Abstract

O câncer de próstata é uma das principais causas de morte por câncer entre os homens em todo o mundo . Neste estudo, usando o adenocarcinoma transgénico da próstata de ratinho (TRAMP) ratos, o efeito da dieta enriquecida com 1% w /w de ácido ursólico (UA) foi investigada para avaliar a actividade quimiopreventiva fase específica contra o cancro da próstata. Nós descobrimos que os ratos alimentados com TRAMP UA dieta de 8 semanas (semanas 4 a 12) a formação tardia de neoplasia intra-epitelial da próstata (PIN). Da mesma forma, os ratos alimentados com dieta UA durante 6 semanas (semanas 12 a 18) inibiu a progressão da PIN para adenocarcinoma, conforme determinado pela hematoxilina e eosina. Finalmente, os ratos alimentados com TRAMP UA dieta durante 12 semanas (semanas 24 a 36) demonstraram reduziu acentuadamente o crescimento do tumor, sem quaisquer efeitos significativos sobre o peso corporal total e sobrevida global prolongada. No que diz respeito ao mecanismo molecular, verificou-se que UA activação de vários mediadores pró-inflamatórios, incluindo, NF-kB, STAT3, AKT e IKKα fosforilação /β na próstata dorsolateral (DLP) tecidos que correlacionado com a redução no soro regulada para baixo os níveis de TNF-α e IL-6. Além disso, UA significativamente regulada negativamente os níveis de ciclina D1 e COX-2, mas de expressão sobre-regulada os níveis de caspase-3, conforme revelado por análise imuno-histoquímica de secções de tecido de tumor. Finalmente, UA foi detectada em amostras de soro obtidas a partir de vários grupos de ratos alimentados com uma dieta enriquecida em quantidade nanograma indicando que ele é bem absorvido no tracto GI. No geral, nossos resultados fornecem fortes evidências de que UA pode ser um excelente agente para a prevenção e tratamento de câncer de próstata

Citation:. Shanmugam MK, Ong TH, Kumar AP, Lun CK, Ho PC, Wong PTH, et ai. (2012) ácido ursólico Inibe o início, a progressão do câncer de próstata e prolonga a sobrevivência do Mice TRAMP modulando vias pró-inflamatórias. PLoS ONE 7 (3): e32476. doi: 10.1371 /journal.pone.0032476

editor: Ganesh Chandra Jagetia, Universidade de Mizoram, Índia |

Recebido: 08 de julho de 2011; Aceito: 28 de janeiro de 2012; Publicação: 12 de março de 2012

Direitos de autor: © 2012 Shanmugam et al. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Licença Creative Commons Attribution, que permite uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o autor original ea fonte sejam creditados

Financiamento:. Este trabalho foi apoiado por bolsas do Conselho Nacional de Pesquisa médica de Singapura [R-184-000-168-275 e R-184-000-201-275] para GS. APK foi apoiado por bolsas do Conselho Nacional de Pesquisa Médica de Singapura [Grant R-713-000-119-275] e Cancer Science Institute of Singapore, Experimental Therapeutics I Programa [Grant R-713-001-011-271]. KMH foi apoiado por uma bolsa do Conselho Nacional de Pesquisa Médica de Cingapura, Biomedical Research Council of Singapore, eo Millennium Foundation Singapura. Os financiadores não tem nenhum papel no desenho do estudo, recolha e análise de dados, decisão de publicar ou preparação do manuscrito

CONFLITO DE INTERESSES:.. Os autores declararam que não existem interesses conflitantes

Introdução

o câncer de próstata é a segunda principal causa de morte relacionada com câncer entre os homens nos países ocidentais após o cancro do pulmão [1]. A inflamação crónica é cada vez mais reconhecido como um mediador para muitos cancros [2], [3], [4] e considerável evidência sugere que desempenha um papel importante tanto no desenvolvimento e progressão do cancro da próstata [5]. Em primeiro lugar, os pacientes com prostatite sintomática são mais susceptíveis ao desenvolvimento de cancro da próstata. Em segundo lugar, o cancro da próstata tem sido associada com doenças sexualmente transmissíveis. Em terceiro lugar, a diminuição do risco de cancro da próstata está relacionado com o aumento do consumo de frutas e vegetais, antioxidantes, e não esteróides anti-inflamatórias (NSAID) [6], [7]. Em quarto lugar, próstata normal, sofre atrofia proliferativa inflamatória (PIA), antes de formar a neoplasia intra-epitelial prostática (PIN), o precursor do cancro da próstata [8]. Em quinto lugar, PIA pode sobre-expressar a enzima inflamatória COX-2 [9]. Em sexto lugar, os factores de transcrição NF-kB e STAT3, tanto importante mediador da inflamação, são constitutivamente activos em tecidos de cancro da próstata [10]. E o sétimo, o NF-kB-regulada citoquinas inflamatórias tais como interleuquina (IL-6) é um conhecido factor de crescimento autócrino para ser secretada por tecidos de cancro da próstata [11], [12]. Portanto, é razoável sugerir que os agentes que podem suprimir mediadores inflamatórios têm um potencial para a prevenção e tratamento do cancro da próstata.

UA (ácido 3β-hidroxi-urs-12-en-28-óico) , um triterpen�de pentac�lico derivado de bagas, folhas, flores e frutos de plantas medicinais, tais como

Rosemarinus officinalis

,

Eriobotrya japonica

,

Calluna vulgaris

,

Ocimum sanctum

, e

Eugenia jumbolana

é um tal agente que tem sido extensivamente estudada por suas atividades anti-inflamatórias e anti-cancerígenos na última década [13]. UA foi reportado para suprimir a proliferação de uma variedade de células tumorais, para induzir apoptose, e para inibir a promoção de tumores, metástases, e a angiogénese [14], [15], [16], [17]. O nosso grupo está actualmente a investigar o potencial inexplorado da UA para a prevenção e tratamento de câncer de próstata e, recentemente, relatada em dois estudos separados que UA pode realmente suprimir o crescimento de xenotransplante de próstata em ratos pelados e também inibem distante metástase local modulando a CXCR4 /CXCL12 cascata de sinalização [18], [19].

O adenocarcinoma transgénico da próstata de ratinho (TRAMP) modelo de cancro da próstata é baseada em um transgene que consiste de probasina (PB) antigénio T de SV40-driven promotor (Tag) expressão. Este ratinho transgénico é preferível modelos de implantação porque neste modelo de cancro da próstata espontaneamente desenvolve através de uma série de etapas bem definidas. Eles exibem semelhanças notáveis ​​para a progressão do cancro da próstata humana a partir da fase PIN para adenocarcinoma invasivo que metastiza para o fígado, pulmão e tracto GI através da activação de um transgene que é regulada por hormonas androgénios [20], [21]. Além disso, todos os ratinhos TRAMP desenvolver carcinoma bem diferenciado (WDC) entre 8-12 semanas de idade e metástases para locais distantes entre 18 e 24 semanas de idade [22]. No presente estudo, investigamos os efeitos potenciais da UA dieta enriquecida na prevenção do desenvolvimento, progressão, bem como a sobrevida global de tumores em ratinhos TRAMP. Os nossos dados indicam claramente pela primeira vez que a alimentação de ratos com uma dieta rica em UA pode inibir significativamente a progressão do PIN para o adenocarcinoma, e o crescimento do tumor. Ele também pode prolongar a sobrevida de ratos através da modulação de várias cascatas de sinalização.

Resultados

O presente estudo foi desenhado para investigar o potencial efeito (s) da UA sobre o desenvolvimento do tumor inicial, tumor a progressão ea sobrevida global de ratinhos TRAMP (Fig. 1A)

a, Masculino TRAMP-ratos 4 semanas de idade foram alimentados com dieta enriquecida UA durante 8 semanas (Grupo 1).; 12 semanas de idade ratos durante 6 semanas (Grupo 2); e 24 semanas ratos velhos para 12 semanas (Grupo 3). Os ratinhos foram sacrificados no final dos períodos de tratamento. pareados por idade controle TRAMP-camundongos receberam dieta normal para os mesmos períodos. Para os estudos de sobrevivência, os Grupos 1 e 3 foram tratados de modo semelhante enquanto que o grupo 4 foi alimentado com dieta enriquecida UA durante 36 semanas a partir de 4 semanas de idade. B, H E coradas secções de DLP de próstata não-TRAMP (I), um grupo de controlo (ii), e UA-tratada (iii) TRAMP próstata. C, gráfico de barras mostra a incidência de LG-PIN, HG-PIN, WDC, MDC e PDC no DLP de controle e Grupo 1 ratos. Um ligeiro aumento no LG-PIN e uma diminuição da HG-PIN foram observados (n = 5) após o tratamento UA. Nenhuma MDC e PDC foram observados no grupo 1 e os controlos correspondentes. A seta indica a LG-PIN; entalhado seta para a direita indica HG-PIN.

UA suprime neoplasia intraepitelial prostática formação (PIN)

Foi relatado anteriormente que os ratos TRAMP apresentam maior estratificação epitelial na próstata dorsolateral, epiteliais células com núcleos variavelmente alongado com cromatina condensada com padrões planos de baixo grau (LG) PIN (LG-PIN) por 4-8 semanas de idade e micropapilar tufos e um padrão cribriform de HG-PIN por 6-10 semanas de idade [ ,,,0],22] .Para investigar se UA suprime a formação de PIN, os ratinhos de 4 semanas de idade foram alimentados com ai (1%, w /w) contendo dieta de 8 semanas e sacrificaram-se às 12 semanas de idade (grupo 1). O peso húmido da próstata com vesículas seminais não alterar apreciavelmente tanto no controlo e ratinhos TRAMP UA Fed (dados não mostrados). O exame visual da cavidade abdominal também não revelam o alargamento anormal das vesículas seminais, os lóbulos da próstata ou nódulos linfáticos pélvicos. O consumo de UA dieta enriquecida foi bem tolerada, sem evidência de toxicidade em termos de aparência animal, comportamento e peso corporal.

Enquanto os ratos não-TRAMP não apresentaram qualquer formação de PIN (Fig. 1B, i), ratos TRAMP animais apresentaram LG- e HG-PIN e carcinoma bem diferenciado (WDC) (Fig. 1B, II e III). Os efeitos de UA-tratamento sobre a formação de PIN são mostrados na Fig. 1C. LG-PIN foi observada em 60% dos ratinhos tratados com UC em comparação com 40% nos controlos, enquanto HG-PIN foi observada em 20% dos ratinhos tratados com UC em oposição a 80% nos controlos. Isto demonstrou que o tratamento UA tinha reduzido a formação de PIN, bem como a progressão retardada de LG- a HG-PIN. Além disso, apenas um animal mostraram moderadamente (MDC) ou pobremente diferenciadas de carcinoma (PDC), nesta fase. Estes dados sugerem fortemente que UA tem o potencial de ser usada como um agente quimiopreventivo.

UA impede a progressão do cancro da próstata PIN para

Para determinar se ou não UA pode prevenir a progressão de PIN para cancro da próstata, TRAMP-ratos 12 semanas de idade foram alimentados com controlo ou AI (1%, w /w) enriquecido dieta durante 6 semanas e em seguida sacrificados em 18 semanas (Fig. 1A, Grupo 2). Aos 18 semanas de idade, o DLP de ratinhos TRAMP apresentaram maior incidência de LG-PIN, HG-PIN, WDC e MDC (Fig 2A, i . Ii) quando comparados aos observados em idades mais jovens (Fig 1B C). Não se observaram alterações significativas na aparência, peso corporal e consumo de alimentos entre o Grupo 2 ratinhos e os seus comandos. No entanto, houve uma diminuição significativa, mas estatisticamente insignificante no peso húmido de próstata com as vesículas seminais em ratos alimentados UA (dados não mostrados). UA-tratamento reduziu a incidência da LG-PIN em 60%, HG-PIN em 40% e WDC em 40% (Fig. 2A, iii) .geral, houve uma mudança perceptível para as maiores incidências de DLP não canceroso em UA-ratinhos tratados

A, H . e secção corada de DLP do Grupo 2 de controlo (i) e tratado UA (ii) da próstata TRAMP. A seta indica a LG-PIN, entalhado seta para a direita indica HG-PIN, e bloquear seta para a direita indica WDC. (Iii) O gráfico de barras mostra a incidência de LG-PIN, HG-PIN, WDC, MDC e PDC no DLP de controle e Grupo 2 ratos. Reduções nos PIN, WDC e MDC foram observados após o tratamento UA. B, H E secção corada de DLP do Grupo 3 controle de (i) e tratado UA (ii) da próstata TRAMP. Tal como descrito em A; cabeça da seta indica MDC e chevron indica PDC. C, Western blot de pSTAT3, pAKT, pIKKα /β, e as proteínas p65 no DLP nos Grupos 1, 2 e 3 ratos. Os lisados ​​de DLP foi preparado e imunotransferência foi realizada como descrito em Materiais e Métodos. carga de proteína igual para pAKT e pIKKα /β foi determinada por decapagem e sondagem para AKT total e IKKα, p65 e STAT3 transferências foram despojado e sondado para β-actina para determinar carga de proteína iguais. A densidade da banda foi quantificada utilizando software Imagem J. NT = não-TRAMP-ratos; controles T = TRAMP; -Tratados UA T + UA = TRAMP-ratos.

UA suprime o crescimento do câncer de próstata estabelecida

in vivo

Para determinar se UA pode suprimir o crescimento do cancro da próstata estabelecida, TRAMP-ratos de 24 semanas de idade foram alimentados com um controlo ou AI (1%, w /w) enriquecido dieta durante 12 semanas e, em seguida sacrificados aos 36 semanas (Fig. 1A, Grupo 3). Nessa idade, exame visual da cavidade abdominal revelou claramente vesículas seminais ampliados, DLP e outros lóbulos da próstata no controle TRAMP-ratos. O DLP mostrou maior incidência de WDC, MDC e PDC, quando comparado com os observados em idades mais jovens, sugerindo que a maioria dos animais tiveram lesões cancerosas no DLP (Fig 2B, i . II). Em contraste, os ratinhos TRAMP tratados com UA mostrou incidência reduzida de HG-PIN por 40%, 60% por WDC, MDC em 40%, e PDC em 20% (Fig. 2B III). No geral, os resultados indicaram que os ratinhos tratados com UA mostrou lesões não-cancerosas que variam de LG-PIN e HG-PIN para estroma normal, em comparação com 100% de incidência de cancro da próstata em ratinhos TRAMP de controlo.

UA inibe a activação de AKT, IKKα /β, NF-kB e STAT3 em DLP de ratinhos TRAMP

Temos informou recentemente que UA pode inibir AKT, IKKα /β, NF-kB e ativação STAT3 no cancro da próstata dependente e independente de andrógeno linhas de células [18]. Neste estudo, foram ainda examinados os efeitos de dieta enriquecida UA na activação de mediadores pró-inflamatórios no DLP de ratinhos TRAMP (Fig. 1A). Como mostrado na Fig. 2C, o aumento progressivo da fosfo (P) -Akt, -pIKKα /β, pSTAT3, e p65 expressão foram observados a partir do Grupo 1 Grupo a 3 ratinhos TRAMP como o cancro gradualmente progrediu de formação LG-PIN no grupo 1, 4-12 semana de idade, HG-PIN e carcinoma WD em DLP no grupo 2 em 12-18 semanas de idade, e WDC, MDC e PDC em 24-36 semanas de idade. da mesma idade não TRAMP ratinhos C57BL /6, usados ​​como controlos negativos, não mostraram qualquer alteração dos níveis destas proteínas pró-inflamatórias. Curiosamente, observou-se que o tratamento UA resultou numa inibição de aproximadamente 40-50% na expressão destas proteínas fosforiladas na DLP do grupo 2 e do grupo 3, em comparação com os ratinhos TRAMP tratados, ao passo que apenas uma ligeira redução foi observada no grupo 1 (Fig . 2C). Os níveis da AKT fosforilado e não-IKKα foram minimamente afectada por UA-tratamento (Fig. 2C). Tomados em conjunto, os nossos dados indicam claramente que a supressão de AKT pró-inflamatória, NF-kB e activação da STAT3 desempenha um papel na inibição da progressão do cancro da próstata em ratinhos TRAMP por UA.

UA inibe o TNF do soro -α e IL-6 em ratinhos TRAMP

TNF-α e IL-6 são citoquinas pró-inflamatórias, e são considerados como importantes biomarcadores de inflamação. Os grupos 1, 2 e 3 ratos em conjunto com os seus controlos foram sacrificados no final de cada protocolo de tratamento; o sangue foi colhido por punção cardíaca. O soro obtido foi avaliada para os níveis de TNF-α e IL-6 utilizando um kit de ELISA. Ambos, o TNF-α e IL-6 aumentou de Grupo 1 para o Grupo 3 correspondente ao aumento da idade e fases de progressão da doença (Fig. 3A). UA-tratamento diminuiu significativamente no soro de TNF-α no Grupo 2 (por -90%) Grupo 3 (~ 30%) (Fig. 3A, I), bem como a IL-6 no soro em todos os três grupos pela ~40-90% ( Fig. 3A, ii).

A. A supressão da TNF-α soro (i) e IL-6 (ii) por AI-tratamento. Grupos de 1-3 ratos foram tratados como descrito em Materiais e Métodos. ensaio ELISA Sandwich foi realizada de acordo com instruções do fabricante (R D systems, EUA) para determinar os níveis de TNF-α e IL-6. * O significado estatístico (P 0,05). B, a análise imuno-histoquímica de ciclina D1, caspase 3 e COX-2 em tecidos de tumor no grupo 3 ratinhos TRAMP. tecidos tumorais DLP, embutidos em blocos de parafina, foram cortados em secções de tecido de 5 um e sondadas para ciclina D1, caspase 3 e COX-2 imunorreactividades como descrito nos Materiais e Métodos. UA-tratamento (1% w /w) diminuiu a expressão de ciclina D1 e COX-2, mas o aumento da expressão da caspase-3 em comparação com os controlos. As imagens foram tiradas com um microscópio Olympus BX51 (ampliação, 20 ×). As células positivas (castanho) foram quantificadas utilizando o pacote de programa Image-Pro Plus v6.3 (Media Cybernetics, Inc.).

UA suprime a expressão de ciclina D1, COX-2 e a caspase-3 em ratinhos TRAMP de DLP

próxima investigados vários produtos génicos envolvidos na progressão do cancro (COX-2), de proliferação (ciclina D1) e apoptose (caspase-3) por imuno-histoquímica no Grupo 3 DLP de ratinhos TRAMP. Como mostrado na Fig. 3B, UA-tratamento reduziu o número de células coradas positivas para ciclina D1 de 31% a 3% e COX-2 a partir de 89% a 27%. Como esperado, a expressão da caspase-3 aumentou de 6% a 95%. Estes resultados indicam claramente que a inibição de múltiplos produtos génicos envolvidos em progressão tumoral e a indução de apoptose contribuem para as actividades anti-tumorais potentes da UA como observado em tecidos tumorais TRAMP.

UA suprime o crescimento do tumor e aumenta a sobrevivência de ratinhos TRAMP

para determinar se UA pode suprimir o crescimento de cancro da próstata estabelecida, TRAMP-ratos de 24 semanas de idade foram alimentados com um controlo ou AI (1%, w /w) enriquecido dieta durante 12 semanas e, em seguida sacrificados aos 36 semanas (Fig. 1A, Grupo 3). O peso húmido da próstata com vesículas seminais mostrou diferenças significativas no peso de toda a glândula da próstata. foi observado; (0,05 P grupos de controle recebeu uma dieta normal (Fig. 1A). Os ratos foram marcados no momento da morte com base no peso do tumor. parcelas de sobrevivência de Kaplan-Meier foram gerados para determinar a sobrevivência global. Log-rank (Mantel-Cox) parcelas mostrou aumentos na sobrevida global dos ratos em todos os grupos tratados com UA. A sobrevivência média dos ratos no grupo de controlo foi de 55 semanas, comparado com 75 semanas para o Grupo 1 e Grupo 2, e 72 semanas para o grupo 4 (P 0,05). No grupo 3, a sobrevivência média foi de 68 semanas, mas não atingiu significância estatística (Fig. 4C). Portanto, pode-se concluir que UA-tratamento é mais eficaz quando foi iniciada cedo, quando o vagabundo-ratos não apresentaram câncer ou apenas estágios iniciais de desenvolvimento PIN.

A, ratos foram sacrificados com 36 semanas eo volume do tumor foi medido como descrito em materiais e Métodos. As barras de erro representam SEM. * O significado estatístico (P 0,05). B, o peso corporal dos camundongos Grupos 1-3 TRAMP e seus controles. C, O efeito de UA-tratamento sobre a sobrevivência a longo prazo de ratinhos TRAMP. análise de sobrevivência de Kaplan-Meier foi realizada para o controlo e ratinhos TRAMP tratados com UA. Tempo médio de sobrevivência foi de 55 semanas para o controlo (n = 5). tempo de sobrevivência médio para o Grupo 1, Grupo 2, Grupo 3 e Grupo 4 foi de 75, 75, 68, e 72 semanas, respectivamente. importância global foi determinada utilizando log-rank test (Mantel-Cox). UA dieta enriquecida significativamente a sobrevida prolongada.

Detecção de UA no soro

UA foi detectado no soro de todos os 3 grupos de TRAMP-ratos alimentados com dieta enriquecida UA. As concentrações detectadas variou de cerca de 600 a 1300 ng /ml, sem significância estatística entre os grupos (Fig. 5B). Como se esperava que os níveis séricos de UC ter alcançado a concentração de estado estacionário em todos os três grupos, as diferenças de concentração reflectida assim as variações individuais. Não foram detectados picos adicionais no soro, indicando que UA não gera quaisquer metabolitos (Fig. 5A III, e IV). O nosso estudo apresenta a primeira evidência experimental que AI é bem absorvido após alimentação oral e as concentrações séricas atingidos não são suficientes para desencadear efeitos biológicos, como é evidente por meio da inibição do crescimento do tumor da próstata em ratinhos TRAMP.

a, (i) cromatogramas de iões de extratos de soro de ratos que não receberam UA (em branco). (Ii) espectro de verificação completa mostrando o pico de m /z com uma massa molecular de 469 corresponde a um padrão interno (IS) ácido glicirretínico. (Iii) espectro de varredura completa mostrando o pico m /z, com uma massa molecular de UA padrão a 455 e está em 469 e (iv) espectro de varredura completa da amostra, tempo de retenção foi de 1,7 e 1,96 min respectivamente para ambos é e amostra. Os cromatogramas são representativos de 3 expericias independentes. B, as concentrações de soro de ácido úrico foi calculada utilizando o software dos analistas 1.4.2 a partir da equação de regressão linear da razão das áreas de pico em função da concentração da curva de calibração. As barras de erro representam SEM.

Discussão

O modelo de mouse TRAMP é um modelo de câncer bem estabelecida espontaneamente desenvolvimento da próstata que imita a progressão do tumor de próstata natural, a partir de PIN ao câncer de próstata metastático altamente invasivo [ ,,,0],20], em seres humanos. Nos ratinhos TRAMP, o tumor tem origem a partir de ambos DLP e ventral da próstata (VP) como um resultado de expressão tag que é essencialmente restrita aos lóbulos da próstata [22], enquanto que o cancro da próstata humano origina a partir da zona periférica que é semelhante ao DLP em ratinhos [23]. Os efeitos anti-cancerígenos de vários agentes quimiopreventivos, incluindo análogos de ácido oleanólico, o sulforafano, os polifenóis obtidos a partir do chá verde, alho constituintes, a curcumina, 3, 3′-diindolylmethane e genisteína foram avaliadas anteriormente no desenvolvimento espontaneamente tumorigénese da próstata em ratinhos TRAMP [24], [25], [26]. Além disso, o licopeno, γ-tocoferol, silbinin e tomate dieta enriquecida foram todos encontrados para aumentar a sobrevivência e retardar a progressão de PIN para adenocarcinoma e diminuir a incidência de carcinoma pouco diferenciado [23], [27], [28], [ ,,,0],29], [30]. No entanto, o estudo quimioprevenção com UC em modelo de cancro da próstata não foi efectuada previamente, e apenas o nosso grupo foi recentemente relatado pela primeira vez que UA dieta enriquecida pode de facto inibir a metástase do tumor da próstata por modulação do eixo CXCR4 /CXCL12 em ratinhos TRAMP [19 ]; embora não tenha sido avaliado o efeito da UA no desenvolvimento e progressão tumoral. No presente estudo, foi estudado o efeito do tratamento de UC em três diferentes fases de desenvolvimento de cancro em ratinhos TRAMP. Descobrimos que UA pode inibir significativamente o desenvolvimento e progressão do cancro em todos os três estágios. No grupo 1 ratos, observou-se efeito supressor mensuráveis ​​de UA no desenvolvimento PIN, enquanto no Grupo 2 ratos, o desenvolvimento de PIN de alto grau foi inibida como evidenciado pela redução do PIN bem diferenciado. Além disso, UA inibiu significativamente a progressão da PIN pré-neoplásicas em DLP e o volume do tumor, sem efeitos adversos observáveis ​​nos ratinhos do Grupo 3. O desenvolvimento de uma abundância de lesões não-cancerosas neste grupo, em oposição à predominância de lesões cancerosas em ratinhos TRAMP de controlo é evidente. Resultados de graduação histológica sugere também que as UA pode predominantemente inibir o desenvolvimento de lesões pré-cancerosas, em uma maioria de murganhos, e, assim, impedir o desenvolvimento de lesões malignas altamente invasivas. UA também aumentou significativamente a sobrevida global em até 20 semanas, atrasou progressão de PIN para adenocarcinoma, e diminuiu a incidência de PDC.

Além disso, observou-se que os efeitos anti-proliferativa e pró-apoptóticos da UA são associada com a supressão da ciclina D1 e COX-2 e a inibição do NF-kB, STAT3, AKT e IKKα activação /β nas próstatas de ratinhos TRAMP. Tal inibição correlacionado com a duração do período de alimentação, como é evidente pela inibição substancialmente maior no grupo 3, os ratinhos que receberam UA continuamente for12 semanas consecutivas. A redução em TNF-α e IL-6 também se correlacionou com a duração do período de tratamento. A supressão de ciclina D1 e COX-2 pode também ser uma consequência da activação reduzida do NF-kB e STAT3 como estes factores pró-inflamatórias de transcrição regular a expressão de ciclina D1 e COX-2 [2], [3], [ ,,,0],31]. O aumento da expressão da caspase-3 é indicativo de apoptose. Tomados em conjunto, estes resultados sugerem claramente que a inibição da proliferação de células e aumento da apoptose desempenham um papel central na inibição UA-mediada de progressão do tumor da próstata em ratinhos TRAMP. O facto de UA foi detectada em todas as amostras de soro em concentrações significativas indicam ainda que AI é bem absorvido e alimentação por via oral pode ser considerada como uma via de administração preferida para um potencial quimiopreventivo e agente terapêutico para o cancro da próstata. Portanto, pode concluir-se que a AI-tratamento inibiu a progressão do PIN para o adenocarcinoma, reduziu o crescimento do tumor e também prolongou a sobrevivência dos ratinhos. Juntos, estes resultados indicam que UA pode ter um enorme potencial para o uso como um agente quimiopreventivo, bem como um agente promissor para o tratamento do cancro da próstata.

Em resumo, os nossos dados demonstram claramente que a alimentação atrasa a progressão da UC da próstata cancro em ratinhos por meio da modulação de várias moléculas pró-inflamatórias. Porque TRAMP é um modelo espontâneo de cancro da próstata que imita de perto formas progressivas de doença humana, os resultados deste estudo fornecem uma base sólida para avançar mais estudos sobre a utilização da UA quer isoladamente ou em combinação com outras terapias para a prevenção e /ou tratamento de câncer de próstata.

Materiais e Métodos

Reagentes

UA (98% puro) foi comprado de Guangxi Changzhou produtos naturais Development Company Ltd (China). UA foi misturada com uma dieta de rato normal a 1% w /w e armazenado a 4 ° C. Tris, glicina, NaCl, SDS, ácido glicirretínico e anticorpo β-actina foram adquiridos da Sigma-Aldrich (St. Louis, MO, EUA) e anticorpo secundário conjugado com HRP foi obtido a partir de Invitrogen (Carlsbad, CA, EUA). Os anticorpos contra fosfo-STAT3 (Tyr 705), fosfo-AKT (Ser 473), a STAT3 foram adquiridos a partir de Santa Cruz Biotechnology (Santa Cruz, CA). Os anticorpos para AKT, p65, específica fosfo-IKKα /β (Ser 180 /Ser 181), e IKKα foram adquiridos a partir de Cell Signaling Technology (Beverly, MA). IL-6 kits de ELISA de TNF-α e foram adquiridos a Research Instruments (MA, EUA). reagente de Bradford foi adquirido a Bio-Rad (Hercules, CA). kit de coloração imuno-histoquímica foi adquirida da Dako (Dinamarca).

ratinhos TRAMP reprodutores e genotipagem

As experiências com animais foram conduzidos de acordo com as diretrizes Singapore NACLAR (Lei partir de novembro de 2004) para o uso de animais de laboratório e cuidados e aprovado pelo cuidado NUS Institucional animal e Uso Comissão protocolo número 052/09. Resumidamente, ratos fêmeas TRAMP 4 semanas de idade adquiridos da The Jackson Laboratory foram acasalados com C57BL /6 do sexo masculino na NUS CARE (Singapura). As crias foram genotipados para o transgene (tag) com 3 semanas de idade; O DNA foi extraído a partir da cauda utilizando o reagente snips Trizol® (Invitrogen, EUA) e quantificado usando Nanodrop espectrofotómetro (Thermo Scientific, EUA). Um? G do DNA foi feita por análise de PCR. reacção em cadeia da polimerase (PCR) de uma mistura de reacção continha 10 ul de 5 tampão × QIAGEN de PCR, 1? g de ADN, 0,6 | iM cada uma para a frente e reverso iniciadores, 2 ul de mistura de dNTP e 1 ul de enzima Taq polimerase num volume final de 50 ul. Os iniciadores utilizados para a genotipagem, iniciador directo: 5′-CCG GTC GAC CGG AAG CTT CCA CAA GTG CAT TTA-3 ‘, o iniciador inverso: 5′-AGG CAT TCC ACC ACT GCT CCC ATT CAT C-3’. As condições de PCR foram 94 ° C durante 3 min, 94 ° C durante 30 seg, 62 ° C durante 1 min, 72 ° C durante 1 min, repetir os passos 2-4 para 35 ciclos, 72 ° C durante 2 minutos e mantida a 4 ° C. Os produtos de PCR foram corridos num gel de agarose a 1% contendo 1 × GelRed mancha de gel de ácido nucleico a partir de Biotium (Hayward, CA). bandas coradas foram visualizadas sob luz UV e fotografada utilizando gel Biorad sistema doc EZ (Bio-Rad, EUA). filhotes positivos transgene foram então utilizados para as experiências subsequentes.

peneiração patológica dos tecidos tumorais

A classificação patológica de cancro da próstata TRAMP foi realizada de acordo com o sistema de classificação descrito anteriormente [22]. lesões próstata no DLP foram histologicamente classificados como (ducto forrado com uma única camada de células epiteliais secretoras cercada por dois ou três camadas de células de estroma fibrousmuscular) normal, de baixo grau neoplasia prostática intra-epitelial (PIN) [células epiteliais com núcleos variavelmente alongado com condensada cromatina], PIN de grau elevado (de epitélio estratificado e de tufagem, a presença de estruturas micropapilares e cribiformes), carcinoma bem diferenciado (WDC) (células epiteliais invadir o estroma fibromuscular), e moderadamente diferenciado (MDC) para pouco diferenciado (PDC) de adenocarcinoma de a próstata (folhas de células neoplásicas com pouca ou nenhuma estrutura glandular). 15 campos selecionados aleatoriamente microscópicos em hematoxilina e eosina (H E) seções do DLP coradas foram marcou para a incidência e patológico grau do câncer de próstata em ratos UA alimentados TRAMP controle e

In vivo.

estudo anti-tumor

Os ratinhos TRAMP masculinos puras, 4 semanas de idade, foram mantidos em salas de temperatura controlada com um 12 h ciclo de luz /escuridão. Todos os murganhos foram pesados ​​antes do inicio da experiência. Os ratinhos foram então distribuídos aleatoriamente nos seguintes grupos UA alimentado e de controlo (n = 5). Grupo 1: ratinhos TRAMP 4 semanas de idade foram alimentados com ai (1% w /w) dieta enriquecida durante 8 semanas; Grupo 2: ratinhos TRAMP de 12 semanas de idade foram alimentados com a dieta enriquecida UA durante 6 semanas; Grupo 3: ratinhos TRAMP de 24 semanas de idade foram alimentados com a dieta enriquecida UA durante 12 semanas. Controle TRAMP camundongos receberam dieta normal. O peso corporal e o tamanho do tumor foram registados duas vezes por semana e o tamanho do tumor foi determinado por Vernier paquímetro e calculada usando a fórmula [comprimento x (largura)

2] /2. Os ratinhos foram sujeitos a eutanásia por CO

2 inalação seguido por deslocamento cervical. Amostras de sangue, obtidas por punção cardíaca, foram mantidos a 4 ° C durante a noite e centrifugada a 10000 rpm durante 20 minutos para se obter soro, que foi armazenado em alíquotas a -80 ° C. O volume do tumor foi medido e pesado. glândula da próstata foi microdisected das vesículas seminais sob um microscópio estereoscópico, fixadas em 10% de fosfato tamponado para a H E e análise imunohistoquímica

ensaio ELISA para o TNF-α e IL-6

armazenado. As amostras de soro foram analisadas quanto a TNF-a e IL-6 utilizando o kit de ELISA (R D systems, USA) de acordo com as instruções do fabricante. protocolos ELISA sanduíche foram usados ​​e calibração foi feita com TNF-α padrão e IL-6 fornecido com o kit.

Western blotting

dorsolateral tecidos tumorais de próstata foram lisadas em tampão de lise contendo (20 mM Tris (pH 7,4), NaCl 250 mM, EDTA 2 mM (pH 8,0), 0,1% de Triton X-100, 0,01 mg /ml de aprotinina, 0,005 mg /ml de leupeptina, PMSF 1 mM e NaVO4 4 mM). Os lisados ​​foram então centrifugados a 13000 rpm durante 10 min para remover o material insolúvel e 50 ug de proteína foi resolvido num gel de SDS a 10%. 5A.