA1 exposta ao ADN prejudiciais droga 5-fluoro-uracilo (5-FU) reduz a expressão de TLR3 em p53 – /- de células HCT116 em comparação com p53 + /+ células HCT116 [30]

Além disso. a validação com base literatura, obtivemos evidência experimental baseado

in vitro

para apoiar novas previsões do modelo. O modelo previu que, na ausência da p53 funcional, os efeitos da ATM e ATR (Ataxia-telangiectasia e Rad3 relacionadas) para CHEK1 faria tanto a mudança de factores ambivalentes a activadores fortes. Uma análise por Western blot de U2OS células de osteossarcoma humano que têm p53 de tipo selvagem, e de células SAOS2 que têm p53 não funcional mutante, demonstraram que CHEK1 é activado a uma maior extensão no fundo da p53 mutante que no fundo da p53 de tipo selvagem (Figura 4B) validar esta previsão. Além disso, os níveis mais elevados de activação e potencial de ATM e ATR-quinases foi observada em células p53 menos do que nas células positivas p53. De acordo com o modelo, existem dois caminhos positivas e negativas entre ATM, ATR, CHEK1, e p53 nas células do tipo selvagem, e, por conseguinte, em células mutantes de p53 este equilíbrio é perturbado (Figura 5). Isso confirma a capacidade de previsão da nossa abordagem de modelagem e tem consequências para o tratamento de tumores negativos p53

(A) caminhos positivos e negativos de ATM /ATR para CHEK1 em células de tipo selvagem p53 como conhecido da pesquisa bibliográfica.; (B) caminhos positivos e negativos de ATM /ATR para CHEK1 em células p53 menos. ARF é 2A inibidor da quinase dependente da ciclina. PPM1D é proteína fosfatase 1D. pRB é retinoblastoma 1.

análise de estado estacionário lógico

A proteína p53 é conhecida para manter a estabilidade do genoma e na ausência de p53 leva à proliferação celular em resposta a danos no ADN [31] . A ausência de estabilidade genética provoca a acumulação de mutações em células normais e provoca o cancro [32]. A fim de investigar como tal perda de estabilidade poderia ser capturado por nosso modelo, foi realizada uma análise constante lógica comparativa do estado no modelo de tipo selvagem p53 e

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p53 knock-out.

Num estado estacionário lógico (LSS), o estado de cada nodo continua a ser a mesma ao longo do tempo [33]. Cada nó pode ter três estados diferentes: inactivada ( “0”), activado ( “1”) ou indeterminada ( “NaN”). Nós investigamos quatro cenários para a análise de estado estacionário lógica: (1) dano ao DNA é ativado em p53 do tipo selvagem de fundo; (2) danos ao DNA não é activada no p53 do tipo selvagem de fundo; (3) o dano ao DNA é ativado em p53 fundo knock-out; (4) Os danos do DNA não é activada no p53 knock-out de fundo (Figura 6, Tabela 2 e Tabela S8 em S1 Arquivo). A comparação de estados lógicos estáveis ​​em diferentes cenários revelou que um grande número de estados de nó não se alterou com a mudança do sinal de entrada. Este resultado é explicado pela grande número de efeitos ambivalentes entre os nós e os laços de realimentação na rede, o que torna o modelo robusto para perturbações do sinal de entrada. A proporção de estados determinou-se 181 de 206 nós (87,9%) no cenário (1), 182 de 206 nós (88,3%) no cenário (2), 94 out de 205 nós (45,9%) no cenário (3) e 95 dos nodos 205 (46,3%) no cenário (4) (Tabela 2). Esses números mostram que quase metade dos nós cujo estado é determinado no tipo selvagem, tornar-se indeterminado do

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p53 knock-out.

Os nós com o estado “1” foram representados em verde, os nós com o estado “NaN” (un determinado) foram representados em laranja, e os nós com o estado “0” foram representados em vermelho. (A) P53 de tipo selvagem quando o dano ao DNA foi “ON”; (B) P53 de tipo selvagem quando o dano ao DNA foi “OFF”; (C) P53 mutante quando o dano ao DNA foi “ON”; (D) O p53 mutante quando danos no ADN foi “OFF”.

Comparando o estado de 202 genes que interagem com p53 em células p53 do tipo selvagem na presença de danos no ADN em células e os mutantes de p53 em a presença de danos no ADN, verificou-se que apenas 29 genes foram supra-regulados, 113 genes não se alterou e 60 genes foram regulados negativamente (Tabela 3). A mudança de FEN1 (endonuclease específica-estrutura de retalho 1) afirmam, aliás, foi verificada experimentalmente por Christmann et al, através da descoberta de que FEN1 foi reprimido em células nulas p53 sob o dano ao DNA [34]. TLR3 foi encontrado para ser regulada em células p53 mutante sob danos no DNA [35].

Comparando o estado desses 202 genes em células de tipo selvagem p53 na ausência de danos no DNA e aqueles em p53 células mutantes, na ausência de danos no DNA (Tabela 3), observou-se que 30 genes foram supra-regulados, 112 genes permaneceram os mesmos e 60 genes foram regulados negativamente em células p53 do tipo selvagem na ausência de danos no ADN. A mudança de 6 gânglios foram verificados por O’Prey et ai. [36]. 4 nós foram demonstrados como previsões corretas: os níveis de FAS expressão (superfamília de receptores de TNF, membro 6), TNFRSF10B (fator de necrose tumoral superfamília de receptores, membro 10b), PERP (PERP, TP53 apoptose efetoras) e p53AIP1 (proteína tumoral p53 regulada apoptose induzindo proteínas 1), foram sub-regulada de p53 células de tipo selvagem sem dano ao DNA de células p53 mutante, sem danos ao DNA, enquanto que a MDM2 outros 2 nós e CDKN1A foram previstos forma inalterada por simulação do modelo. No entanto, O’Prey et ai. Observou sua infra-regulação a partir de células de tipo selvagem p53 sem dano ao DNA de células mutantes p53 sem danos ao DNA [36]. De acordo com os critérios definidos na seção de métodos, quatro previsões estavam corretas e os outros dois eram pequenos previsões de erro.

Comparando o estado destes 202 nós em p53 células de tipo selvagem na presença de danos ao DNA e esses nós em p53 células de tipo selvagem na ausência de danos no DNA (Tabela 3), verificou-se que apenas 5 genes foram regulados positivamente, 185 genes não foram alteradas e 12 genes foram regulados negativamente na célula p53 tipo selvagem induzida por danos no DNA.

Comparando o estado destes 202 nodos em células p53 mutante na presença de danos no ADN e os nós em células mutantes de p53 na ausência de danos no DNA (Tabela 3), observou-se que 7 genes foram supra-regulados, 181 genes permaneceu o mesmo e 14 genes foram regulados negativamente em células mutantes p53 induzida por danos no DNA. Em conjunto, estes resultados acima reflectir o facto de que a p53 ajuda a estabilizar o sistema.

As alterações no estado de genes anti-apoptóticos e anti-senescência são mostrados na Tabela S9 no ficheiro S1 e as de pro-apoptótica e genes pró-senescência estão listadas na Tabela S10 em S1 Arquivo. Esta distribuição ilustra a razão pela qual a saída de apoptose também foi activada em células p53 mutantes. A maioria desses 56 genes pró-apoptóticos e 39 genes anti-apoptóticos não foram alterados no mesmo tipo de células tratadas por danos no ADN. A ausência de p53 provocou alterações óbvias de ambos os genes pró-apoptóticos e anti-apoptóticos uma vez que as células foram tratadas com danos no DNA. O número de genes pró-apoptóticos e anti-apoptóticos que foram supra-regulados ou regulados negativamente aumentou com o esgotamento da p53. Entre os 56 genes pró-apoptóticos, FAS e p53AIP1 foram regulados positivamente em células mutantes p53 quando tratado por danos ao DNA. FGF2 (factor de crescimento de fibroblastos 2 (básico)) teve tanto a função pró-apoptóticos e anti-apoptóticos no modelo PKT206 e foi regulada para baixo em células p53 do tipo selvagem ou células p53 mutante na presença de danos no ADN. Notavelmente, IGF1R (um receptor do factor de crescimento semelhante à insulina) e PDGFRB (receptor do factor de crescimento derivado de plaquetas, o polipéptido beta) foram regulados positivamente em cenários menos p53, que, em conjunto com as mudanças FGF2 destacadas de crescimento do factor mediado vias de sinalização como factor importante que contribui para a sobrevivência de estes tumores.