Abstract

O gene antígeno do câncer de próstata 3 (

PCA3

) é incorporado em um intron de um segundo gene

BMCC1

(Bcl2- /E1B de adenovírus dezenove kDa- interagindo proteína 2 (BNIP-2) e Cdc42GAP homologia BCH molécula contendo o motivo na região carboxilo terminal 1) que também é regulada positivamente em cancro da próstata. BMCC1 foi inicialmente anotada como dois genes (

C9orf65 /PRUNE

e

BNIPXL

) de cada lado do PCA3 mas os nossos dados sugerem que representa um único gene que codifica para uma proteína de alto peso molecular. Aqui demonstramos pela primeira vez que a expressão de um GT 300 kDa BMCC1 (BMCC1-1) no cancro da próstata e linhas celulares de melanoma. Esta proteína foi encontrada exclusivamente na fracção de microssomas e localizada para vesículas citoplasmáticas. Observou-se também a expressão da proteína BMCC1 nas seções de câncer de próstata utilizando imuno. GST puxar para baixo, estudos de imunoprecipitação e interação proteína espectrometria de massa identificados vários membros do adaptador Complexo relacionado a 2 (AP-2) como interagentes BMCC1. Consistente com um papel para BMCC1 como uma proteína que interage endossomal AP-2, BMCC1 co-localizada com β-adaptina na região perinuclear das células. BMCC1 também mostraram co-localização com o início parcial do endossoma pequena GTP-ase Rab-5, bem como co-localização com forte internalizada pulse-chase transferrina marcada (Tf), fornecendo indícios de que BMCC1 está localizada a vesículas endocíticas funcionais. BMCC1 knockdown não afetou a captação Tf e AP-2 knockdown não se dispersou BMCC1 distribuição vesicular, excluindo um papel essencial para BMCC1 na AP-2 captação endocítica mediada canônico. Em vez disso, postulamos um novo papel para BMCC1 no tráfico de pós-endocítica. Este estudo fornece caracterização fundamental do complexo BMCC1 em células de câncer de próstata e, pela primeira vez implica que no tráfico vesícula

Citation:. Harris JL, Richards RS, Chow CWK, Lee S, Kim M, Buck M, et ai. (2013) BMCC1 é um AP-2 Associated Endossomal proteína nas células do cancro da próstata. PLoS ONE 8 (9): e73880. doi: 10.1371 /journal.pone.0073880

editor: Gnanasekar Munirathinam, da Universidade de Illinois, Estados Unidos da América

Recebido: 05 de fevereiro de 2013; Aceito: 23 de julho de 2013; Publicação: 06 de setembro de 2013

Direitos de autor: © 2013 Harris et al. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Licença Creative Commons Attribution, que permite uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o autor original ea fonte sejam creditados

Financiamento:. Este projecto foi financiado pela Fundação de Câncer de próstata da Austrália. Os financiadores não tiveram nenhum papel no desenho do estudo, coleta de dados e análise, decisão de publicar ou preparação do manuscrito

CONFLITO DE INTERESSES:.. Os autores declararam que não existem interesses conflitantes

Introdução

O câncer de próstata é um tumor maligno diagnosticado e uma das principais causas de morte por câncer em todo o mundo. Esta condição apresenta um amplo espectro de mudanças e comportamentos histológicas, variando de lesões pré-malignas, ao câncer de próstata localizado que seguem um curso indolente a uma percentagem de cancros que metástase no início e progresso rapidamente [1]. Portanto, além do desenvolvimento de ferramentas de diagnóstico e de prognóstico melhoradas, é necessário um conhecimento detalhado da biologia celular de desenvolvimento e progressão do cancro da próstata. Um dos biomarcadores mais promissores para o cancro da próstata é o não-codificante de ARN de PCA3 [2,3]. Este RNA foi identificado como um biomarcador cancro da próstata por análise de exibição diferencial de ARN a partir de tecido normal e maligno histologicamente dos mesmos pacientes, e foi originalmente descrito como Diferencial de exibição clone 3 (DD3) [2]. Altos níveis de expressão de PCA3 estão fortemente associados com a transformação maligna do epitélio da próstata, no entanto, a base biológica para esta correlação não foi elucidado [2-4].

Foi demonstrado anteriormente que a

PCA3

é incorporado no intrão de um outro gene,

BMCC1

[5].

BMCC1

foi originalmente anotada como dois genes discretos

c9orf65 /PRUNE

(que codifica para a região N-terminal) e

BNIPXL

(que codifica para a região C-terminal). A

BNIPXL

(

BMCC1-4

) de leitura aberta foi identificado pelo banco de dados em busca de homólogos para a Bcl-2 interagindo proteína BNIP-2 [6]. Os autores identificaram

BNIPXL /BMCC1-4

como um gene com uma região de alta

BNIP-2

homologia, e nomeou a região homóloga do BCH (BNIP-2 /Cdc42GAP homologia) de domínio [ ,,,0],6]. Usando proteínas expressas marcadas BNIPXL exogenamente, que demonstrou que ela interage com RhoA e o seu activador do proto-Lbc [6]. A co-expressão de interacção e os estudos demonstraram que se liga a RhoA BNIPXL e proto-Lbc através de diferentes regiões e que bloqueia a expressão BNIPXL sinalização RhoA, pelo menos parcialmente, através da inibição da interacção de RhoA-Lbc estimuladora [6]. Machida et ai. [7] identificou uma isoforma mais longa de BMCC1 em neuroblastoma humano (BMCC1-3), que se estendeu por exons que codificam 7-19 da tarde BMCC1-1 identificados. Altos níveis de expressão desta transcrição foram correlacionados com um prognóstico mais favorável para esse tipo de câncer. A evidência para a expressão do comprimento BMCC1-1 transcrição completa que mede o

c9orf65

e

BNIPXL

genes foi fornecida por Iwama et ai. [8], que clonaram um ADNc de comprimento completo a partir de células HeLa. Neste estudo e, subsequentemente, os transcritos foram detectados BMCC1 em regiões restritas do cérebro do rato [8,9]. Clarke et al. [5] demonstraram que a expressão do RNA BMCC1 é elevada no cancro da próstata e metástases em comparação com o tecido benigno, indicando que pode ser BMCC1 funcionando de forma diferente em diferentes tipos de cancro e tipos de tecidos. Uma visão geral da expressão da isoforma BMCC1 e as diversas funções do domínio BCH contendo proteínas é fornecido em publicações recentes [10,11].

A identificação inicial de uma proteína correspondente a BMCC1-1 foi demonstrada por Iwama et ai. [8]. Este grupo levantou um anticorpo específico para a região N-terminal extremo de BMCC1-1, e apesar de múltiplas bandas foram detectadas por Western Blot de MR Hela, células HEK293T e KNS81 glioma, apenas bandas 250 kDa eram sensíveis à depleção siRNA específico. espectrometria de massa foi utilizada para identificar esses altos bandas de peso molecular como BMCC1-1. No mesmo estudo, a expressão de proteína exógena a partir de um clone de ADNc também produziu várias bandas em SDS-PAGE, o que provavelmente indica proteólise substancial, tornando difícil interpretação. Mais recentemente, Li et al. [12] identificado olfaxin proteínas correspondentes aos locais de iniciação de transcrição BMCC1 alternativos expressos no bolbo olfactivo, com a banda predominante a 52 kDa. Arama et ai. [11] detectada uma banda do mesmo tamanho em lisados ​​cérebro integrais e neurônios cultivados e astrócitos, que eles chamaram de BMCC1s. No presente estudo, expressão e caracterização inicial de uma única proteína de 340 kDa BMCC1 na linha celular de cancro da próstata LNCaP é descrito. A identidade desta proteína foi estabelecido por detecção robusta com vários anticorpos para C- e regiões N-terminais da proteína, por depleção de siRNA específico e apoiada por análises MALDI TOF /TOF. Pela primeira vez, identificámos interacções de proteína endógena que envolvem uma região fora do domínio BCH. Descobrimos que uma região BMCC1 sem domínios funcionais computacionalmente identificáveis ​​interage com o complexo de proteína Adaptador 2 (AP-2). Nós também demonstrou co- localização de BMCC1 com β-adaptina e vários marcadores, incluindo Rab5 endossomais e transferrina internalizado (TF). análises funcionais preliminares sugerem BMCC1 é uma proteína que interage não-canônico AP-2 envolvidos no tráfico de pós-endocítica.

Materiais e Métodos

Os tecidos e linhas celulares

tecidos da próstata Humanos foram doados por pacientes no Brisbane Hospital Real com o consentimento informado escrito sob aprovação ética do Instituto Queensland de Pesquisa médica comissão de ética humana. formulários de consentimento dos pacientes, foram mantidos. tecidos de camundongos foram obtidas a partir de mês a5 velho do tipo selvagem macho BalbC rato, sob aprovação ética do Instituto Queensland de Pesquisa Médica (QIMR) animais comitê de ética. LNCaP, 22Rv1, DU145, RWPE1, alva, PC3 e MCF-7 foram obtidas da ATCC. A11, D11, D28, D33 e D38 foram presentes de laboratório Chris Schmidts (QIMR). Estes foram obtidos de pacientes inscritos em ensaios clínicos em QIMR, com consentimento informado por escrito do comitê de ética em pesquisa humana QIMR. Um estudo sobre o microarray linhas de células A11 e D11 foi publicada [13], como tem um estudo clínico sobre os pacientes da série D [14]. Todas as linhas celulares foram mantidas em DMEM (Gibco) com penicilina e estreptomicina, suplementado com soro fetal bovino a 10% inactivado pelo calor (Gibco).

Extração de RNA e Síntese de cDNA

ARN total de linhas celulares e tecidos foi purificado utilizando Trizol (Invitrogen) de acordo com as instruções dos fabricantes. Este ARN foi transcrito de forma inversa em ADNc utilizando Superscript III (Invitrogen) de acordo com as instruções dos fabricantes.

PCR e a geração de clones de cDNA

clones de ADNc de BMCC1 e outros genes foram geradas por amplificação de o alvo a partir de cDNA de LNCaP. Os oligonucleótidos foram adquiridos a Sigma Aldrich, amplificações de PCR convencionais foram realizados Wth

Pfu Turbo

(Roche). condições de ciclo típicas foram 92 ° C 2 minutos, seguido de; 92 ° C durante 30 seg, 60 ° C durante 30 seg, 72 ° C durante 90 seg /kb (2 ciclos); 92 ° C durante 30 seg, 57 ° C durante 30 seg, 72 ° C durante 90 seg /kb (2 ciclos); 92 ° C durante 30 seg, 53 ° C durante 30 seg, 72 ° C durante 90 seg /kb (30 ciclos). Todos os Q-PCR foi realizada utilizando o Corbett Rotorgene-6000 (Qiagen, Austrália), Rotorgene-6000 Software Series (Qiagen, Austrália) e Kit de PCR verde Quantitect® SYBR® (Cat. No. 204143, Qiagen, Austrália). As reacções foram preparados em triplicado e cada um continha 7.5μl de qPCR Master Mix, 0,5 � 10 uM de cada iniciador directo e 5 ul de ADNc e diluída (diluição 1:10) inverter. condição de ciclagem por BMCC1 e p

2M iniciadores foram como se segue: 95 ° C durante 15 min, seguido de 45 ciclos de 95 ° C durante 20 seg, 58 ° C durante 20 seg e 72 ° C durante 20 seg. As condições de amplificação para os iniciadores AP2M1 foram como se segue: 95 ° C durante 15 min, seguido de 45 ciclos de 95 ° C durante 20 seg, 60 ° C durante 20 seg e 72 ° C durante 20 seg. Os dados foram gerados com o-6000 Rotorgene software da série e níveis de expressão génica relativos foram calculados utilizando metodologia descrita no Pfaffl [15]. As sequências dos iniciadores e os locais de restrição são indicados no material suplementar (Tabela S1). Todas as enzimas de restrição foram adquiridas a NEB.

expressão de proteína recombinante, purificação e reticulação

a expressão da proteína recombinante e purificação de reticulação e foram realizados como previamente descrito [16].

Anticorpos

recombinante GST-BMCC1 proteínas de fusão foram expressas e purificadas tal como descrito acima. Os anticorpos de coelho Ab-1 e Ab-3 foram gerados por injecção de coelhos com proteínas de fusão GST eluido, não desnaturadas (usando o Instituto de Ciência Médica e Veterinária, Adelaide taxa de dose padrão, horário e adjuvantes). BMCC1 Ab-2 anti-soro foi gerado por meio de inoculação de um coelho com proteína de fusão GST desnaturado incorporado em pedaços de gel de poliacrilamida não fixadas (IMVS). BMCC1 anti-soro de ovelha foi gerado por meio de inoculação de um carneiro com proteína de fusão GST-BMCC1 não desnaturada eluído (IMVS) (Ab-4). Todas as proteínas tinham etiquetas GST N-terminais quando inoculadas e as sequências BMCC1 específicos para cada um dos anticorpos estão detalhados na Tabela S1. anticorpos específicos e anticorpos de controlo não específicos foram purificados a partir do soro, como descrito [16].

anticorpos comerciais utilizados neste projeto foram rato anti DNA-PKcs (produto Santa Cruz 18-2), rato RNA polimerase anti- II (Abcam, ab5408), de coelho anti-β-adaptina (que detecta PA-1B1 e PA-2B1) (Santa Cruz A-5), de ratinho anti-EEA1 (BD Transduction Laboratories, 610,457), de ratinho anti-α-tubulina (Sigma T9026) e rato anti-GAPDH (Millipore MAB374). anticorpos secundários de burro conjugado AlexaFluor apropriadas foram obtidos a partir de anticorpos secundários conjugados Invitrogen e HRP foram da Sigma.

plasmídeo e siRNA transfecção

LNCaP foram semeadas em 6 pratos bem em meio de crescimento sem antibiótico, pelo menos, 48 h antes da transfecção. Os plasmídeos foram transfectados em células LNCaP utilizando Lipofectamine 2000 (Invitrogen) de acordo com as instruções do fabricante (2 ug do plasmídeo e 5 ul de Lipofectamina 2000 por 9,5 cm

2 também). ARNic em cadeia dupla foram adquiridos da Invitrogen (sequências na Tabela S1) e transfectadas utilizando Lipofectamine RNAiMAX ou Lipofectamine 2000 (100 pmol de siRNA duplex e 5 mL de Lipofectamine por 9,5 cm

2 também).

Geração de células e lisados ​​de tecido

células foram separadas do seu substrato de crescimento por tripsinizao em DMEM isento de soro com tripsina a 0,025% (Gibco), e a tripsina foi inactivada pela adição de DMEM contendo 10% de soro. As células foram sedimentadas por centrifugação (500 x g durante 5 min) e lavadas duas vezes em PBS. peletes de células lavadas foram então submetidas a lise em gelo-frio Mammalian Cell Lysis Buffer (MCLB, Tris 50 mM, pH 7,4, NaCl 150 mM, EDTA 1 mM, 1% de NP-40). Todos os lisados ​​contêm uma concentração de 2 x Roche inibidor da protease livre de EDTA completo. Lavagem minuciosa para remover a tripsina de cultura celular e a adição de uma alta concentração de inibidores da protease são

crítica para detectar não degradada BMCC1, que é sujeito a proteólise rápida. Os lisados ​​dos tecidos foram gerados por homogeneização em MCLB, por moagem num tamanho de 22 homogeneizador Dounce de vidro esmerilado Kontes. De células e tecidos lisados ​​foram clarificados por centrifugação (17.000 x g durante 20 min a 4 ° C). Lisados ​​de tecido do cérebro foram submetidos a um processamento adicional para remover uma camada de lípidos flutuantes. Lisados ​​de tecido do cérebro foram separados sobre a Biorad Micro BIOSPIN colunas de cromatografia de dessalinização, que tinha sido pré-equilibrada com MCLB, que removeu o material insolúvel pegajoso. As concentrações de proteína foram determinadas usando o ensaio de proteínas Biorad, Lowry com padrões de BSA.

Western blotting

Amostras em Laemelli tampão de carga de SDS-PAGE foram sujeitos a SDS-PAGE padrão. As proteínas foram transferidas para nitrocelulose Amersham em tampão de transferência (6 g de base /L de Tris, 3 g /l de glicina, 0,36 g /L de DPS, 20% de metanol) para 100 V. H. As membranas foram bloqueadas em solução de bloqueio (PBS-0,05% de Triton-X100, com 5% de BSA ou PBS /0,07% de Tween 20 com 4% de leite desnatado em pó). As membranas foram sondadas utilizando entre 0,2 e 5 ng /mL dos anticorpos indicados em solução de bloqueio à temperatura ambiente durante 2 h ou 4 ° C durante a noite e detectado utilizando anticorpos conjugados com HRP secundário e reagente luminol Ocidental relâmpago (Pierce).

imunoprecipitação e GST pulldowns

Os lisados ​​celulares foram criadas tal como descrito acima. Para a imunoprecipitação, os lisados ​​foram incubados com anticorpos ou nula purificada BMCC1 (0,5-2 ug de anticorpo por mg de lisado) a 4 ° C durante a noite. BMCC1 complexos de anticorpo foram precipitados por adição de proteína G de resina de agarose durante 2 h a 4 ° C. Para pulldowns GST, os lisados ​​foram incubados com proteína de fusão de resina reticulada BMCC1-GST, a 4 ° C durante a noite. Em ambos os casos, as proteínas não ligadas foram lavadas a partir da resina em 3 x 20 lavagens volume de leito de tampão de lise frio. As proteínas precipitadas foram eluídas por adição de 2 volumes de leito de resina de tampão de carga de SDS-PAGE. proteínas eluídas foram então analisadas por SDS-PAGE e Western blotting.

Espectrometria de Massa

corado com prata pedaços de gel foram descoradas em 15 mM de ferricianeto de potássio e 50 mM de tiossulfato de sódio e lavou-se em água. Peças foram desidratadas em 25 mM de bicarbonato de amónio /% de acetonitrilo e de vácuo 50 secos. Eles foram sequencialmente reduzidas e alquiladas com iodoacetamida 25 mM de DTT e 55 mm, tanto em bicarbonato de amónio 25 mM. Os pedaços de gel foram desidratados em bicarbonato de amónio 25 mM /50% de acetonitrilo e secou-se novamente. Eles foram, em seguida, re-hidratadas com 20 ng /mL de tripsina de grau de sequenciação (Promega) em 40 mM de bicarbonato de amónio /10% de acetonitrilo, tampo para evitar a secagem e digeridos durante a noite a 37

° C. Os péptidos foram extraídos por lavagem das peças em 0,1% de TFA. péptidos eluidos foram dessalinizadas usando C-18 ZipTips (Millipore) de acordo com as instruções do fabricante. Os péptidos foram em seguida misturados com matriz MALDI (Bruker) e analisados ​​utilizando Bruker Ultraflex em modo de ião positivo reflector com uma tolerância de EM /EM de 100 ppm. A análise foi realizada em casa usando Mascot, busca no banco de dados não redundante de mamíferos de 2012, permitindo modificações padrão pós-translacionais e até um faltado tripsina clivagem [17].

Purificação de microssomas

células LNCaP foram separadas em fracções nucleares e citoplasmáticos por douncing em solução hipotónica como previamente descrito [16]. Os microssomas foram purificada a partir de extracto citoplasmático por ultracentrifugação (100.000 x g durante 1 h a 4 ° C utilizando um rotor Beckman SW55Ti). Os microssomas foram ressuspensas em tampão de lise de SDS (SDS a 2%, DTT 1 mM, 125 mM de Tris pH 6,8) e sacudiu a 17000 x g durante 20 min. Citosol foi concentrado para 1/10 do seu volume original utilizando uma unidade de filtração centrífuga 10K de corte (Millipore) antes de SDS-PAGE.

imuno coloração

Um procedimento de coloração imuno-histoquímica padrão foi seguido. secções embebidas em parafina foram cortados em 4 uM e foram montadas em lâminas de 5-aminopropiltrietoxisilano (AAS) revestidos, que foram então deixadas a secar durante a noite. As secções embebidas em parafina foram desparafinados em xileno e foram tratadas com aquecimento em microondas a 60 ° C durante 20 minutos num tampão de citrato (2,1 g /1000 ml; pH 6,0) para a recuperação de antigénio. Após o bloqueio da peroxidase endógena, a lavagem em solução salina tamponada com fosfato (PBS) e o bloqueio da ligação não específica do anticorpo secundário com soro de suíno normal, foi aplicada a imunocoloração de estreptavidina-biotina-peroxidase de rotina com diaminobenzidina. As secções foram incubadas durante a noite em BMCC1 Ab-3. O anticorpo primário foi substituído com PBS nas secções utilizados como controlos negativos. As secções foram contra-coradas com hematoxilina de Harris. Desde BMCC1 é conhecido por ser positivo em tecidos prostática benigna, um núcleo de tecido da próstata com hiperplasia benigna foi incluído como um controlo positivo em cada um dos matriz.

Pontuação da expressão da proteína BMCC1 dentro das células dos tecidos dos 74 pacientes estudados, baseou-se na percentagem de células coradas com o anticorpo policlonal BMCC1 e a intensidade da mancha no interior das células. intensidade da coloração foi marcado na seguinte escala: Sem coloração, leve, moderada e forte. Todas as amostras foram analisadas em análise microscópica utilizando um microscópio Olympus. (Modelo: BX40), com uma ampliação de x200

imunofluorescência e microscopia

As células foram semeadas em lamelas estéreis, pelo menos, 24 horas antes fixação. O meio foi aspirado e as células foram lavadas uma vez em PBS antes da reticulação (em PBS com 10% foramlin durante 10 min à temperatura ambiente). O fixador foi removido e as células lavadas em PBS antes da permeabilização e bloqueio em PBS com 0,05% de Triton-X100 e 5% de FBS. As células foram então coradas com entre 0,4 e 2 ng /mL dos anticorpos primários indicados à temperatura ambiente durante 2 h ou 4 ° C durante a noite. Espécies combinados IgG purificada foi utilizada como um controlo apropriado para o anticorpo reactividade cruzada /adsorção. Todos os anticorpos foram detectados utilizando anticorpos secundários de burro 594 Alexafluor488 ou AlexaFluor adequadas. A microscopia confocal foi realizada num Zeiss LSM710. Co-localização foi quantificada utilizando software Zen 2011. Sobreposição coeficiente /coeficiente de sobreposição depois de Manders, um método insensível a diferenças na intensidade do sinal, foi utilizada para quantificar a co-localização em pares de imagens.

Transferrina absorção

LNCaP foram semeadas em lamelas estéreis antes 24h a rotulagem. absorção de pulse-chase de um complexo receptor de transferrina conjugada (Tf-R) foi realizada essencialmente como descrito por Aschenbrenner et ai. [18]. Resumidamente, as células foram privadas de soro em meio isento de soro (DMEM-F12 livre de vermelho de fenol, Life Technologies) durante 2 h a 37 ° C. À superfície de células de etiqueta com transferrina conjugado, as células foram colocadas em gelo durante 30 min, em seguida, incubadas com 20 ug /ml de transferrina AlexaFluor-594 conjugado (Molecular Probes) diluída em meio livre de soro arrefecido em gelo durante 30 min. As células foram lavadas duas vezes com meio livre de soro arrefecido com gelo para remover a transferrina não ligada e t = 0 lamelas foram colhidas para BMCC1 imunofluorescência, conforme descrito. As lamelas restantes foram perseguidos em meio isento de soro pré-aquecido para os períodos de tempo indicados antes da colheita. A absorção do complexo transferrina-receptor conjugado também foi realizada utilizando um método semelhante ao Boucrot et ai. [19]. As células foram lavadas uma vez com DMEM-F12 /FCS a 5%, em seguida, incubadas durante 10 minutos com 10 uM-594 AlexaFluor transferrina conjugada em DMEM-F12 /FCS a 5%. As células foram então lavadas com PBS gelado antes de ser colhida para imunofluorescência.

Resultados

proteína BMCC1-1 é expressa em determinados cancros

hBMCC1

é um grande e complexo unidade de transcrição, com o biomarcador de câncer de próstata de rotina usado

hPCA3

incorporado em

BMCC1

intron 6.

BMCC1

foi previamente anotado como discreta

PRUNE2 Comprar e

BNIP

genes flanqueando

PCA3

, com estudos baseados expressão exógena refletem isso. Resultados recentes mostraram que

BMCC1

produz uma transcrição (denotado BMCC1-1) que se estende entre os anti-sentido incorporado

PCA3

gene de [5,8]. Aqui demonstramos que o ARN BMCC1-1 é expressa em amostras de tecido de cancro da próstata positiva 10/10 (Figura PCA3 S1).

Nós mostramos anteriormente que a linha celular de cancro da próstata LNCaP expressa níveis elevados de ambos BMCC1- 1 e ARN de PCA3 [5]. Para estender o estudo a proteína endógena BMCC1, geramos vários anticorpos policlonais utilizando fragmentos expressos de forma recombinante de BMCC1 como antígenos (esquemáticos na Figura S2, clonagem de primers na Tabela S1). Estes anticorpos foram utilizados para demonstrar que

BMCC1

produz a 300 kDa em células LNCaP (Figura 1). O tamanho desta proteína que corresponde à prevista a partir dos CDs BMCC1-1 e traduzido sequência peptídica (

ie

3088 aminoácidos, ~ 340 kDa). A proteína de 340 kDa foi detectada com BMCC1 ambos C-terminal de Ab-1 (criado contra aminoácidos 2345-2705) e N-terminal de Ab-3 (criado contra aminoácidos 1-369) em células LNCaP. A expressão dessa proteína não foi detectada na próstata PCA3 negativo linhas de células de cancro PC3, DU145, alva, RWPE-I (Figura 1A). expressão BMCC1 também estava ausente da linha de células de cancro da mama PCA3 negativo MCF7. BMCC1 não foi detectada em células normais como já relatados anteriormente [5]. A identidade da banda de 340 kDa foi confirmada por imunoprecipitação de extractos de BMCC1 de LNCaP utilizando Ab-3, seguido por detecção de Western blot com Ab-2 (criado contra aminoácidos 222-276) (Figura 1B). A especificidade da detecção BMCC1 foi ainda confirmada pela depleção de expressão transiente BMCC1 por siRNA e detecção com anticorpos múltiplos. BMCC1 siARN transfecção causou uma redução dramática na intensidade da banda de proteína de 340 kDa detectado por ambos os anticorpos C- e N-terminal de Ab-1 e Ab-3 (Figura 1C). Isto suporta os dados de imunoprecipitação para demonstrar de forma robusta que

BMCC1

é um gene que codifica, a produção de uma proteína de 340 kDa na linha celular LNCaP que expressam a proteína de PCA3. Não foi detectada expressão de bandas reactivas de siRNA anti-BMCC1 sensíveis a pesos moleculares mais baixos, indicando que a proteína BMCC1-1 é o produto do gene predominante em células de cancro da próstata (dados não mostrados). a expressão da proteína BMCC1 não foi detectada em várias linhas de células derivadas de neuroblastoma, carcinoma da mama e do ovário (dados não mostrados). BMCC1 proteína foi detectada em 3/5 linhas celulares de melanoma primário, e, em alguns casos, foi observado um dupleto (Figura S3). A identidade das bandas em linhas de células de melanoma foi demonstrada pela detecção de robustamente BMCC1 com anticorpos para diferentes regiões da proteína, Ab-1 e Ab-3. Isto indica que BMCC1 poderia ter um papel em outros tipos de tumores.

. BMCC1 imunotransferência de extractos celulares totais. 30? G de lisado por linha celular foi submetida a 5% de SDS-PAGE. BMCC1 expressão foi detectada utilizando um anticorpos de coelho produzidos contra a AA 2345-2705 (C-terminal, de coelho anti BMCC1, Ab-1) e um segundo anticorpo, Ab-3, que reconhece a extremidade N-terminal de BMCC1. ADN PKcs foi utilizado como um controlo de carga.

B. A imunoprecipitação de BMCC1 de lisado total de LNCaP. BMCC1 foi imunoprecipitado por incubação de 1 mg de lisado de LNCaP com 1 ug de Ab-3 durante 8 h a 4 ° C, seguido por precipitação com proteína G de agarose. Não específica (NS) de IgG foi usada no lugar de Ab-3 em um IP de controlo. resina lavada foi eluida em SDS-PAGE e colocados a hibridar corante de carga ocidental. A cadeia pesada IgG (carregamento) demonstra entrada igual anticorpo.

C. Esgotamento de expressão BMCC1 por siRNA. As células LNCaP foram transfectadas com ARNsi BMCC1 1730 (siBMCC1) ou ARNsi de controlo (siControl). lisado total foi colhido 3 dias após a transfecção e expressão BMCC1 analisados ​​por western blotting com BMCC1 Ab-1 (C-terminal) e Ab-3 (N-terminal). A mancha foi completamente despido entre as sondas sequenciais. RNA polimerase II é um controle de carga.

Machida et al. [7] e Li et ai. [12] utilizado

in situ

hibridação de embriões de camundongos para mostrar que BMCC1 RNA é expressa predominantemente no tecido neuronal, e Zhou et al. [20] utilizando a PCR de ARN de tecido de rato para demonstrar que pelo menos o domínio BCH é expresso numa variedade de tipos de tecidos. Iwama et ai. [8] utilizado iniciadores de PCR abrangendo todo o gene para demonstrar forte expressão no gânglio da raiz dorsal com expressão intermediário em todo o cérebro, a espinal medula, da próstata e do útero e baixa expressão em outros tecidos. Para resolver esta discrepância de constitutiva contra expressão do RNA restrita, e para obter informações adicionais sobre a expressão de proteínas e produtos de genes emendados putativos, nós imunologicamente lisados ​​de proteínas a partir de um painel de tecidos de ratinho adulto usando BMCC1 Ab-4. Neste cenário não-cancerígeno que detectou uma forte ~ 80 kDa banda em tecidos cerebrais, com menor expressão de um menor de 72 kDa banda (Figura S4). O BMCC1s 52 kDa identificado por Arama et ai. [11] não foi observada aqui, porque o antigénio para o Ab-4 abrange os aminoácidos 2192-2433 de BMCC1-1 e não contém qualquer porção de BMCC1s (ver Figura S2). Para confirmar a expressão de BMCC1 em um ambiente do tumor do cancro da próstata, a coloração imuno-histológica dos tecidos de cancro da próstata foi realizada utilizando Ab-3. coloração BMCC1 mínima foi observada na hiperplasia benigna da próstata epitélio glandular e estroma, com coloração mais forte observado no epitélio glandular de tumores de próstata (Figura S5).

BMCC1 interage com AP-2 em células cancerosas da próstata

a fim de ter uma visão sobre a função celular de BMCC1, interagindo proteínas foram identificadas por purificação com resinas de afinidade BMCC1-GST. Geramos uma série de clones de sobreposição BMCC1-GST em pGEX que cobrem o ADNc de comprimento completo (Tabela S1). As proteínas recombinantes foram expressos e reticulada a glutationa agarose para gerar uma série de matricies afinidade para proteínas que interagem. resinas de fusão GST-BMCC1 reticuladas foram incubadas com lisado total de LNCaP para purificar interagentes BMCC1. proteínas associadas resina foram eluídos, resolvidos e visualizados por prata SDS-PAGE corado. BMCC1 GST fragmentos 1-2 e 4-10 puxado para baixo uma série de proteínas frequentemente identificados como interagentes não específicas ou não-funcionais. Estes incluem eEF1γ, 40S proteína ribossómica, Grp75 e GRP78 (dados não mostrados). BMCC1 GST F3 (aminoácidos 575-904) precipitou bandas específicas de 50 kDa e 110 kDa (Figura 2A). A 50 kDa e 110 kDa que interagem bandas foram excisadas e identificado por espectrometria de massa (MALDI MS /MS num espectrómetro Bruker Ultraflex III). Um resumo dos dados de busca Mascot é mostrada na Tabela S2. Este revelou que BMCC1-F3 interage com vários membros do adaptador Complexo Relacionado com a proteína 2 (AP-2). O complexo AP-2 é um heterotetrâmero associada endossoma que consiste em três componentes diferentes constitutivas (AP-2S1, AP-2M1 e PA-2B1 /β-adaptina) e um dos dois componentes mutuamente exclusivos (AP-2A1 ou AP-2A2) [ ,,,0],21]. A proteína de 50 kDa interagindo BMCC1-F3 foi identificado como AP-2M1, com base em duas identificações separados com um total de 8 péptidos não redundantes (Tabela S2). A banda de 110 kDa interagindo BMCC1 continha uma mistura de três de elevado peso molecular AP-2 membros do complexo AP-: 2A1, 2A2-PA e PA-2B1 (Tabela S2). PA-2B1 foi identificado em duas amostras com um total de 5 péptidos únicas. A homologia entre AP-2A1 e AP-2A2 faz indivíduo único identificações complexa (Figura S6). AP-2A1 foi identificada em 3 amostras com um total de 6 péptidos que não correspondem a AP-2A2. AP-2A2 foi identificado em uma amostra com um peptídeo não são atribuíveis a AP-2A1. Nestas amostras, três péptidos individuais pode ter correspondido a qualquer AP-2A1 ou 2A2-AP e não pode ser atribuído com certeza a uma ou a outra, devido à identidade de sequência (Tabela S3). Nenhuma computacionalmente domínios identificáveis ​​poderia ser atribuído a esta região, mapeamento de interacção de modo funcional de BMCC1 identificou um motivo de interacção proteína-proteína nova. A interacção entre BMCC1 e o complexo AP-2 foi confirmada por co-imunoprecipitação. BMCC1 foi imunoprecipitada a partir de lisados ​​de LNCaP e as proteínas que interagem resultantes foram eluídas e analisadas por transferência de Western (Figura 2B) revelando que BMCC1 endógena interage com β-adaptina e AP-2A1 /2 (Figura 2B). A interação entre endógena BMCC1 e do complexo AP-2 foi secundado por BMCC1 imunoprecipitação de lisados ​​de células que tinham sido BMCC1 empobrecido com siRNA. Uma banda de 340 kDa foi detectada no peso molecular elevado resolver gel corado com Coomassie (Figura 2C). Esta banda era de intensidade reduzida no imunoprecipitado a partir de células BMCC1 empobrecido em comparação com as células de controlo de ARNip. Embora imunoprecipitação não é uma abordagem quantitativa, isto reduziu seleção de banda intensidade guiada para análise MS subsequente. A identificação desta banda como BMCC1 foi confirmada por MALDI-TOF /TOF de péptidos trípticos a partir da fatia de gel excisado. Importantemente, o péptido BMCC1 extremo N-terminal TEFNYFTETR, não presente na isoforma truncada (BMCC1-3) relatado por Machida et ai. [7] foi identificado entre eles (Tabela S4). Isto proporcionou

de novo

evidência de expressão da proteína BMCC1-1 em células LNCaP. O perfil de interacção de BMCC1 foi analisada por Western blotting estes imunoprecipitados para AP-2A1 /2 e β-adaptina. sinais consistentes com a redução do nível de proteína BMCC1 na immunoprecipate siBMCC1, reduzidas para AP-2A1 /2 e β-adaptina foram detectados no precipitado de siBMCC1 lisado de lisado de controle. Isto forneceu mais evidência de que estas proteínas interagem especificamente com BMCC1 (Figura 2C).