Abstract

O mesenquimais transição epitelial (EMT) é um processo importante na o desenvolvimento do tumor. Apesar das pesquisas anteriores, não se sabe como p120-catenina (p120ctn) isoformas 1A e 3A afetar a EMT de células tumorais. Aqui nós investigamos expressão de p120ctn, E-caderina e vimentina em 78 cancro do pulmão de células não pequenas humano (NSCLC) amostras por imuno-histoquímica e descobriram que a expressão da membrana p120ctn positivamente correlacionada com a expressão de E-caderina (

P

0,001) e negativamente com vimentina metástase expressão e linfonodo (

P Art 0,05). Enquanto isso, a expressão citoplasmática p120ctn negativamente correlacionada com a expressão da caderina-E (

P Art 0,001) e positivamente correlacionada com a expressão de vimentina e metástases em linfonodos (

P Art 0,05). As células que expressam elevados (H460 e SPC) e baixas (H1299 e LK2) níveis de p120ctn foram tela para investigar o seu impacto sobre EMT. E-caderina foi restringida para a membrana celular em células H460 e H1299, ao passo que foi expressa no citoplasma de células de CCP e LK2. A ablação de p120ctn isoforma endógena 1A em células que expressam níveis elevados da proteína resultou numa diminuição da expressão de E-caderina, o aumento da N-caderina, vimentina e expressão caracol e invasividade aumentada em células H460. Enquanto isso, completamente resultados opostos foram observados em células SPC. Além disso, a transfecção de células H1299 em que expressam níveis baixos p120ctn com o plasmídeo 1A p120ctn isoforma resultou num aumento da expressão de E-caderina, diminuiu N-caderina, vimentina e expressão caracol e invasividade enfraquecido, enquanto que as células LK2 mostrou resultados totalmente opostos. Ambas as linhas de células que expressam níveis baixos p120ctn e transfectadas com o plasmídeo 3A p120ctn isoforma pareceram ter um aumento da expressão de E-caderina, diminuiu N-caderina, vimentina e expressão caracol e invasividade enfraquecida. Em conclusão, em células com membrana de E-caderina, tanto p120ctn isoformas 1A e 3A inibiu EMT e diminuição da capacidade de invasão celular. Em células com citoplasmática E-caderina, p120ctn isoforma 1A promovido EMT e aumento da capacidade de invasão celular, enquanto p120ctn 3A isoforma inibiu a EMT e diminuição da capacidade de invasão das células

Citation:. Zhang Y, Zhao Y, Jiang G, Zhang X, Zhao H, Wu J, et al. (2014) Impacto da p120-catenin isoformas 1A e 3A em epitelial mesenquimal Transição de células de câncer de pulmão Expressando E-caderina em diferentes localizações subcelulares. PLoS ONE 9 (2): e88064. doi: 10.1371 /journal.pone.0088064

editor: Frédéric André, da Universidade Aix-Marseille, França |

Recebido: 21 de novembro de 2013; Aceito: 06 de janeiro de 2014; Publicação: 04 de fevereiro de 2014

Direitos de autor: © 2014 Zhang et al. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Licença Creative Commons Attribution, que permite uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o autor original ea fonte sejam creditados

Financiamento:. Este trabalho foi apoiada por doações do National Science Foundation Natural da China (bolsas 81071905 e 81272606 para E.-HW, concede 81.101.780 para YZ). Os financiadores não tiveram nenhum papel no desenho do estudo, coleta de dados e análise, decisão de publicar ou preparação do manuscrito

CONFLITO DE INTERESSES:.. Os autores declararam que não existem interesses conflitantes

Introdução

A transição epitelial mesenquimal (EMT) é uma mudança rápida e frequentemente reversível do fenótipo celular e desempenha um papel particularmente importante no desenvolvimento do tumor. No processo de EMT, células epiteliais submetidos a um interruptor fenotípica para formar células mesenquimais que são semelhantes em aparência aos fibroblastos [1], [2]. Tais mudanças fenotípicas causar células epiteliais a perder as suas estruturas de adesão célula-célula característicos, alterar a sua polaridade, modular a organização dos seus sistemas do citoesqueleto, mudar a expressão de keratin- de filamentos intermediários do tipo vimentina, bem como tornar-se isolado, móveis e resistentes a anoikis [3], [4]. Normalmente, as células submetidos a EMT mostram diminuição E-caderina expressão [5], [6] e diminuição da expressão de biomarcadores mesenquimais, tais como N-caderina, vimentina, caracol, lesma e torção [7], [8].

estudos anteriores sobre a relação entre p120-catenina (p120ctn) e EMT foram confinados ao interruptor de curto a isoformas p120ctn longas durante a EMT induzida por expressão de SIP1 /ZEB2 [9], torcer [10] ou Zeppo1 [11 ]. No entanto, o mecanismo pelo qual p120-catenina isoformas 1A e 3A afectar células tumorais EMT de permanece desconhecida. A proteína p120ctn tem quatro isoformas (1 a 4) resultantes dos quatro locais de início da transcrição, e cada isoforma tem um domínio de repetição central completo Armadillo que pode interagir com o domínio justamembrana de caderina-E, a fim de participar na formação de um complexo de adesão sobre a membrana celular [12]. Estas observações sugerem que a função de localização subcelular e de p120ctn pode ser afectada pela localização da E-caderina. Estudos anteriores demonstraram que p120ctn podem desempenhar papéis opostos, dependendo se ele está localizado na membrana ou no citoplasma de células [13], [14]. Outros também descobriram que p120ctn isoformas 1A e 3A têm diferentes funções reguladoras sobre a proliferação de células de tumor, invasão e metástase [15], [16],. Estes estudos indicam que, se p120ctn tem um impacto sobre o EMT, é provável que seja diferente entre p120ctn isoformas 1A e 3A.

Alguns estudos têm mostrado que p120ctn podem promover ou inibir o crescimento tumoral e invasão dependendo se E -cadherin expressa ou não [18], [19]. Yu e colegas também encontraram efeitos diferentes de p120ctn isoformas 1A e 3A na proliferação e invasão de células tumorais exibem diferentes localizações de E-caderina [20]. Assim, se p120ctn isoformas 1A e 3A também desempenham papéis diferentes na regulação EMT em células tumorais com a E-caderina em locais diferentes permanece desconhecida.

O objetivo deste estudo foi determinar os efeitos potenciais e mecanismos reguladores de p120ctn isoformas 1A e 3A na EMT em células de câncer de pulmão. Nós primeiro revelou que a membrana ou expressão citoplasmática de p120ctn correlacionada com a expressão de E-caderina e vimentina ou metástase linfonodal por imuno-histoquímica. Detectamos ainda mais os níveis de expressão de p120ctn, E-caderina e vimentina em células de cancro do pulmão por Western blot e rastreadas linhas celulares que expressam os níveis tanto de baixa e alta de p120ctn e com a E-caderina na membrana ou citoplasma. Mudanças na expressão de moléculas relacionadas com a EMT e invasão celular também foram investigados por knockdown de p120ctn-1A ou sobre-expressão endógena por transfecção de p120ctn-1A e 3A plasmídeos nas células.

Materiais e Métodos

materiais

Este estudo foi realizado com a aprovação do conselho de revisão institucional na China Medical University. consentimento escrito foi dada pelos participantes para informação a ser armazenada na base de dados do hospital e pelos seus espécimes para ser utilizado neste estudo. Todos os exames clínicos foram realizados de acordo com os princípios expressos na Declaração de Helsinki. Foram coletadas amostras de 78 casos de câncer de pulmão de células escamosas e adenocarcinoma de pulmão diagnosticados no primeiro hospital afiliado da China Medical University (Sheny-ang, China). As amostras eram de 46 do sexo masculino e 32 do sexo feminino, com idade média de 57 anos. As amostras foram classificadas de acordo com critérios histológicos de tumor de pulmão (2004) da Organização Mundial de Saúde (OMS) [21] como carcinoma epidermóide de pulmão de células (32 casos) ou de pulmão adeno-carcinoma (46 casos). Trinta casos eram bastante diferenciadas, e quarenta e oito eram moderadamente ou pouco diferenciados. As metástases linfonodais estavam presentes em 43 casos, mas não em outro 35. Foram selecionados casos com metástases linfáticas, para comparar os nódulos metastáticos com o tumor primário. estadiamento do tumor foi realizada de acordo com o sistema tumor-nódulo-metástase (TNM) da União Internacional contra o Câncer (UICC) [22]. Houve 39 casos na fase I-II, e 39 casos na fase III-III-B. Nenhum dos pacientes havia recebido radioterapia ou quimioterapia antes da operação e foram dadas o tratamento padrão após a cirurgia. Todas as amostras foram fixadas em formalina, embebidos em parafina e corados com hematoxilina e eosina para análise e diagnóstico patológico.

cultura celular

humana normal epiteliais brônquica células

(HBE) e A549, H1299, H460 e linhas de células H157 foram obtidas a partir da American Type Culture Collection (Manassas, VA, EUA). O SPC-A-1, as linhas celulares LK2 LTEP-A-2 e foram adquiridos a partir do celular Shanghai Bank da Academia Chinesa de Ciências. O ADC de pulmão humano e Anip973 AGZY83a linhas de células foram adquiridos a partir de Xangai Bioleaf Biotech Co., Ltd. (https://www.bioleaf.com) e armazenado no Departamento de Patologia, Universidade de Medicina Harbin. As células foram cultivadas em meio RPMI 1640 (Invitrogen, Carlsbad, CA, EUA) contendo 10% de soro fetal de vitelo (Invitrogen), 100 UI /ml de penicilina (Sigma, St. Louis, MO, EUA) e 100 mg /ml de estreptomicina (Sigma) .

construção de plasmídeo e transfecção

Os plasmídeos de expressão para p120ctn isoformas 1A e 3A (doado pelo Dr. Albert B. Departamento de Reynolds da biologia do câncer, da Escola de Medicina da Universidade de Vanderbilt, TN, EUA) têm sido descrito anteriormente [16]. Sequências de p120ctn-1A-siARN (Cantão Ruibo Co. Ltd, Cantão, China) utilizados nas experiências foram como se segue: Si-H-CTNND1: 5′-dTdT CACAAGAUGCCAACCCACU-3 ‘, 3′-dTdT GUGUUCUACGGUUGGGUGA-5’. As células foram transf ectadas transitoriamente com p120ctn-1A-siRNA e plasmídeos expressando p120ctn isoformas 1A e 3A utilizando Lipofectamina 2000 (Invitrogen, Carlsbad, CA) ou Attractene Transfection Reagent (Qiagen GmbH, Hilden, Alemanha) de acordo com as instruções do fabricante.

imunohistoquímica

As amostras embebidos em parafina foram cortados em série para dentro de 4 mm de espessura. Normal epitélio brônquico presente nas lâminas de tumor foi usado como um controlo positivo interno. A imunocoloração foi realizada pela estreptavidina-peroxidase (S-P) método. As secções de tecido foram incubadas com um anticorpo monoclonal de rato p120ctn (1:100, gato 610134, BD Transduction Laboratories, Lexington, KY, EUA.), E-caderina anticorpo monoclonal de coelho (1:100, gato SC-7870;. Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA, EUA) ou anticorpo monoclonal de coelho vimentina (pronto a utilizar, cat. RMA-0547, Bio MaiXin, Fuzhou, China), a 4 ° C durante a noite. PBS foi usado como um controlo negativo. biotinilado de cabra IgG sérica anti-ratinho ou IgG de cabra biotinilado anti-soro de coelho (pronto a utilizar, Cat. KIT-9922, Bio MaiXin) foi usado como o anticorpo secundário. Após a lavagem, as secções foram incubadas com estreptavidina-biotina conjugado com peroxidase de rábano (Ultrasensitive, MaiXin Bio), e, em seguida, a reacção da peroxidase foi desenvolvido com tetracloridrato de 3,3-diaminobenzidina (MaiXin Bio). A contracoloração foi realizada com luz hematoxilina, e, em seguida, as secções foram desidratadas em álcool antes de ser montada.

Dois investigadores examinaram independentemente todas as lâminas de tumor. Cinco campos aleatórios foram examinados por lâmina, e 100 células foram observados por alto campo de ampliação (400 ×). A percentagem de células positivas foi pontuado como se segue: 0 = nenhuma coloração; 1+ = 0-25%; 2+ = 26-50%; 3+ = 51-75%; e 4+ = 76-100%. A intensidade da coloração foi pontuada como segue: 0 = nenhuma coloração; 1 grânulos amarelos = luz; 2 = escuras grânulos amarelo ou marrom. A pontuação rotulagem definido pela multiplicação da percentagem de células positivas pela intensidade da coloração foi a pontuação final para a seção. Quando a pontuação total foi de ≥3, o caso foi definido como positivo. Quando a pontuação total foi de 3, o caso foi definido como negativo. Para contagens superiores a 3 pontos, quando mais de 30% das células de tumor coradas fortemente e de forma contínua para o sinal p120ctn na membrana celular, a amostra foi definida como membrana positiva. Quando menos do que 30% das células de tumor exibido expressão membrana mas fortemente corados e continuamente por p120ctn no citoplasma, a amostra foi definida como positiva citoplasma.

Western blot análise

Cinquenta microgramas de proteínas foram separadas por SDS-PAGE (10%). Após a transferência para uma membrana de fluoreto de polivinilideno (PVDF) (Millipore, Billerica, MA, EUA), as proteínas foram incubadas durante a noite a 4 ° C com os anticorpos para o seguinte: (p120ctn 1:500, gato 610.134.), E-caderina ( 1:300, cat. 610181), N-caderina (1:1000, cat. 610920) (BD Transduction Laboratories, Lexington, KY, EUA), vimentina (1:1000, cat. 5741), caracol (1:500, cat. 3879) (Cell Signaling Technology, Boston, MA, EUA) e torção (1:200, cat. sc-15193, Santa Cruz Biotechnology). Após a incubação com anti-ratinho (1:2000, E030110-01) ou anti-coelho (1:2000, E030120-01) IgG (EarthOx LLC, San Francisco, CA, EUA) a 37 ° C durante 2 h, a proteína bandas foram visualizadas usando quimioluminescência aumentada (ECL, Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, EUA) e quantificado usando sistemas bioimaging (UVP, Upland, CA, EUA). Os níveis de proteína relativos foram calculados em referência à GAPDH como controlo de carregamento.

imunofluorescente coloração

Células cultivadas em lamelas de vidro foram fixados com gelada paraformaldeído a 4% durante 15 min, seguido de permeabilização com 0,2% de Triton X-100 e a incubação com soro de cabra normal durante 30 minutos a 37 ° C. As células foram então incubadas durante a noite com anticorpo de rato monoclonal p120ctn (1:200, gato 610134;. BD Transduction Laboratories, Lexington, KY, EUA) e anticorpo policlonal de coelho de E-caderina (1:100, SC-7870; Santa Cruz Biotechnology). Os anticorpos primários foram aplicados durante a noite a 4 ° C, seguido por incubação com um rodamina /f luoresceína-5-isotiocianato (FITC) marcado com anticorpo de cabra anti-ratinho de cabra secundário ou TRITC-IgG anti-coelho (1:100, gato. E031210 -01 e E031320-01, EarthOx, San Francisco, CA, EUA). Os núcleos foram contrastadas com iodeto de propidio /4, 6-diamidino-2-phenylin dole. microscopia de epifluorescência foi realizada utilizando um microscópio invertido Nikon TE300 (Melville, Nova Iorque, EUA), e microscopia confocal foi realizada utilizando um radiante 2000 varrimento a laser microscópio confocal (Carl Zeiss, Thornwood, NY, EUA).

célula Matrigel invasão ensaio

Matrigel ensaios de invasão de células foram realizadas de acordo com as instruções do fabricante (Corning, Acton, MA, EUA). Uma suspensão de células de 100 uL (5 × 10

5 células) foi adicionada à câmara superior, enquanto a câmara inferior foi preenchida com o meio RPMI 1640 contendo 10% de soro fetal de vitelo. Cada uma das câmaras superior e inferior foi separada por uma membrana de policarbonato porosa 8 mícrons. As células foram incubadas durante 24 h a 37 ° C numa atmosfera húmida com 5% de CO

2. Depois o meio foi rejeitado, as células foram fixadas com metanol durante 30 minutos e coradas com hematoxilina (Sigma). Para cada filtro, o número de células que invadiram para a superfície inferior da membrana porosa em cinco campos diferentes de 400 × ampliação foram contadas utilizando um microscópio Nikon aleatoriamente E200. A média foi calculada a partir de dados obtidos a partir de cada experimento repetido três vezes.

A análise estatística

Todas as análises estatísticas foram realizadas utilizando SPSS 17.0 (SPSS Inc., Chicago, IL, EUA) para o software Windows . O teste do qui-quadrado foi usado para analisar dados de imuno-histoquímica. O teste t de amostras independentes foi utilizado para analisar os dados experimentais Transwell.

valores P

. 0,05 foram considerados estatisticamente significativos

Resultados

expressão de membrana de p120ctn correlaciona-se positivamente com a expressão da caderina-E e negativamente correlacionada com a expressão de vimentina e metástases em linfonodos

tecidos normais epiteliais brônquicas mostrou p120ctn na membrana (Figura 1A), enquanto a proporção de tecidos de cancro do pulmão que expressam p120ctn na membrana era significativamente menor (35%, 27/78) do que com a expressão citoplasmática p120ctn (65 %, 51/78). E-caderina foi expressa na membrana em tecidos epiteliais brônquicas normais (Figura 1a), enquanto que a taxa de expressão positiva foi diminuída (28%, 22/78) e que de expressão negativa foi significativamente aumentada (72%, 56/78) para E-caderina em tecidos de câncer de pulmão. Vimentina foi expressa negativamente em tecidos epiteliais brônquicas normais (Figura 1a), enquanto que a taxa de expressão positiva foi aumentado para 32% (25/78) no tecido do cancro do pulmão. Parece tecidos de câncer de pulmão com localização citoplasma /núcleo de p120ctn tenderam a expressar vimentina em comparação com aqueles com a localização membranoso (41,2% [21/51] versus 14,8 [4/27]) .. citoplasmática localização /nuclear de p120ctn mostraram aumento metástase linfática (29/51) em comparação com a localização membranoso (8/27). A análise estatística mostrou que a localização de p120ctn estava intimamente relacionado com a expressão da caderina-E, expressão vimentina e metástases em linfonodos (

P Art 0,05) (Tabela 1). Em outras palavras, expressão de membrana p120ctn foi positivamente correlacionada com a expressão da caderina-E e negativamente correlacionada com a expressão de vimentina e metástases em linfonodos (Figura 1B); Enquanto isso, a expressão citoplasmática p120ctn foi negativamente correlacionada com a expressão da caderina-E e positivamente correlacionada com a expressão de vimentina e metástases em linfonodos (Figura 1C).

(A) E-caderina e p120ctn foram membrana positivo, e vimentina foi negativo em células epiteliais brônquicas normais. (B) E-caderina foi membrana positivo, e vimentina foi negativa em células de câncer de pulmão membrana positivo p120ctn. (C) E-caderina foi negativo, e vimentina foi positivo em células de câncer de pulmão citoplasmáticos positivos p120ctn.

Localização de p120ctn é consistente com a E-caderina em células de câncer de pulmão

Foram examinados os níveis de p120ctn e e-caderina de expressão de proteína em células HBE normais e linhas de células de cancro nove pulmonares por Western blot e descobriram que todas expressas eles isoformas principalmente 1A (120 kDa) e 3A (100 kDa) do p120ctn ( A Figura 2A). Embora os níveis de p120ctn expressão de proteínas não estavam relacionadas com a E-caderina, a localização (membrana ou citoplasma) do p120ctn sempre foi consistente com a de E-caderina. Nós células, em seguida, rastreados que expressam níveis elevados de p120ctn e E-caderina na membrana (H460 células) ou citoplasma (células CPE), assim como aqueles que expressam baixos níveis de p120ctn e E-caderina na membrana (H4299 células) ou citoplasma ( células LK2) para posterior estudo (Figura 2B).

(a), análises de Western blot mostrou expressão de p120ctn e e-caderina em linhas celulares de cancro do pulmão e nove HBE. (B) por análise de imunofluorescência, a expressão de E-caderina e p120ctn foram observadas restringida à membrana da célula em célula-célula adherens junções em H460 e H1299 células, ao passo que ambos foram confinados no citoplasma em células de CCP e LK2.

diferentes funções de p120ctn isoforma 1A em EMT são dependentes de e-caderina localização subcelular

Knockdown de endógena p120ctn isoforma 1A por siRNA-p120ctn-1A resultou na diminuição da expressão de e-caderina e aumentou N-caderina, caracol e expressão de vimentina em células H460 (Figura 3A). No entanto, knockdown da endógena p120ctn-1A por siRNA-p120ctn-1A mostraram resultados opostos em células SPC, onde encontramos um aumento da expressão da caderina-E e diminuição da N-caderina, caracol e expressão vimentina (Figura 3B). Em comparação com o controlo, a ablação de p120ctn isoforma 1A também melhorada a capacidade de invasão de células H460 (17,33 ± 1,25 vs 36,33 ± 1,70,

P

0,01) (Figura 3C), enquanto que reduziu a capacidade de invasão de células de CCP (23,0 ± 0,82 vs 13,0 ± 0,82,

P Art 0,01) (Figura 3D). Estes resultados revelaram que a p120ctn isoforma 1A desempenha um papel diferente na EMT e invasão celular em diferentes localizações subcelulares E-caderina.

(A) Ablação de p120ctn isoforma 1A diminuição da expressão da caderina-E e aumento da N-caderina, caracol e vimentina expressão em células H460. (B) células SPC foram tratadas como em (A) e os resultados opostos foram obtidos. (C) A ablação de p120ctn isoforma 1A melhorada a capacidade de invasão de células H460 (**

P

0,01). (D) Ablação de p120ctn isoforma 1A diminuiu a capacidade de invasão das células SPC (**

P Art 0,01).

função inibitória de p120ctn isoforma 3A na EMT não é afetada pela diferenças de e-caderina localização subcelular

Para verificar se p120ctn isoformas 1A e 3A desempenhar diferentes papéis na regulação do EMT, os plasmídeos de expressão foram transitoriamente transfectados em células de câncer de pulmão com baixa expressão de p120ctn (H1299 com membrana de e-caderina expressão e LK2 com citoplasmática expressão da caderina-e). A análise de Western-blot demonstrou que a sobre-expressão da isoforma p120ctn 1A levou a um aumento da expressão de E-caderina e N-caderina diminuiu, vimentina e expressão de caracol (Figura 4A); Pelo contrário, a expressão de E-caderina diminuiu e aumentou N-caderina, vimentina e expressão caracol foram observados em células LK2 (Figura 4B). A sobre-expressão da isoforma p120ctn 1A também reduziu a capacidade de invasão de células H1299 (52,0 ± 2,65 vs 33,33 ± 2,64,

P

0,01) (Figura 4C), enquanto que aumentaram a invasividade de células LK2 (18,0 ± 0,82 vs. 39,66 ± 2,05,

P

0,01) (Figura 4D) .. a sobre-expressão da isoforma 3A p120ctn levou a um aumento da expressão de e-caderina, diminuiu N-caderina, vimentina e expressão de caracol (Figura 4A, 4B) e reduzida capacidade de invasão celular (52,0 ± 2,65 vs. 29,66 ± 1,53,

P Art 0,01; 18,0 ± 0,82 vs. 8,33 ± 0,47 expressão,

P Art 0,01) (Figura 4C, 4D ) em ambas as linhas celulares. Estes resultados confirmam ainda que a isoforma p120ctn 1A teve um efeito diferente sobre EMT dependendo da localização sub-celular de caderina-E. Eles também revelou que a isoforma 3A p120ctn mantido um papel inibitório na EMT de células de cancro pulmonar quer de E-caderina foi localizada na membrana ou no citoplasma.

(A, B) Ambos H1299 (membrana de E-caderina células de localização) e LK2 (e-caderina localização citoplasmática) transfectadas transientemente com o plasmídeo 3A p120ctn isoforma mostrou aumento da expressão de e-caderina e N-caderina diminuiu, vimentina e expressão de caracol. (C, D) transfecção transitória de plasmídeos 3A p120ctn isoformas em células H1299 e LK2 resultou numa diminuição da capacidade de invasão de células (**

P

0,01). (E) de E-caderina permaneceram localizados na membrana em células H1299 e no citoplasma das células LK2 após a transfecção do plasmídeo p120ctn isoforma 3A.

Discussão

O fenómeno de EMT em células de tumor muitas vezes leva à diminuição da adesão celular e mobilidade aumentada, e esta transição é acompanhada pela diminuição da expressão de e-caderina e aumento da expressão de N-caderina, vimentina e outros biomarcadores mesenquimais [3], [4], [5], [ ,,,0],6], [7]. Como um factor importante para a estabilização de E-caderina, p120ctn desempenha um papel na inibição ou promoção da proliferação de células tumorais e invasão que é dependente do facto de E-caderina é expressa ou não [16], [17]. Além disso, p120ctn isoformas 1A e 3A mostram diferentes efeitos sobre a expressão de E-caderina e invasividade de células de tumor que são baseadas em diferenças na localização da E-caderina [18]. Estes resultados sugerem fortemente que p120ctn provavelmente regula a EMT de células tumorais por afectar a expressão da caderina-E e que p120ctn isoformas 1A e 3A jogo diferentes papéis na EMT expressando E-caderina em diferentes localizações subcelulares.

Em primeiro lugar temos encontrado que a expressão membrana p120ctn foi positivamente correlacionada com a expressão da caderina-e e negativamente correlacionada com a expressão de vimentina e metástases em linfonodos, enquanto a expressão citoplasmática de p120ctn foi negativamente correlacionada com a expressão da caderina-e e positivamente correlacionada com a expressão de vimentina e metástases em linfonodos por imuno-histoquímica . Embora estes resultados foram consistentes com estudos anteriores [13], [14], eles sugeriram ainda que p120ctn provável afecta o EMT, influenciando a expressão de E-caderina e vimentina e assim a invasão de células e de metástases do cancro do pulmão de células não pequenas ( NSCLC).

Para confirmar os diferentes impactos da p120ctn isoformas 1A e 3A na EMT em células que expressam e-caderina em locais diferentes, foram selecionados células H460 e H1299 com expressão membrana e-caderina e células SPC e LK2 com E-caderina citoplasmática expressão para análise posterior. Os plasmídeos que expressam o p120ctn isoformas 1A e 3A foram construídos, e o comprimento total p120ctn siARN foi sintetizado para estas experiências. Uma vez que a sequência de aminoácidos 1-101 além de p120ctn isoforma 1A é semelhante ao da isoforma 3A p120ctn [24], [25], não poderíamos conceber uma sequência de interferência especificamente para 3A p120ctn isoforma. Por isso, tivemos que estudar ainda mais o impacto das duas isoformas de EMT e invasão celular em células de câncer de pulmão com diferentes localizações E-caderina especificamente ao derrubar p120ctn isoforma 1A em H460 e células SPC com alta expressão p120ctn e transfecção de plasmídeos de cDNA para exógena p120ctn isoformas 1A e 3A em células H1299 e LK2 com baixa expressão de p120ctn.

Knockdown de p120ctn isoforma 1A em células H460 destruiu os complexos de adesão de células epiteliais. A expressão da E-caderina também foi regulada negativamente devido à perda do seu factor de estabilização importante, p120ctn isoforma 1A, o que foi consistente com estudos anteriores [20], [26]. Diminuição da expressão de E-caderina e interrompido a adesão célula-célula pode induzir EMT [27], [28], [43], [44], o que resulta em aumento da N-caderina, vimentina e expressão caracol e invasividade celular aumentada. Por outro lado, p120ctn overexpressed isoformas 1A e 3A mostrou ligar-se a E-caderina localizado na membrana de forma proactiva em células tumorais [29] e, em seguida, inibem a degradação de E-caderina e estabilizar a sua expressão, contribuindo para a formação de epitélio eficaz complexos de adesão celular [30], [31], [32]. Como estas séries de processos mantida a ligação adesão célula-célula normais e inibiu EMT, houve um aumento da expressão de E-caderina e N-caderina diminuiu, vimentina e expressão do caracol, bem como a capacidade de invasão de células inibidas em células H1299.

estudos anteriores demonstraram que, embora p120ctn isoforma 1A poderia ligar E-caderina no citoplasma, não podiam formar complexos de adesão eficazes na membrana entre as células epiteliais [33]. Além disso, o citoplasmática E-caderina é provavelmente não ser o full-length E-caderina, mas fragmentos de caderina-E, em vez clivados, tais como E-cad /SE-cad (80 kDa) e E-cad /CTF2 (33 kDa) [34]. O fragmento /CTF2 E-cad se pode ligar a p120 no citoplasma e, em seguida, se translocam para o núcleo e ligar o repressor transcricional de Kaiso para activar a via Wnt /b-catenina [35], [36], Finalmente promover a EMT de tumor células e melhorando a invasão de células e metástase [37]. Além disso, outros autores demonstraram que p120ctn-1A está relacionado com a expressão anormal de E-caderina e prognóstico pobre [38]. Estes estudos ilustrado que o citoplasmática p120ctn isoforma 1A pode desempenhar um papel na promoção de EMT de células tumorais, invasão e metástase. Com base no acima, observou-se, por um lado, que o efeito de p120ctn isoforma 1A para promover EMT de células de tumor, invasão e metástases, iria ser levantada por sua ablação, resultando num aumento da expressão de E-caderina, diminuiu N-caderina, vimentina e expressão caracol e invasão inibida em células SPC. Por outro lado, a transfecção do plasmídeo 1A p120ctn isoforma em células que expressam LK2 citoplasmática E-caderina resultou numa diminuição da expressão de E-caderina, o aumento da N-caderina, vimentina e expressão caracol e invasividade celular aumentada. Embora o papel preciso dos p120ctn durante a indução de EMT ainda não clarificada é, estudos anteriores sugeriram que knockdown de todas as isoformas de p120ctn poderia induzir indirectamente EMT [27], [28], [43], [44]. Todas as induções foram baseados em diminuição da expressão de E-caderina e adesão intercelular em estudos anteriores, que também foram confirmados pelo nosso estudo em células H460 com a localização da membrana E-caderina. Ao contrário das células H460, knockdown da isoforma p120ctn 1A em células de CCP com E-caderina citoplasmática expressão não podiam diminuir a expressão de E-caderina e adesão intercelular. Em vez disso, encontramos um aumento da expressão da caderina-E e diminuição da capacidade de invasão celular, indicando que a EMT não poderia ser induzida por esta via em células SPC.

Foi interessante notar que o mesmo resultado foi observado em células LK2 e H1299 transfectadas com o plasmídeo 3A p120ctn isoforma, ambos mostrando um aumento da expressão da caderina-e, diminuição da N-caderina, vimentina e caracol expressão e capacidade de invasão celular inibido. Estes resultados sugeriram que a isoforma p120ctn 3A tem a função de inibir EMT de células de cancro do pulmão, e esta função é independente da localização celular E-caderina. Pesquisas anteriores também havia confirmado uma mudança de p120ctn isoforma 3A a p120ctn expressão 1A isoforma após a indução da EMT [9], [10], [11], o que indiretamente indica que p120ctn 3A isoforma pode inibir EMT enquanto isoforma p120ctn 1A promove EMT. Além disso, notamos também que p120ctn e E-caderina níveis de expressão de proteína foram aumentou significativamente após a transfecção do plasmídeo p120ctn-3A em células LK2 e H1299, mas p120ctn e E-caderina ainda estavam restritas principalmente à membrana celular na célula-célula junções aderentes de células H1299. Em contraste, a E-caderina e p120ctn foram quase exclusivamente localizada no citoplasma em células LK2 (Figura 4E). Tal como uma molécula de adesão celular, a E-caderina é conhecida por ser apenas localizada na membrana celular com o potencial para inibir EMT, enquanto no citoplasma, é muitas vezes clivado em fragmentos e, portanto, funciona de forma diferente a partir das moléculas localizadas na membrana da célula [ ,,,0],34]. Assim, a E-caderina citoplasmática teoricamente não teria um papel na inibição da EMT. Com base na análise acima, podemos especular que pode haver alguma interação entre 3A p120ctn isoforma e caracol que desempenha um papel na supressão da EMT em células de câncer de pulmão expressar citoplasmática E-caderina, mas esta hipótese requer um estudo mais aprofundado.

importante, também descobrimos que knockdown de p120ctn-1A em células SPC com citoplasmática E-caderina resultou na diminuição da expressão de torção (Figura 3B). Enquanto isso, a transfecção de células LK2, que também mostraram localização citoplasmática de caderina-E, com o plasmídeo 1A p120ctn isoforma resultou num aumento da expressão de torção (Figura 4B). No entanto, não há alterações na expressão de torção foram observados no resto das experiências (Figura 3A, 4A). Como um regulador do fator de transcrição e gene mestre de EMT [39], [40], torção pode regular negativamente a expressão da caderina-E [41] e upregulate N-caderina e outros biomarcadores mesenquimais [42].