Abstract

O desenvolvimento do câncer envolve predisposição genética e uma variedade de exposições ambientais. de todo o genoma análises fornecem evidência para a ligação significativa de muitas doenças para loci de susceptibilidade no cromossoma 8p23, o local do grupo de genes defensina humana. Humanos beta-defensinas (hBDs) são moléculas importantes da imunidade inata. Este estudo foi desenhado para analisar a expressão e variações genéticas em hBDs (HBD-1, HBD-2, HBD-3 e HBD-4) e sua associação putativa com câncer de cólon. a expressão do gene hBD e expressão da proteína em relação foram avaliadas por Real-Time PCR (qPCR) e imuno-histoquímica, respectivamente, de 40 pacientes normais e 40 pacientes da mesma idade com câncer de cólon na Arábia Saudita. Além disso, os polimorfismos HBD foram genotipados por sequenciação exão e por metilação do promotor. hBD-1, hBD-2, 3-hBD e hBD-4 basal de expressão do RNA mensageiro foi significativamente menor em tecidos tumorais em comparação com tecidos normais. Várias mutações de inserção foram detectados em diferentes exões do hBDs analisados. No entanto, nenhuma metilação em quaisquer promotores hBDs foi detectada por causa do número limitado de ilhas CpG nestas regiões. Nós demonstramos pela primeira vez que uma ligação entre a expressão hBD e cancro do cólon. Isto sugere que existe uma relação significativa entre a desregulamentação imunidade inata através da ruptura de peptídeos catiônicos (hBDs) e as possibilidades de desenvolvimento de câncer de cólon

Citation:. Semlali A, Al Amri A, Azzi A, Al Shahrani O, Arafah H, Kohailan M, et al. (2015) Expressão e New Exon Mutações do Beta defensinas humanas e sua associação para o Desenvolvimento cancro do cólon. PLoS ONE 10 (6): e0126868. doi: 10.1371 /journal.pone.0126868

Editor do Academic: Isabelle A. Chemin, CRCL-INSERM, França |

Recebido: 25 de julho de 2014; Aceito: 08 de abril de 2015; Publicação: 03 de junho de 2015

Direitos de autor: © 2015 Semlali et al. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Licença Creative Commons Attribution, que permite uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o autor original ea fonte sejam creditados

Disponibilidade de dados: Todos os dados relevantes estão dentro do papel e seus arquivos de suporte de informação

Financiamento:. os autores estender seu agradecimento ao Decanato de pesquisa Científica na Universidade king Saud para financiar o trabalho através do projeto grupo de pesquisa Não: RGP-VPP-260 e por uma subvenção do Fonds Émile-Beaulieu (Fundação Laval University)

Conflito de interesses:.. os autores declararam que não existem interesses conflitantes

Introdução

o câncer colorretal ( CRC) é o terceiro câncer mais comumente diagnosticado entre os homens eo quarto mais comum entre as mulheres em todo o mundo [1]. A American Cancer Society estima que haverá mais de 96.000 novos casos de câncer de cólon levando a aproximadamente 50.000 mortes em 2014 (American Cancer Society 2014). No Reino da Arábia Saudita (KSA), cancro do cólon é uma das doenças mais frequentes [2], com uma idade mediana de 60 anos para homens e 58 anos para as mulheres [3]. desenvolvimento de câncer tem sido relatado para envolver fatores genéticos [4] e também uma variedade de exposições ambientais [5]. susceptibilidade genética ao câncer é multifatorial, incluindo alterações somáticas genéticos, tais como mutações em oncogenes ou genes supressores de tumor [6], e mudanças no gene profiling expressão ou metilação do DNA. Gene expressão profiling ofereceu uma nova maneira de classificar os tumores humanos [7]. Com base nos níveis de expressão de ARNm de genes específicos, diferentes subtipos de cancro podem ser identificadas. A metilação do DNA é o marcador mais amplamente estudado epigenética [8]. ADN-hipermetilação induzida silenciamento do gene é um evento comum em muitas malignidades, que serve como um mecanismo alternativo para a mutação genética para afectar a perda das funções supressoras de tumor [9,10]. A descoberta de hipometilação de DNA global em tumores humanos foi seguido pela identificação de genes supressores de tumores hipermetilado, e recentemente, a inactivação de microARN (miARN) por metilação do DNA também tem sido descrita [11,12]. Esta forma de mudança epigenética pode contribuir para a iniciação e progressão tumoral através de silenciamento transcricional de genes supressores de tumores. De facto, vários genes foram mostrados para ser inactivada epigeneticamente ina vasta gama de tumores [13]; Assim, o conceito de um “perfil de hipermetilação ‘de tumores podem ter aplicações clínicas potenciais [14-16]. genes hypermethylated podem incluir aqueles envolvidos na regulação do ciclo celular (p16INK4a, p15, Rb) [17], o reparo do DNA (BRCA1, MGMT), resistência (MGMT), diferenciação celular, a angiogénese (THBS1) e metástase [13]. No entanto, pouca informação existe sobre o papel da desregulamentação dos genes da imunidade inata e sua associação plausível com câncer de cólon. Além disso, as evidências para o papel do sistema imune natural para a protecção contra o desenvolvimento do tumor foi demonstrada por estudos envolvendo pacientes imunocomprometidos [18]. É bem documentado que uma resposta imune fraco tem uma correlação direta e inversa com muitos tipos de câncer [19,20]. Todas as células do corpo humano tem várias linhas de defesa contra a transformação celular, e o sistema imunológico humano é uma rede excelente e bem coordenada de células, órgãos e glândulas que protege o corpo contra desregulações fisiológicas inadequado. Um sistema imunológico otimizado é a chave para uma boa saúde e longevidade. Além disso, a resposta imune inata tem especificidade considerável contra padrões moleculares conservadas dos componentes de microrganismos, que são chamados padrões moleculares associados a agentes patogénicos (PAMPs). Os receptores das células imunitárias que reconhecem MMAPs são chamados receptores de reconhecimento de padrões (SRRS). receptores Toll-like (TLRs) constituem uma importante classe de PRRs, e cada TLR reconhece um PAMP diferente [21-23]. A activação de uma resposta imune inata prossegue embora a ligação a receptores de reconhecimento de padrões, tais como TLRs. Estes TLRs são sensores chave de patógenos invasores, em grande parte ativados por atores da imunidade inata, como células epiteliais [23]. A cascata de sinalização dos TLR pode envolver a activação da molécula adaptadora MyD88, e ambas as cascatas levar à activação de NF-kB para promover a transcrição de citocinas pró-inflamatórias, quimioquinas e peptídeos catiônicos também conhecidos como beta-defensinas humanas (hBDs). Estes hBDs pertencem a uma família de péptidos antimicrobianos que constituem uma parte importante da defesa imunitária inata. Até à data, quatro hBDs (1-4) foram identificadas em tecidos humanos. hBD-1 é constitutivamente produzido por vários tecidos epiteliais, tais como o tracto respiratório e da pele [24], ao passo que as expressões de hBDs são indutíveis [25]. Especificamente, hBD-2 é altamente expressa nas células epiteliais normais após contacto com microorganismos ou citocina (TNF- e IL-1) A estimulação [26,27].

A estrutura genómica é composto por dois exões e um intrão. O primeiro exão codifica o péptido de sinal, e o segundo codifica um péptido maduro precedido por um curto aniónico pró-péptido. O péptido maduro é obtida após a clivagem proteolitica da sequência de sinal. Apesar das semelhanças baixos de sequência entre estas proteínas, suas estruturas 3D tem uma dobra topológica-defensina como semelhante que consiste em três cordões dispostos em três folhas de anti-paralelos limitados por três pontes de dissulfureto intra-moleculares [28,29]. Os beta-defensinas tem um conjunto de resíduos catiónicos (Lys, Arg), perto da carboxilo dos péptidos. Os aminoácidos carregados positivamente no terminal C desempenham um papel determinante na actividade antimicrobiana [30,29]. A carga e hidrofóbicas propriedades líquidas positivas promover hBDs interação com membranas microbianas. hBDs exercer ação antimicrobiana direta e são ativos contra bactérias, fungos e vírus; em paralelo, de acordo com dados recentes, possuem múltiplas actividades biológicas, em particular, os imuno-moduladores [29], e estão implicados na resposta anti-tumoral.

O objetivo deste estudo foi investigar a desregulamentação do perfil hBDs expressão do gene, as mutações de exão hBDs, e metilação do promotor de hBDs, bem como a associação desses achados com a promoção do cancro do cólon em humanos. Do ponto de vista clínico, as proteínas que estão envolvidos nestas vias podem servir como alvos para a terapia do cancro, através do uso potencial de hBD /TLR-imunoterapia.

Resultados

Os dados clínicos de pacientes diagnosticado com cancro do cólon através de colonoscopia

As características clínicas dos 40 pacientes sauditas, incluindo a idade, nacionalidade, história familiar, tabagismo, estágio do câncer de cólon, medicamentos e presença de outras doenças, foram coletadas e comparadas entre o cancro do cólon e controlar pacientes. A população incluída inclui não-fumantes sem história familiar de câncer de cólon e sem alergias. A idade população do estudo variou entre 45 e 75 anos, com uma média de 60 ± 16,56 anos para os homens e 55 ± 13,74 anos para as mulheres (Tabela 1). Também é interessante notar que um elevado número de participantes que sofrem de câncer de cólon não foram submetidos a quimioterapia ou radioterapia.

expressão do gene hBD diferencial em tecidos de câncer de cólon

Para analisar o expressão dos diferentes hBDs (1-4) ao nível do ARNm, inverter quantitativo em tempo real de transcrição-PCR foi realizada utilizando tecidos de cancro do cólon e tecidos normais isoladas a partir do mesmo paciente. Como mostrado na figura 1, os níveis de todos os hBDs expressão foram diminuídos em tecidos de cancro em comparação com tecidos normais. Especificamente, os níveis de hBD-1 diminuiu significativamente (p 0,0001) de 0,99 ± 0,02 nos tecidos normais para 0,29 ± 0,14 nos tecidos de cancro (Fig 1A). hBD-2 níveis diminuiu de 1,03 ± 0,08 nos controlos para 0,36 ± 0,18 nos tecidos de cancro, com p 0,0001 (Figura 1B). hBD-3 diminuiu de 1,11 ± 0,11 no tecido de controlo para 0,48 ± 0,09 nos tecidos de cancro (Fig 1C), e hBD-4 diminuiu de 0,99 ± 0,03 em tecidos de controlo para 0,46 ± 0,10 nos tecidos de cancro (Fig 1D) .

o ARN celular total recém-extraído de tecidos normais e do cancro do cólon foi transcrito reversamente em cDNA e, em seguida, usado para medir a expressão de mRNA hBD (Panel1A a 1D).

comparação entre imuno-histoquímica diferentes peptídeos antimicrobianos

Para confirmar os dados de expressão de mRNA, determinou-se a expressão da proteína hBDs por imuno-histoquímica. Como mostrado na Fig 2A, imuno-coloração positiva para os hBDs foi geralmente observada em células epiteliais do cólon normais, e também em algumas células do estroma. No entanto, a intensidade de coloração para todos os hBDs foi menor nos tecidos tumorais de adenocarcinoma do cólon. De modo a determinar quantitativamente a expressão diferencial de hBDs em tecidos de cancro de cólon em comparação com tecidos normais, contadas as células positivas e determinado um nível de expressão arbitrária, tal como apresentado na Figura 2B a 2D. Estes resultados confirmaram os baixos níveis de hBDs em tecidos de cancro em comparação com tecidos normais. O baixo nível observado de proteínas HBD confirma o achado de baixos níveis de expressão do gene hBD.

Os tecidos foram marcadas usando anticorpos específicos (HBD Painel 2A). hBD- células positivas nos tecidos foram estimadas da seguinte forma: 0 pontos, sem cor positiva; 1 ponto, coloração positiva de 20%; 2 pontos, coloração positiva 21-50%; 3 pontos, coloração positiva 51-75%; e 4 pontos, 75% coloração positiva. Isto é apresentado no Painel B.

A prevalência de mutações de exão HBD em pacientes com câncer de cólon

Para investigar a associação de mutações HBD e sua expressão mais baixa em pacientes com câncer de cólon, a sequenciação exão para todos hBDs foi analisada. O

de novo

taxa de mutação de hBDs foi estimado na Tabela 2, para o HBD-1; três mutações foram detectados no exão 1 (dois na região 5’UTR antes da sequência traduzida e uma no promotor). Estas mutações não afecta a estrutura da proteína, mas pode influenciar a expressão e estabilidade de ARNm. Duas outras mutações de inserção foram detectados na região traduzida do exão 2, que conduziu a uma proteína imatura. Nós também encontrou cinco mutações na região 3 ‘não traduzida (3’UTR). A 3’UTR é conhecido por conter elementos reguladores que são essenciais para a expressão de vários genes apropriado. Detectaram-se dois tipos de mutações: 8 (80%) eram inserções e duas (20%) estavam transições. Tal como indicado na Tabela 2, o mesmo paciente pode conter uma ou mais mutações na região hBD1 (exemplo T17 = número do cancro do cólon do paciente 17 teve 3 diferentes mutações do gene hBD-1). A mutação de transição na 3’UTR do gene hBD-1 não está associado com o cancro do cólon, mas em vez disso é ligada à população Arábia, como foi encontrado em todos os participantes normais e cancerosas excepto num caso (T4).

em hBD-2, quatro mutações no total foram detectados em tecidos de câncer de cólon, mas não em tecidos normais: três no promotor (mutação uma transição, e duas mutações de inserção), sem mutações nas sequências traduzidas para exão 1 e o exão 2, e duas mutações na região de transição da 3’UTR (uma transição no 3’UTR não está associado com o cancro do cólon, mas com a população Arábia). Em hBD-2, foram detectadas três tipos de mutações: 1 (20%) era uma transversão, 2 (20%) era uma inserção e três (60%) eram mutações de transição. Todas as mutações detectadas no HBD-2 não têm consequências sobre a estrutura da proteína, mas pode afetar HBD-2 expressão e estabilidade genética. Em hBD-3, todas as mutações (100%) foram detectadas mutações de inserção (Tabela 2): uma inserção foi detectado na região de 5 ‘UTR, uma inserção foi encontrado na sequência traduzida do exão 1, induzindo uma variação de sequência completa a partir de resíduo 4, bem como três outras mutações na região traduzida do exão 2 (um desses inserções foi perto do codão de paragem), e três inserções foram detectados na região 3 ‘UTR do gene hBD-3. Inserções 7 e 8 foram específicos para a população saudita e não foram associados com o cancro do cólon; todos os tumores e todos os tecidos normais apresentou estas mutações (Tabela 2). Em hBD-4, três mutações foram detectados no total: um no 5’UTR que não afectam a estrutura da proteína HBD-4 e dois no exão 2 que gerar uma sequência incompleta, com mudança sequência completa começando nos resíduos 22 e 56. Dois tipos de mutações foram detectadas em hBD-4: 1 (30%) era uma transição e 2 (60%) eram inserções (Tabela 2). No entanto, não metilação em quaisquer promotores hBDs foi detectado por causa do número limitado de ilhas CpG nessas regiões.

Estrutura-Function Analysis

Examinamos o produto do gene de cada exão afectada por uma mutação de mudança como uma consequência das inserções de nucleótidos observados. As traduções de sequências resultantes para cada hBD com produtos exão afectados são ilustradas nas Figs 3 e 4. As duas inserções no exão 2 de hBD-1, como relatado na Tabela 2, faz com que mutações de deslocamento de quadro-depois da sequência de sinal de peptídeo (Fig 3A) . Consequentemente, nenhuma proteína hBD1 madura pode ser sintetizado. Sem a inserção foi encontrado no exão 2 no gene hBD-2 humano (Figuras 3B e 4B). Cinco inserções foram encontrados no gene hBD-3 no cancro do cólon. 1 de inserção resulta numa mutação de deslocamento de resíduo 3 na sequência de sinal de peptídeo, sem madura síntese hBD-3 (Figura 3C). A inserção 2 causa uma mutação frame-deslocamento que afecta 5 de 6 resíduos de C-terminal, C63 → L, R64 → P, K e R65 → K66 → E (Fig 3C). Além disso, uma isoleucina inserido encontra-se na sequência da BDH-3 mutado na extremidade C-terminal (Fig 3C). Para avaliar, a consequência da mutação sobre a estrutura de hBD-3, foi construído um modelo molecular hBD-3 com as mutações que afectam a extremidade C-terminal. A Fig 4C e 4D, ilustra as posições das mutações em um modelo tridimensional de hBD-3 em comparação com a proteína do tipo selvagem. Como mostrado na Fig 4C e 4D, em tecido de cancro, 2 mutante está em falta a terceira ponte de dissulfureto Cys63-Cys45 devido à mutação Cys63 → Leu. Prevemos que este mutante tem uma estrutura menos estável do que a da proteína de tipo selvagem. S3 tabela lista os efeitos das outras mutações. Calculamos as previsões de estabilidade da proteína sobre a estrutura molecular de HBD-3, utilizando tanto a música pop [31] e CUPSAT [32] programas. Fig 3C e Fig 4C e 4D lista os tipos de mutação frame-deslocamento observadas e os estabilizadores /efeitos desestabilizadores correspondentes sobre a estrutura HBD-3. Mutações Cys63 → Leu e Arg64 → Pro afetar aminoácidos que são enterrados na estrutura e estavam determinados a ser energeticamente desestabilizador, sugerindo uma redução da estabilidade da proteína. Mutações Arg66 → Lys e Lys67 → Pro afetar solvente resíduos expostos e estavam determinados a ser energeticamente estabilização (Tabela 3). A inserção 3 no exão 2 produzido Lys67 → Glu e o resíduo I68 adicional, que não têm nenhum efeito sobre a estabilidade da estrutura. Inserção 4-2 produziria uma proteína com uma leucina adicional C-terminal (Fig 3C).

As mutações são destacadas em vermelho para cada gene hBDs.

em relação hBD-4, uma inserção pode causar mutações de deslocamento de quadro a partir de dois resíduos após a sequência de péptido de sinal, resultando na inibição da síntese de proteínas hBD-4 madura. Inserção 2 introduz uma mutação frame-deslocamento a partir de resíduo de 55 a 63, produzindo uma HBD-4 proteína mutante truncado

Discussão

O cancro do cólon é um risco significativo para a saúde pública; verificou-se ser a segunda neoplasia mais comum na população Arábia [33] e ficou em segundo lugar nas taxas de morte por câncer nos Estados Unidos [34]. Muitos mecanismos genéticos e epigenéticos foram determinados a contribuir para o cancro do cólon, incluindo CpG hipermetilação, alterações de RNA não-codificantes, mutações somáticas e acetilação da lisina das histonas [35]. Muito poucos estudos têm-se centrado sobre as modificações epigenéticas responsáveis ​​pelo desenvolvimento da doença. No presente estudo, nós demonstramos pela primeira vez uma ligação clara entre hBD expressão /produção e câncer de cólon. Os nossos dados demonstram uma redução significativa da hBDs em tecidos de cancro em comparação com tecidos normais. Estes dados estão de acordo os anteriormente relatados com câncer de HBD-1 pol renal ou da próstata [36-38] e também em carcinoma de células escamosas oral (CCEO) [39,40]. Curiosamente, dados semelhantes foram relatados com HBD-2, mostrando que HBD-2 mRNA e expressão da proteína foram significativamente menores em câncer da glândula salivar [41]. Outros estudos utilizando linhas de células de cancro diferentes também têm demonstrado que hBD-2 pode controlar o crescimento celular por meio de detenção da transição G1 /S e activação de pRb em células epiteliais malignas [42]. hBD-3 é conhecida por suprimir a migração de células de cancro [43]. No carcinoma de células escamosas oral, efeitos opostos-defensina beta 1, 2 e 3 apresentam humanos sobre a proliferação celular. Portanto, hBD-1 poderia ser definido como um gene supressor de tumor, enquanto HBD-2 e -3 pode ser proto-oncogenes [44].

É esperado que a desregulação da expressão do gene a afectar de 1-3% transcriptoma [45], incluindo genes da imunidade inata cuja expressão é predominantemente regulada para baixo em tecidos de câncer. A metilação do DNA das regiões promotoras ricos em CpG está a ganhar reconhecimento como um mecanismo-chave na inactivação dos mesmos genes implicados como genes supressores de tumores e de imunidade inata em células cancerosas [46]. Outro mecanismo para a inactivação do gene é mutações somáticas. Teses mutações contribuem para a formação do câncer. A hipótese foi de que a infra-regulação da expressão do gene hBD em tecidos de cancro do cólon pode ser devido à presença de modificações epigenética, particularmente mutações nos exões HBD. Em vez disso, não houve metilação detectável em todas as hBDs promotores de tecidos normais do cólon e do cancro do cólon câncer (dados não mostrados). Isto pode ser devido ao reduzido número de ilhas CpG em promotores HBD. Nós confirmamos que, em pacientes com uma mutação frame-shift, a proteína HBDs foram completamente ausente. O crescente interesse em defensinas beta está constantemente melhorando nosso conhecimento sobre vários aspectos da sua localização e expressão gênica padrões e os fatores de transcrição envolvidos na sua regulação. A estrutura genómica hBD consiste em dois exões e um intrão. O primeiro exão codifica o péptido de sinal, e o segundo codifica um péptido maduro precedido por um curto aniónico pró-péptido. Além de ter dobrável semelhante de proteína e estrutura, as estruturas de hBD-1, -2, e -3 também revelaram que cada proteína é estabilizada por três pontes de dissulfureto entre cisteínas conservadas. Neste estudo, muitas novas mutações, inserções em geral, foram detectadas em diferentes exões (1/2). Estas mutações contribuir para mudanças significativas na estrutura da proteína de hBDs (isto é, hBD-1, hBD-3 e hBD-4). HBD-1 mutações e mutação 1 de HBD-3 são os mais prejudiciais porque levam a pré-proteínas truncadas sem previu a síntese de proteína HBD-1 maduro. hBD-3 proteína mutação 2 é grandemente desestabilizado por causa da ausência de uma ponte dissulfureto causada pela substituição da Cys63 → Leu. Além disso, no mesmo mutante, substituição Lys67 → Glu introduz um resíduo carregado negativamente, ácida numa secção do terminal C carregado positivamente, hidrofóbico. Como foi determinado que a agregação de cargas positivas na secção C-terminal é importante para a actividade antimicrobiana [47], a introdução de um resíduo carregado negativamente é predito para afectar a função da proteína. Ambos os HBD-4 mutantes são previstos para não ter nenhum peptídeo funcional devido a alterações na sequência da proteína. Nenhuma previsão da estrutura pode ser realizada por este mutante porque a sua estrutura não está disponível. As outras mutações encontradas na região do promotor de hBD são previstos para afectar a expressão /estabilidade das regiões reguladoras (5’UTR e 3’UTR) em tecidos de cancro do cólon, o que explica por que a expressão destes hBDs foram diminuídos em tecidos de cancro de cólon em comparação com os tecidos normais. Várias outras mutações foram detectadas em todas as intrões de hBDs, que existiam, quer principalmente em todos os tecidos na população Arábia (normal e de cancro) ou só foram encontrados em tecidos de pacientes com cancro do cólon (dados não mostrados). Estas mutações Intron pode ter um possível papel no câncer de cólon, e este achado requer uma investigação mais aprofundada. Porque hBDs desempenhar um papel activo no sistema imune inato, a presença de mutações de exão em hBDs pode levar à desregulação da imunidade inata e, posteriormente, dificultar a vigilância imunológica contra o desenvolvimento de câncer de cólon.

Materiais e Métodos

Geral reagentes

A escada RNA foi obtido a partir de tecnologias Ambion /Life (Burlington, ON, Canadá). kits de DNA /RNA foram da Qiagen (Hilden, Alemanha). Os iniciadores foram obtidos a partir de Life Technologies /Invitrogen (Burlington, ON, Canadá). Os ADNc de alta capacidade kit de transcrição reversa foi a partir de Applied Biosystems (Warrington, EUA). SYBR Green foi obtido a partir de Bio-Rad (Mississauga, ON, Canadá). HBD anticorpos foram adquiridos a partir de Santa Cruz Biotechnology, Inc. (Santa Cruz, CA, E.U.A.). hBD-1 (N-20) é anti-IgG de coelho para o terminal N, hBD-2 (C-17) é de cabra anti-IgG para o terminal N. hBD-3 (FL-67) é anti-IgG de coelho para o terminal N. hBD-4 (FL-72) é anti-IgG de coelho para o terminal N. O kit BACE mega por sequenciação foi obtida a partir de GE Healthcare Life Science (Buckinghamshire, Reino Unido), e o kit EpiTect bissulfito para a metilação do DNA foi obtida de Qiagen (Toronto, Canadá).

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foram coletadas amostras de 40 pacientes com diagnóstico de ter cancro do cólon (24 homens e 16 mulheres, entre 45 e 75 anos, com uma média de 60 ± 16,56 anos para os homens e 55 ± 13,74 anos para as mulheres e 40 controles normais da mesma idade nenhum caso de câncer. o estudo foi aprovado pelo Conselho da Comissão de Ética de revisão Institucional do Hospital Universitário king Khalid em Riade, número KSA 12/3352 /IRB. consentimento informado foi obtido de todos os participantes.

os tecidos normais em a margem distante do tumor foram coletadas no momento da endoscopia. o diagnóstico de câncer foi baseada no padrão clínicos, endoscópicos, radiológicos e critérios histológicos. clínica e características demográficas foram registrados, incluindo a idade no momento do diagnóstico, sexo, história familiar, tabagismo hábitos, comportamentos doença, localização da doença, e a necessidade de cirurgia (Tabela 1). As amostras de tecido foram utilizados para extração de RNA, imuno-histoquímica, e extrações de DNA genómico.

As amostras de tecido a ser usado para análise de RNA foram imediatamente submerso em RNA depois solução (Ambion, Courtabeuf, França).

isolamento de ARN, transcrição reversa e a expressão do gene por em tempo real de RT-PCR

ARN total foi extraído do tecido utilizando o ADN /ARN Mini kit (Qiagen, Hilden, Alemanha). A concentração, pureza e qualidade do RNA isolado foram todos determinados utilizando o sistema Bio-analisador Agilent 2100 e um kit de análise Agilent RNA pequeno de acordo com as instruções fornecidas pelo fabricante (tecnologias de Agilent, Waldbronn, Alemanha).

O ARN (1 ug de cada amostra) foi transcrito de modo reverso em cDNA usando um cDNA de alta capacidade kit de transcrição reversa (Applied Biosystems, Warrington, USA). As condições para a preparação dos modelos de ADNc para análise de PCR foram de 10 min a 25 ° C, 2 h a 37 ° C e 5 min a 85 ° C. PCR quantitativa (qPCR) foi realizada como previamente descrito [48-50]. Os valores dos transcritos de mRNA foram medidos usando o Fast-tempo real, sistema de detecção de PCR Applied Biosystems 7500. As reacções foram realizadas utilizando um verde PCR Supermix Sybr da Applied Biosystems. Os iniciadores foram adicionados à mistura da reacção a uma concentração final de 250 nM. Cinco microlitros de cada amostra de ADNc foram adicionados a uma mistura de PCR contendo 20 ul de 12,5 ul de SYBR Green Supermix e 0,5 ul de iniciadores específicos (HBDs ou GAPDH (S1 Tabela)) e 7 ul de RNase /água isenta de ADNase. Cada reacção foi realizada num rápido 7500 PCR em tempo real Thermal Cycler. As condições de ciclos térmicos para as hBDs foram estabelecidos como 5 min a 95 ° C, seguido de 36 ciclos de 15 s a 95 ° C, 30 s a 63 ° C (excepto para HBD3 a 52 ° C), e 30 s a 72 ° C, com cada uma das reacções feitas em triplicado. A especificidade de cada par de iniciadores foi verificada pela presença de um único pico de temperatura de fusão. GAPDH produziram níveis de expressão uniformes variando de menos de 0,5 TCs entre condições de amostra e, por conseguinte, foi usado como um gene de referência para este estudo. Os produtos amplificados foram corridos num gel de agarose para confirmar que não havia produtos espúrios amplificados durante os ciclos. Os resultados foram analisados ​​utilizando a 2

-ΔΔCt (Livak) Método expressão relativa.

blocos Preparação de biópsias para imuno-histoquímica

Parafina embutido de tecido de câncer de cólon e tecido do cólon normal, espécimes foram cortados em secções de 3 mm de espessura. Os cortes foram montados em lâminas revestidas com soro fisiológico e incubada durante 15 a 20 minutos num forno de ar quente a 60 ° C. As secções de tecido foram desparaf inadas com EZ Prep (Ventana, Arizona, EUA) a 75 ° C, o calor de pré-tratadas em Cell Condicionamento 1 (CC1; Ventana, Arizona, EUA) utilizando um protocolo de “células condicionado padrão” para a recuperação de antigénio em 100 ° C, e, em seguida, incubou-se com uma gota de solução de inibidor, durante quatro minutos a 37 ° C e subsequentemente lavada. As lâminas foram incubadas durante 32 minutos a 37 ° C, com um dos seguintes anticorpos (diluído 1: 100): anti-humano-HBD-1, anti-humano-HBD-2, anti-humano-hBD-3 ou anti- humano-hBD-4 (Santa Cruz Biotechnology, CA, EUA). Em seguida, adicionou-se o anticorpo secundário Ultraview HRP universal multímero. O immunolocalizedhBD-1, hBD-2, 3-hBD e hBD-4 proteínas foram visualizados utilizando uma reacção de DAB-cobre melhorada. controlos negativos foram preparados em branco durante a coloração, em que o primeiro anticorpo foi omitido e substituído com PBS. As lâminas foram contra-coradas com hematoxilina II e Bluing Reagente (Ventana, Arizona, EUA) durante 30 min a 4 ° C, e, em seguida, o líquido lamela (LCS) foi adicionado como uma barreira entre os reagentes aquosas e o ar de evitar a evaporação, proporcionando assim estabilidade da amostra. Depois disso, as amostras para a montagem em DPX foram desidratados por lavagens sequenciais em álcoois graduados: 70% de etanol, 96% de etanol e de etanol absoluto e duas mudanças de xileno. Depois disso, nós adicionamos uma pequena gota de DPX ao modelo que montante mídia. As seções manchadas de imuno foram analisadas por um microscópio óptico Olympus BX51 e câmara digital DP72 Olympus (ampliação 200X e 400X) (Olympus America Inc, Center Valley, PA, EUA).

Scores foram dadas de acordo com o nível e a gama da cor como se segue: 0 pontos, sem cor positiva; 1 ponto, coloração positiva de 20%; 2 pontos, coloração positiva 21-50%; 3 pontos, coloração positiva 51-75%; e 4 pontos, . coloração positiva de 75%

tratamento com bissulfito

Para verificar o estado de metilação da região promotora tratamento e recuperação de amostras foram realizadas com o kit EpiTect Bissulfito bissulfito (QIAGEN) seguindo as instruções do fabricante. Resumidamente, 2 ug de ADN num volume de 20 uL foi utilizada para cada reacção e misturado com 85 ul mistura de bissulfito e 35 uL de ADN proteger tampão. conversão de bissulfito foi realizada num termociclador como se segue: 99 ° C durante 5 min, 60 ° C durante 25 min, 99 ° C durante 5 min, 60 ° C durante 85 min, 99 ° C durante 5 min, 60 ° C durante 175 min e 20 ° C indefinidamente. O ADN tratado com bissulfito-EpiTect foi recuperado por coluna de centrifugação e, subsequentemente, sequenciado para confirmar a eficiência de conversão de bissulfito. O ADN genómico foi eluído utilizado para amplificação da região do promotor e sequenciação.

reacção em cadeia da polimerase e sequenciação

O ADN genómico foi extraído a partir de todas as amostras de ADN utilizando um kit da Qiagen (Hilden, Alemanha). A concentração de DNA de cada amostra foi medida usando um espectrofotómetro NanoVue ultravioleta. Todos os exons dos hBDs (1, 2, 3 e 4) foram amplificados utilizando a reação em cadeia da polimerase (PCR) iniciadores (S2 tabela). Os pares de iniciadores directo e inverso, exão utilizados nas reacções de PCR são descritas na Tabela S2. A mistura de PCR continha 50 ng de ADN, 5 pmol /L de cada iniciador, 2.5nmol /mL de cada um de dNTP, e 1,25 U de polimerase Taq de ADN em 20 ul de tampão com 0,04 umol /L de Mg2 +. Após um passo de desnaturação inicial a 94 ° C durante 5 min, foram realizados 35 ciclos de PCR, que incluiu 45 s de desnaturação a 94 ° C, 30 s de recozimento a 60 ° C, e 45 s para extensão a 68 ° C. Os produtos de PCR foram analisados ​​por electroforese em gel de agarose a 1%. Depois de observar bandas claras e com precisão de tamanho, os produtos de amplificação foram então purificadas e sequenciadas directamente sobre um sistema de detecção de sequência de Sanger (GE Healthcare Bio-Sciences, Pittsburgh, PA, EUA).

A análise estrutural das mutações

a estrutura 3D das defensinas beta humanas (Protein Data Bank entrada 1KJ6) [51] foi utilizado para estimar o impacto do gene seleccionado mutações de deslocamento de quadro sobre a estrutura da enzima.