Abstract

Fundo

mutações por deslocação do quadro de instabilidade de microssatélites alta (MSI-alta ) cancro colorectal são uma fonte potencial de neo-antígenos segmentáveis. Muitos transcrições sem sentido estão sujeitos à degradação rápida devido à deterioração mediado por mutações nonsense (NMD), mas transcrições sem sentido com um CMS no último exão ou próximo a última junção exão-exão têm resistência intrínseca à deterioração mediado por mutações nonsense (NMD). transcrições-resistentes NMD são, portanto, uma provável fonte de proteínas mutantes expressos em tumores MSI-alta.

Métodos

Usando anticorpos para o N-terminais conservada de proteínas mutantes previstos, analisamos MSI de alta linhas celulares de cancro colorrectal para exemplos de proteínas mutantes expressos naturalmente que derivam de mutações frameshift no microssatélites de codificação (CMS) através de imunoprecipitação e as experiências de Western Blot. Detectadas bandas de proteínas mutantes de transcritos-resistentes NMD foram ainda validado pelo ARN curto interferente (siRNA) knockdown específico para o gene. Uma pesquisa do genoma foi realizada para identificar CMS contendo genes susceptíveis de gerar NMD resistente transcrições que poderiam codificam para antigênica expressa proteínas mutantes em cancros MSI-alto do cólon. Estes genes foram rastreados para mutações CMS em linhas celulares de cancro do cólon MSI-alta.

Resultados

bandas de proteína mutante de peso molecular esperado foram detectados em linhas celulares de MSI-alto mutados para resistente NMD transcrições (CREBBP, EP300, TTK), mas transcrições não NMD-sensíveis (BAX, CASP5, MSH3). Expressão do mutante CREBBP e proteínas EP300 foi confirmada por siRNA knockdown. Cinco genes CMS-rolamento identificados a partir da pesquisa de genoma e sem dados de mutação (SFRS12IP1, MED8, ASXL1, FBXL3 e RGS12) existente foram encontrados para ser mutado em pelo menos 5 dos 11 (45%) das linhas celulares de MSI-alto testado.

Conclusão

transcrições resistentes-NMD pode dar origem a proteínas mutantes expressos em células cancerosas MSI-alta cólon. proteínas mutantes se comumente expressa em cancros do cólon MSI-alto primários, MSI-derivados poderia ser útil como câncer específica alvos imunológicos em uma vacina visando tumores do cólon MSI-alta

Citation:. Williams DS, Pássaro MJ, Jorissen RN , Yu YL, Walker M, Zhang HH, et ai. (2010) Nonsense Mediated Decay As mutações resistentes são uma fonte de proteínas mutantes Expresso em Colon linhas celulares de cancro com instabilidade de microssatélites. PLoS ONE 5 (12): e16012. doi: 10.1371 /journal.pone.0016012

Autor: Ben C. B. Ko, Universidade Chinesa de Hong Kong, Hong Kong

Recebido: 24 de agosto de 2010; Aceito: 03 de dezembro de 2010; Publicação: 31 de dezembro de 2010

Direitos de autor: © 2010 Williams et al. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Licença Creative Commons Attribution, que permite uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o autor original ea fonte sejam creditados

Financiamento:. Este projecto foi parcialmente financiado pela NHMRC Programa Bolsa número 487922. o apoio financeiro para este trabalho também foi fornecido por um CASS (Contribuição para Scholarship Australian Science) Fundação Ciência e Medicina Grant (DSW, AWB, ECN), o Conselho Victoria Câncer (PT) e uma Royal College of Pathologists de Australasia Kitamura /Memorial Award Kanematsu e Assistência Grant Técnica (DSW). Este trabalho também foi apoiado por fundos do Programa de Apoio à infra-estrutura operacional fornecido pelo Governo de Victoria, Austrália. Os financiadores não tiveram nenhum papel no desenho do estudo, coleta de dados e análise, decisão de publicar ou preparação do manuscrito

CONFLITO DE INTERESSES:.. Os autores declararam que não existem interesses conflitantes

Introdução

Aproximadamente 15% dos colorretal, câncer gástrico e do endométrio têm defeito de reparo incompatível DNA e instabilidade de microssatélites de alto nível (MSI-alta) [1], [2]. A maioria dos tumores MSI-alto resultar de hipermetilação esporádica do promotor do gene MLH1 [3], mas a mutação de uma enzima DNA mismatch reparação é o defeito subjacente em casos de cancro colorectal hereditário não poliposo (HNPCC) [4]. Os tumores com MSI tem uma forma de instabilidade genética que se manifesta como mutações frameshift em sequências repetitivas microssatélites de DNA [1]. mutações frameshift na codificação microssatélites (CMS) alterar o quadro de leitura genética e na maioria dos casos codificam para proteínas truncadas com sequências proteicas únicas C-terminal.

Uma característica patológica intrigante de cânceres colorretais MSI-alto é uma tendência a ter aumento do número de tumor infiltrando linfócitos (TIL) em relação ao MSI-Low e microssatélites estável (MSS) tumores [5]. O TILs em tumores MSI-alto são activados linfócitos T CD8 + citotóxicos (CTL) [6], adaptados para reconhecer péptidos intracelulares, tais como neo-antigénios MSI-derivados, apresentados por moléculas de HLA de classe I. Um fenótipo MSI-alta e aumento da TIL em um câncer colorretal conotar uma melhor correspondência estágio prognóstico em relação aos tumores MSI-Low ou MSS [7], [8]. Esta vantagem de sobrevivência pode reflectir um benefício de protecção do infiltrado imune [9].

péptidos sintéticos correspondentes às proteínas mutantes preditos para surgir a partir de mutações frameshift MSI-associados têm demonstrado ser imunogénica. Ao longo da última década, de linfócitos T citotóxicos (CTL) respostas foram descritos em relação a HLA-A2 péptidos que derivam de mutações frameshift no A10 cms de TGFBR2 [10], [11], o A10 cms de CASP5 [12], o T10 de ligação cms de OGT [13] e, recentemente, o T15 cms de U79260 (FTO) [14]. As respostas de CTL para as proteínas mutantes foram detectados em pacientes com cancros do cólon MSI associados e em transportadores HNPCC-mutação saudáveis, levantando a possibilidade de vigilância imunológica protectora na segunda população [15].

Não é publicado dados disponíveis para mutação pelo menos 1522 codificação mononucleotídicos microssatélites de 460 genes em cancro colorectal MSI-alto [16]. Existe uma correlação entre o comprimento CMS e taxa de mutação. Genes com mutações CMS são potenciais fontes de proteínas segmentáveis ​​para estratégias de terapia imune. Uma vez que mutações frameshift afectar CMS repetições de uma forma previsível, as proteínas mutantes gerados são susceptíveis de ser conservada numa população de pacientes com cancros do cólon MSI-alto [17], [18]. Embora não um mutante de transcrição é comum a todos os tumores MSI-alto, uma vacina que tem como alvo um conjunto de proteínas vulgarmente mutada pode ser um tratamento eficaz para o cancro do cólon MSI-alto. Existe uma necessidade de novas terapias contra o cancro do cólon MSI-alto, uma vez que vários estudos têm demonstrado que estes tumores resistentes a agentes quimioterapêuticos convencionais, tais como 5-fluorouracilo [19], [20], [21].

a existência de proteínas mutantes MSI-derivados foi inferido por estudos imunológicos, mas há uma falta de dados publicados sobre a detecção directa das proteínas mutantes derivados MSI-preditos. As análises de Western blot foram publicados no qual bandas de proteínas mutantes potenciais foram detectados para a CREBBP, EP300 [22] e genes MBD4 [23], mas não houve bandas validação destes. Confirmação da expressão das proteínas mutantes em tumores MSI-alto é importante que estes possam ser alvos terapêuticos bem sucedidas para uma vacina. A expressão estável de proteínas mutantes que facilita a apresentação de antigénios tumorais transversal pelas células apresentadoras de antigénios profissionais e estimula uma resposta T helper é susceptível de proporcionar imunidade anti-tumoral de [18]. No entanto, as transcrições mais mutantes gerados pela MSI são direcionados para a rápida degradação pela decadência mediado por mutações nonsense (NMD) [24], [25] e na ausência de intervenção, pouca ou nenhuma proteína mutante targetable serão gerados a partir destes transcritos aberrantes [24 ].

neste estudo, foram detectadas três proteínas mutantes MSI-derivados, os quais surgem a partir de transcrições resistentes ao NMD. Depois de investigação de todo o genoma para transcritos resistentes-NMD adicionais, CMS-contendo genes foram rastreados para mutações num painel de 11 linhas celulares de cancro do cólon MSI-alta. foram seleccionados genes para a análise de mutações na base da provável frequência de mutação (com base no comprimento CMS), provavelmente imunogenicidade (com base no mutante C-terminal de comprimento de aminoácidos) e expressão provável no cancro do cólon (com base em dados do gene e da proteína quando disponíveis ). transcrições-resistentes NMD comumente mutados foram avaliados para * 0201 epítopos provável HLA-A CTL usando

in silico

software preditivo, SYFPEITHI [26], por comparação com epitopos MSI derivados já demonstrou ser imunogênica

em vitro

.

Nossos resultados confirmam que os transcritos resistentes ao NMD dar origem a proteínas mutantes expressas e também mostram que comumente ocorrem mutações frameshift que geram NMD resistente transcrições são uma fonte promissora de antígenos tumorais segmentáveis ​​na MSI- cancros alta cólon. Um conjunto de proteínas mutantes comumente expressas tem o potencial para formar a base para uma vacina multivalente ou imunoterápico alvejando tumores MSI-alta.

Resultados

linhas celulares de cancro do cólon MSI de alta abrigar mutações frameshift em múltiplos CMS

o rastreio das linhas de células cancerígenas do cólon para proteínas de reparo de DNA incompatibilidade expressão aberrante revelou um fenótipo anormal consistente com MSI em 11 de 17 linhas de células (Tabela 1). As linhas celulares foram avaliadas quanto a mutações frameshift numa selecção de genes com CMS previamente relatado para desenvolver mutações em cancros do cólon MSI-alto. Numerosos mutações consistentes com um fenótipo MSI-alta foram detectadas em cada linha celular com expressão aberrante de reparação de emparelhamentos incorrectos do ADN por imuno-histoquímica, mas poucas mutações Se algum foi detectado nos restantes linhas celulares (Tabela 2, Tabela S1). Supressão de um par de bases de DNA foi a mutação mais comum, respondendo por 82% (214/262) das mutações observadas neste estudo (prováveis ​​mutações bialélicos contado como 2 mutações). A maioria das mutações frameshift codificam para proteínas truncadas de baixo peso molecular com um C-terminal mutado (Tabela 3).

proteínas mutantes MSI derivados detectáveis ​​são expressos por transcrições resistentes-NMD

Para detectar proteínas mutantes expressos, adquirimos anticorpos para a porção N-terminal conservado de proteínas selecionadas. Inicialmente estudou uma seleção de genes mutados comumente relatados como potenciais “genes alvo” [1]. experiências de transferência de Western de lisados ​​de células inteiras e imunoprecipitados das linhas celulares genotipados identificadas as bandas de proteína correspondentes ao peso molecular esperado para a proteína Bax normal (Figura 1), MSH3 e CASP5 proteínas (dados não publicados), em linhas de células com alelos não mutado destes genes . No entanto, não há bandas de proteínas mutantes foram detectados por qualquer um destes genes. No caso de BAX geramos anticorpos policlonais de coelho para um péptido sintético correspondente ao terminal C mutado. Estes anticorpos mostraram ligação específica ao péptido mutante sintético em Biacore, ensaios ELISA e Western blot, mas não se detectar uma banda de proteína BAX mutante em lisados ​​de células inteiras ou imunoprecipitados de BAX mutado linhas celulares (dados não publicados). Mutações em BAX, MSH3 e CASP5 todos codificam para NMD-sensível (NMD-S) transcrições mutantes; mutante BAX e MSH3 são conhecidos por serem susceptíveis à degradação [27]. NMD-sensibilidade poderia explicar a nossa incapacidade para detectar quaisquer proteínas mutantes resultantes a partir destes três genes, embora proteína anormal dobrável com perda dos epítopos de anticorpo pode também ser um factor

.

(A) normal de proteína BAX (21 kDa , seta), mas não a proteína mutante BAX (previu 6,4 kDa) foi detectada em análises de Western Blot em lisados ​​de células inteiras de linhas celulares de cancro do cólon. As linhas celulares com estado de mutação BAX G8 CMS: 1. LoVo (-1, +1), 2. SW480 (TP), 3. HCA7 (-1, peso), 4. LS174T (-1), 5. HCT116 (- 1, em peso), 6. HeLa (em peso), 7. LIM1215 (-1). (B) mutação de base -1 homozigótica no CMS G8 na linha celular LS174T (superior) em relação à linha de células não-mutado, SW1222 (inferior) (de sequenciação de DNA reverso). proteína (C) normal BAX (seta), mas não a proteína mutante BAX detectada por imunoprecipitação: 1. HeLa (em peso), 2. LS174T (-1). IgG de cadeia leve de 25 kDa.

Por isso, procurou detectar proteínas mutantes resultantes de transcrições resistentes ao NMD (NMD-R). dados de Western blot publicados anteriormente mostraram potenciais bandas de proteína mutante do CREBBP e EP300 genes, cada um resultante de um heterozigoto (-1, tipo selvagem) mutação frameshift de 5 mer CMS repete no último exão, detectado no LoVo (CREBBP) e linhas celulares HCT116 (EP300), respectivamente [22]. Foi confirmada a presença destas mutações em LoVo e linhas de células HCT116 por PCR e sequenciação de ADN. Estes CMS não estavam mutados em qualquer uma das outras linhas celulares MSI-alto ou MSS. As bandas correspondentes aos pesos moleculares esperados da CREBBP normal e proteína EP300 foram consistentemente detectados em análises de Western blot de linhas celulares não mutado. Foram detectadas bandas de proteínas anormais correspondentes aos pesos moleculares esperados das CREBBP mutante e EP300 mutante na LoVo e linhas celulares HCT116, respectivamente, em Western Blots em lisados ​​de células inteiras (Figura 2) e em imunoprecipitados (Figura S1). Nossa blot combinados os dados publicados anteriormente para EP300 [22]. Os dados CREBBP anteriores combinados uma região de bandas não específicas no nosso blot, mas bandas de proteína de peso molecular apropriado também estavam presentes em nossos borrões. As bandas CREBBP também foram detectados em experiências em que foi utilizado um anticorpo para um imunoprecipitação e um anticorpo para um epítopo diferente CREBBP foi usada para a detecção.

proteínas normais (setas brancas) e proteínas mutantes (seta preta) foram detectados no Western Blot análises sobre lisados ​​de células inteiras para (a) CREBBP e (B) EP300. (A) CREBBP C5 CMS: 1. SW480 (em peso), 2. LoVo (-1, em peso), 3. HCT116 (em peso), 4. LIM1215 (em peso), 5. LS174T (em peso). MW (kDa): 265 em peso, Mut 209. (B) EP300 A5 CMS: 1. LoVo (em peso), 2. HCT116 (-1, em peso), 3. HCA7 (em peso), 4. LIM1215 (em peso), 5 . LS174T (em peso). MW (kDa): peso 223, mut 187.

Validação das proteínas mutantes

Para confirmar a identidade das bandas de proteínas anormais e provar que estes representam exemplos genuínos do esperado proteínas mutantes, que inicialmente realizada a espectrometria de massa tandem em imunoprecipitados das linhas celulares. Esta técnica confirmou a identidade do CREBBP normal e as bandas de proteína (Figura EP300 S1), validando assim a especificidade dos anticorpos utilizados. As proteínas mutantes não foram detectados por este método, possivelmente devido à co-imunoprecipitação de proteínas mais abundantes de peso molecular semelhante, tais como MYH9 (dados não publicados). A especificidade das bandas de proteínas mutantes foi confirmada utilizando em vez pequeno ARN interferente (siRNA) para executar knockdowns genes específicos do CREBBP mutante e proteínas EP300. Redução da expressão da proteína mutante CREBBP em relação aos controlos não transfectadas e não-alvo correlacionada com uma diminuição significativa no ARNm alvo, confirmada por qRT-PCR (Figura 3). Knockdown da proteína EP300 mutante foi demonstrada de modo semelhante em imunoprecipitados (Figura 4). Estes resultados confirmam que as bandas de proteína detectadas anormais são variantes mutadas de proteínas CREBBP e EP300. Esta descoberta indica que certas proteínas mutantes MSI-derivados são naturalmente expressos a níveis detectáveis.

Especificidade da banda de proteína mutante foi confirmada por knockdown específicos de gene em transfectantes de siRNA CREBBP segmentação. (A) A detecção da banda de proteína mutante (seta preta) em lisados ​​de células inteiras de linha celular LoVo, mas a proteína normal apenas (seta branca) na linha de células SW480 não mutado. (B) Western Blot de LoVo lisados ​​celulares inteiro de siRNA SmartPool transfectantes mostram diminuição da expressão de (seta branca) normal e banda de proteína mutante (seta preta) CREBBP em lisados ​​CREBBP-alvo (pista 1). controle de beta-catenina carregamento (seta cinza) 92 kDa. (C) Intensidade relativa do normal (azul) e mutantes bandas (vermelho) CREBBP proteína comparativamente com as células não transfectadas (PBS). (D) A diminuição da expressão de ARNm de CREBBP em transfectantes CREBBP siRNA (pista da esquerda) em relação a células não transfectadas (pista da direita).

Especificidade da banda de proteína mutante confirmado por knockdown específicos de gene em transfectantes de siRNA alvejando EP300. de dados (A) qRT-PCR para avaliar siRNAs segmentação EP300 (melhor knockdown usando P300-1 e P300-3). (B-C) Diminuição da proteína mutante EP300 detectado em Western Blot análises sobre imunoprecipitados de EP300 siRNA transfectantes em relação aos controles untransfected (PBS).

Detecção de potenciais bandas de proteínas mutantes adicionais

em outras experiências de Western Blot (Figura 5), ​​as bandas de proteína TTK mutantes foram detectados em várias linhas celulares mutadas a um nível ligeiramente mais elevado peso molecular (101 kDa) do que a proteína não mutada TTK (97 kDa), consistente com o tamanho previsto (Tabela 3) . As tentativas de siRNA knockdown de TTK mutante foram impedidos pela dificuldade em resolver as bandas de proteínas mutantes e normais. Uma banda AIM2 foi detectada a cerca de 46 kDa em Western blots em imunoprecipitados de lisados ​​de células inteiras, o tamanho detectado consistente em estudos anteriores usando este anticorpo [28]. AIM2 proteína foi detectada em várias linhas de células não mutado e também em células LoVo homozigóticos mutantes AIM2. As proteínas mutantes e de tipo selvagem AIM2 são de pesos moleculares previstos semelhantes (39 kDa e 40 kDa, respectivamente). Porque transcritos resistentes-NMD muitas vezes têm um CMS no último exão perto da extremidade C-terminal, as proteínas mutantes, muitas vezes, ser de tamanho similar a proteínas normais. Isso faz com que a validação destas bandas de proteínas mutantes através de técnicas utilizadas para confirmar a CREBBP e EP300 bandas mais difícil.

(A) em análises de Western blot de lisados ​​de células inteiras identificadas uma banda de proteína TTK potencial mutante (seta preta) em múltiplos linhas celulares mutadas e proteína TTK normal (seta branca), apenas em linhas não mutado: 1. LIM1863 (wT), 2. HCA7 (em peso), 3. LIM1899 (-1, em peso), 4. HCT116 (-1, em peso ), 5. LoVo (-1, em peso), 6. LIM2537 (-1, em peso), 7. LIM2551 (-1, em peso). TTK MW (kDa): 97 em peso, Mut 101. (B) análises de Western blot em imunoprecipitados de lisados ​​de células inteiras identificadas uma banda de proteína AIM2 (seta preta) em todas as linhas celulares, incluindo a linha celular LoVo mutante homozigótica: 1. (SW480 em peso), 2. LoVo (-1), 3. HCT116 (-1, em peso). 4, LS174T (em peso). AIM2 MW (kDa):. Peso 39,0, 40,4 mut

bandas de proteína mutante não foram detectados em todas as transcrições-resistentes NMD avaliados. No caso de ACVR2A, bandas de proteína foram detectadas com os pesos moleculares esperados para ambos normal e mutante de proteína, mas de uma forma não específica que não se correlacionam com os dados de mutação. Várias bandas de proteínas foram detectadas em borrões para TCF7L2, um gene com inúmeras transcrições de splicing alternativo [29], mas não foram identificadas proteínas mutantes que se correlacionaram com os dados de mutação.

Pesquisa Genome-wide para transcritos resistentes ao NMD como uma fonte de proteínas segmentáveis ​​

Tendo estabelecido que os transcritos resistentes ao NMD pode dar origem a proteínas mutantes MSI derivados expressas, buscou-se identificar genes adicionais CMS contendo susceptíveis de gerar proteínas mutantes expressas em cancros MSI-alto cólon que poderiam servir como alvos terapêuticos. Usando uma estratégia de bioinformática, foi realizada uma busca em todo o genoma para o CMS contendo genes com base em critérios previsto para codificar para transcrições mutantes NMD-irrelevantes [24], que são intrinsecamente NMD-resistentes (Tabela S2). Foram identificados 1.511 mononucleótido não redundante CMS repete ≥7 mer de comprimento (incluindo genes hipotéticos) previsto para gerar transcrições mutantes resistentes ao NMD. Isso se compara com 17.654 mononucleótido CMS (≥6 mer) identificada (independentemente do seu estatuto NMD) em um estudo anterior [17].

foram selecionados genes para análise de mutação CMS com base em critérios de selecção que possam ser importantes para utilidade como uma proteína segmentado. Nós limitado o estudo para o 316 mononucleótido CMS repete ≥8 mer de comprimento, uma vez que existe uma correlação entre o comprimento de microssatélites e frequência de mutação provável. taxas significativas de mutação ( 40%) foram relatadas por cerca de 8 repetições mer [16]. Os genes com sequências curtas preditos neo-C-terminais da proteína ( 10 aminoácidos) foram excluídos, uma vez que estes são susceptíveis de gerar epítopos de células T úteis para uma variedade de tipos de HLA comuns, como é necessário para ultrapassar a restrição MHC. Excluindo genes hipotéticos (LOC prefixo ou KIAA), 179 cms contendo genes satisfeito nossos critérios de selecção (Tabela S3). Evidência para a expressão da proteína em cancros do cólon dos genes seleccionados também foi procurado como um critério de seleção adicional para indicar expressão provável das proteínas mutantes. A proteína de humano de ‘Atlas [30] inclui a expressão da proteína que mostra os dados em cancros colo-rectais por imuno-histoquímica. No entanto, esses dados não estão disponíveis para muitos genes, devido à dependência de IHC sobre a disponibilidade de anticorpos adequados. Portanto, perfil de expressão gênica de dados também foi utilizado para identificar genes com os mais altos níveis de expressão de mRNA com base em dados de dois estudos [31], [32] da MSI e MSS cancros do cólon (Figura S2).

genes selecionados (Tabela 4) foram rastreados para mutações CMS em um painel de 5 MSI e 1 linhas celulares MSS e um painel posterior de 6 linhas celulares MSI foi testado se a tela inicial revelou quaisquer mutações CMS. Três genes (SFRS12IP1, MED8 e ASXL1) foram mutados em 6/11 (55%) de MSI de alta linhas celulares e dois genes (e FBXL3 RGS12) foram mutados em 5/11 (45%). Também foram identificados vários genes com taxas de mutação menores (Tabela S4).

In silico

análise epitopo para resistente ao NMD transcrição derivada proteínas mutantes

Para ser útil como alvos de vacinas /imunoterapia terapêuticas, as proteínas mutantes necessidade de gerar CTL identificados epítopos para tipos de HLA comuns.

In silico

análise utilizando o software disponível ao público, tais como SYFPEITHI foi previamente identificados novos epitopos CTL que foram posteriormente validados em ensaios funcionais [26]. Para identificar quais MSI-derivado proteínas mutantes são susceptíveis de ser imunogénico, avaliou-se as proteínas mutantes resultantes de transcritos-resistentes NMD para potenciais HLA-A * 0201 epitopos. HLA-A * 0201 é o tipo de HLA mais frequente, presente em cerca de 50% da população [33]. pontuações SYFPEITHI são baseadas em motivos comuns para conhecidos epítopos que ocorrem naturalmente vinculativo. De acordo com as diretrizes de pontuação SYFPEITHI, um epitopo expresso naturalmente deve estar entre os top 2% de todas as pontuações de peptídeos avaliados em 80% dos casos [26]. Foram avaliados mutante C-terminais resultantes de mutações NMD-R comuns (Tabela S5) e a parte superior 2% de HLA-A * 0201 foram determinados SYFPEITHI contagens geradas a partir das proteínas de ligação mutantes (Tabela 5). Os peptídeos de alto escalão tinha SYFPEITHI pontuação variando de 23-31 vinculativo. Estas pontuações são comparáveis ​​às contagens de ligação de * 0201 epitopos cancerosas 135 conhecido HLA-A CTL [26], incluindo os 4 epítopos MSI-derivados publicados, que têm uma pontuação média de 24 e uma média de 23,4 (Tabela S6).

Com base disponível relataram taxas de mutação CMS para EPHB2, TTK e RGS12 (C8), uma vacina incluindo estas três proteínas mutantes irá incluir pelo menos um provável HLA-a * 0201 epitopo para 69% dos pacientes ( 1- (1-41%) x (1-27%) x (1-28%)). Além disso HLA-A * 0201 foram identificados epitopos de vários genes (TMEM97, ASXL1, SFRS12IP1, RGS12 (A9), RTKN2) com mutações comuns neste estudo, indicando que a segmentação também estes genes podem alargar a HLA-A * 0201 cobertura. Algumas mutações raras (por exemplo NTAN1, RAPH1) também produzem epítopos imunogénicos que não iria fornecer ampla cobertura da população, mas também pode valer a pena alvo em pacientes selecionados.

Discussão

A instabilidade de microssatélites dá origem a previsível mutações frameshift envolvendo o CMS de muitos genes. As proteínas mutantes resultantes destas mutações são uma fonte lógico de antigénios específicos de tumores que podem ser responsáveis ​​para tanto a presença de TILs e aumentou o melhor prognóstico associada com um fenótipo MSI-alta. Este conceito é apoiado por uma descoberta recente de uma correlação entre a densidade do infiltrado imune e o número de mutações frameshift CMS detectados num conjunto dos cancros do cólon MSI-Alto [34]. Temos validado pelo menos dois exemplos (CREBBP e EP300) de proteínas mutantes naturalmente expressos em linhas celulares de cancro MSI-alta cólon, ambos resultantes de transcrições resistentes ao NMD. Esses achados confirmam que transcrições resistentes-NMD pode gerar proteínas mutantes expressos naturalmente MSI derivados [34], [35]. O CMS repete em CREBBP e EP300 são curtos e improvável de ser mutado em uma alta proporção de tumores MSI-alta. No entanto, é provável que algumas mutações resistentes NMD comuns, tais como TTK também irá gerar proteínas mutantes segmentáveis ​​em MSI-alto cancros. A nossa estratégia de todo o genoma para identificar transcritos resistentes NMD imunogênicas identificou cinco mutações romance CMS (SFRS12IP1, MED8, ASXL1, FBXL3, RGS12) em pelo menos 45% das linhas celulares de cancro onze MSI-alta cólon testados. análise de mutações em uma série maior de cancros MSI-alta cólon primários permitirá às frequências de mutação destes potenciais alvos terapêuticos a ser determinada com mais precisão.

In vitro

estudos identificaram respostas de CTL a sintética peptídeos mutantes resultantes de mutações comuns CMS, utilizando células mononucleares do sangue periférico de pacientes com câncer de cólon MSI [10], [11], [12], [13], [14], [36] e curiosamente, também em indivíduos saudáveis ​​com HNPCC [15]. Estes estudos mostraram que as proteínas mutantes específicos do tumor podem estimular

In vitro

imunidade de células T e suportam o conceito de uma estratégia de vacinação. O publicada HLA-A * 0201 epitopos CTL para TGFBR2 [10], [11], CASP5 [12], OGT [13] e U79260 (FTO) [14] toda surgir a partir de transcrições mutantes NMD-sensíveis. NMD experiências de inibição demonstraram que o mutante TGFBR2 é um dos transcritos mais regulada positivamente, com 10 vezes o aumento da expressão de mRNA em um estudo [27], [37]. A resposta das células T conflito com o impacto esperado do NMD mediante a expressão da proteína mutante. Um estudo mostrou que a proteína de transfecção TGFBR2 mutante é detectável em transfectantes de cDNA mutante (NMD-resistentes), mas não mutante ADNg (NMD-sensível) [35]. Nós não detectar proteínas mutantes de transcrições NMD-sensíveis (BAX, CASP5 e MSH3). No entanto, é um processo de NMD-tradução dependente [24] e de baixo nível de expressão da proteína mutante da primeira ronda de tradução pode ser suficiente para estimular respostas imunológicas. CTL pode mostrar sensibilidade apurada a um ligando peptídico /HLA específico, com complexos de péptido /MHC tão poucos como 3-alvo são suficientes para a lise celular CTL específicos do

in vitro

[38]. As respostas humorais a proteína mutante TGFBR2 foram identificados por ELISA, mas apenas uma minoria (10%) dos pacientes MSI-alto de cancro do cólon [39].

Um benefício de transcritos resistentes-NMD como uma fonte de segmentáveis proteínas mutantes é que os antigénios tumorais expressos de forma estável podem ser multi-apresentado ao sistema imunitário por células dendríticas para estimular CTL e respostas de células T auxiliares [40]. Apresentação cruzada é provável resultar em imunidade anti-tumoral superior e transcritos resistentes-NMD como uma fonte de proteínas mutantes segmentáveis. Um ensaio de fusão do gene relatado uma correlação significativa entre a expressão das proteínas mutantes transfectadas MSI-derivados e transversal apresentação de antigénio de ovalbumina co-expressa [18]. Para genes com proteína detectável negligenciável, alguns moderados a fortes respostas de CTL foram detectados, mas sem apresentação cruzada [18]. Uma limitação do ensaio de transfecção é que as construções de ADNc mutantes foram usadas e, portanto, as experiências não avaliar o impacto de NMD sobre a expressão da proteína mutante. A nossa abordagem supera esta através da detecção direta da expressão da proteína mutante. Um ensaio de transfecção modificado exigindo splicing natural do C-terminal também poderia identificar alvos para vacinação biologicamente relevantes.

NMD-inibição experiências identificaram algumas transcrições “NMD-escape” que resistem parcialmente degradação devido ao NMD [27], . MBD4 está previsto gerar um transcrito de NMD-sensível, mas uma banda de proteína anormal fraco tem sido relatada em análises de Western blot de linhas celulares mutadas MBD4. Isto pode representar a expressão da proteína mutante MBD4 devido ao NMD-escape [23]. transcrições NMD-de fuga pode ser uma fonte útil de proteínas alvo, mas estes são incapazes ser previsto e mais trabalho é necessário para determinar qual transcrições NMD-escape produzir proteínas mutantes segmentáveis. Estratégias que interferem com NMD sem inibir a tradução da proteína deve causar uma regulação positiva generalizada em transcrições mutantes NMD-sensíveis, desmascarando uma gama de antigénios tumorais. Esta abordagem poderia complementar uma vacina alvejando tumores MSI-alto, ampliando a gama de alvos imunológicos disponíveis além transcrições resistentes-NMD. NMD-inibição por siRNA alvejando de genes reguladores NMD SMG1 ou UPF2 foi recentemente mostrado capaz de induzir protecção

In vivo

respostas imunitárias a células tumorais transfectadas com um antigénio alvo NMD-sensíveis [41].

A nossa confirmação da expressão da proteína mutante por tumores MSI-alta podem ter aplicações clínicas importantes. Uma vacina de segmentação proteínas mutantes comummente expressa tem sido proposta como uma estratégia promissora para o tratamento de MSI-alto tumores [15], [18], [34], [42]. Com alvos suficientes, a vacinação pode ser possível desde que as proteínas mutantes foram expressos, epítopos antigénicos são gerados e a apresentação de antigénio é funcional. É necessário mais trabalho para determinar qual proteína mutante respostas imunes podem conferir um benefício de sobrevivência para pacientes com tumores MSI-alta. As proteínas mutantes segregadas para o soro poderia servir como biomarcadores úteis para a detecção precoce de tumores MSI-elevado, em particular na população afectada HNPCC. Tais biomarcadores seria um complemento útil ao rastreio colonoscopia, uma vez que cancros colo MSI-alto têm uma propensão para adenomas intervalo e desenvolver tumores no período entre colonoscopias de rastreio [43], [44]. A natureza comum, previsível e específicos do tumor de proteínas mutantes MSI derivados os torna candidatos ideais como alvos terapêuticos ou marcadores de diagnóstico.

Materiais e Métodos

As linhas celulares e cultura

linhas celulares de cancro colorectal LIM foram estabelecidas a partir de biópsias de tumores do Instituto Ludwig para Pesquisa do Câncer (LICR) Melbourne ramo, como descrito anteriormente: LIM1215 [45], LIM1899 [46], LIM1863 [47], LIM2463 [48] e (LIM2099, LIM2405, LIM2408, LIM2537, LIM2550 e LIM2551) [49]. As linhas de células LIM foram estabelecidas a partir de câncer colorretal, tanto esporádica e familiar [49] e pode ser obtido a partir CellBank Austrália (www.cellbankaustralia.com) ou a partir do Melbourne Ramo LICR a conclusão de um acordo de transferência de materiais acadêmicos padrão. células de cancro colorectal SW1222 foram fornecidos pelo Ludwig Institute for Cancer Research, New York Branch, (Nova Iorque, Nova Iorque) e as células de cancro colo-rectal HCA7 foram obtidos a partir da European Collection of Cell Cultures (Porton Down, Reino Unido). b. c. d.