Abstract

subclassificação histológica de câncer de pulmão de células não pequenas (NSCLC) tem cada vez mais impacto terapêutico. Em estágios avançados de câncer de amostras de tecido são geralmente bioptically recolhidos. Estas pequenas amostras são de valor extraordinário desde análises moleculares estão ganhando importância para terapias direcionadas. Por isso, estudou a viabilidade, a precisão do diagnóstico, os efeitos económicos e prognósticos de um tecido poupadores ensaio multi-anticorpo simultânea para subclassificação do NSCLC. De 265 tecidos pacientes múltiplas matrizes NSCLC (TMA) foram construídas para simular amostras de biópsia. TMAs foram coradas por um bi-color ensaio multi-anticorpo simultânea consiste em TTF1, Vimentin, p63 e neuroendócrinas marcadores (CD56, cromogranina A, sinaptofisina). Classificação foi baseada principalmente na actual proposta da IASLC com uma árvore de decisão hierárquica para subclassificação em adenocarcinoma (LAC), carcinoma de células escamosas (SCC), grande carcinoma neuroendócrino de células (LCNEC) e NSCLC não especificado de outra forma. Investigação da heterogeneidade do tumor mostrou uma variação inferior explícita para análises imuno-histoquímica em comparação com a classificação convencional. Além disso, a análise de sobrevivência de nossa classificação imunohistoquímica combinada revelou separação distinta da curva de sobrevivência de cada entidade. Este foi estatisticamente significativa para subgrupos terapeuticamente importantes (p = 0,045). Como teste morfológica e molecular do câncer está surgindo, o nosso ensaio multi-anticorpos em combinação com a classificação padronizada proporciona separação precisa e confiável de diagnósticos histomorfológicas. Além disso, ele permite subtipos clinicamente relevante do NSCLC incluindo LCNEC. O nosso ensaio de multi-anticorpo pode, por conseguinte, ser de especial valor, especialmente no diagnóstico de pequenas biópsias. Ele futher proporciona informação prognóstica substancial com consequências terapêuticas. Integração dos subtipos imuno-histoquímica incluindo a investigação de diferenciação neuroendócrina em classificação histopatológica padrão de NSCLC deve, portanto, ser considerado

Citation:. Kayser G, Csanadi A, Otto C, Plönes T, Bittermann N, Rawluk J, et al . (2013) Simultaneous Multi-Coloração de anticorpos em Non-Small Cell Lung Cancer Fortalece a precisão do diagnóstico Especialmente em pequenas amostras de tecido. PLoS ONE 8 (2): e56333. doi: 10.1371 /journal.pone.0056333

editor: Marc Lenburg, Boston University Medical Center, Estados Unidos da América

Recebido: 18 Agosto, 2012; Aceito: 08 de janeiro de 2013; Publicação: 13 de fevereiro de 2013

Direitos de autor: © 2013 Kayser et al. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Licença Creative Commons Attribution, que permite uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o autor original ea fonte sejam creditados

Financiamento:. O estudo foi apoiado financeiramente pela Deutsche Forschungsgemeinschaft, SFB 850. os financiadores não tiveram nenhum papel no desenho do estudo, coleta de dados e análise, decisão de publicar ou preparação do manuscrito

Conflito de interesses: os autores declararam que nenhum existem interesses conflitantes.

Introdução

o câncer de pulmão apresenta a maior mortalidade global de doenças malignas em seres humanos em todo o mundo [1], [2]. Apesar de enormes progressos na medicina moderna, as taxas de mortalidade em câncer de pulmão ainda estão em um estado estável que reflete a necessidade urgente de agentes quimioterápicos direcionados poderosas no tratamento desta doença generalizada. Entre a separação de cancro do pulmão de pequenas células (SCLC) e cancro do pulmão de células não pequenas (NSCLC), este último pode ser ainda subclassificados de acordo com a sua aparência morfológica em três grupos principais: os adenocarcinomas (ALC), carcinomas de células escamosas (SCC) e carcinomas de grandes células (LCC). Ao lado de morfologia diferente estudos recentes revelaram diferenças biológicas entre os subtipos histológicos NSCLC. Estes incluem diferentes padrões de expressão de ARN-m e proteínas imuno-histoquimicamente detectáveis, tais como a timidilato sintetase (TS). TS, envolvidos em mecanismos de reparação do ADN, é um dos principais alvos de pemetrexed e significativamente maior expressa em SCC em comparação com LAC e LCC. Scagliotti et ai. poderia mostrar que os pacientes que sofrem de LAC e beneficiar LCC da quimioterapia à base de platina em combinação com pemetrexed. Em contraste, os pacientes SCC beneficiar de uma combinação de platina com gemcitabina [3]. Baseia-se principalmente sobre este estudo, as recomendações para subtipagem exata de NSCLC foram introduzidos em diretrizes nacionais de câncer de pulmão [4] – [6]. O dilema para os patologistas neste cenário é, por um lado, a classificação atual da OMS introduzido em 2004. De acordo com a OMS, subclassificação do NSCLC tem que ser feita principalmente pela hematoxilina-eosina (H E) manchas. Devido a muitas vezes extensa heterogeneidade do tumor, espécimes de ressecção são exigidas para um diagnóstico definitivo, também [2]. Por outro lado, essas diretrizes de tratamento prevalecem para pacientes avançados UICC-fases IIIB e IV [3]. Desses pacientes, normalmente, apenas amostras de tumores pequenos são reunidos, geralmente, por biópsia, mediastinoscopy ou mesmo aspiração com agulha fina. Assim, o patologista precisa basear seu /sua decisão diagnóstica em manchas especiais de imunohistoquímica adicionais. Entre outros, especialmente um factor de transcrição da tiróide (TTF1) e haste marcador de células escamosas p63 são recomendados em primeira linha [7] – [9]. Desde material de tumor a partir de pequenas biópsias é muito escassa, técnicas poupando o tecido tem que ser desenvolvidos para lidar com material de diagnóstico menor para um maior número de investigações de diagnóstico. Além disso, como a quantidade de investigações moleculares necessários para terapia-alvo está crescendo rapidamente, as considerações econômicas devem também ser tidos em conta aquando da introdução de novas técnicas. Baseado principalmente em conjuntos marcador publicados, Sterlacci [10] e Yamagita [11] recentemente publicados protocolos de coloração de casal e um cocktail de anticorpos disponíveis comercialmente, respectivamente. No entanto, ao lado LAC e SCC, carcinoma neuroendócrino de grandes células (LCNEC) representa outro subentity de NSCLC com consequências terapêuticas. Em estudos recentes, tornou-se cada vez mais evidente que são biologicamente LCNEC intimamente relacionado com SCLC [12], [13]. Propõe-se para administrar pacientes LCNEC combinações de quimioterapia em analogia com SCLC [14]. Na estratégia de diagnóstico e subtipos NSCLC, LCNEC deve por esses meios ser incluídos. Mediante este pano de fundo foi investigado benefício de um ensaio de coloração multi-anticorpo simultânea recentemente desenvolvido em uma coorte grande e bem caracterizado de pacientes com NSCLC.

Materiais e Métodos

Ética declaração

o estudo foi aprovado pelo Hospital Universitário de Freiburg (EK 10/12). Em concordância com esta decisão desta comissão de ética todos os dados relativos paciente foram utilizados apenas de forma pseudônimo. Os resultados obtidos por este estudo não influenciar o tratamento do paciente. O material de parafina foram arquivados pelo menos 3 anos após o diagnóstico inicial. Devido a esses pré-requisitos, por decisão da comissão de ética, sem o consentimento escrito de cada paciente tinha de ser obtida.

Pacientes e TMA construção

265 pacientes, operados entre 1 de Janeiro

st 1990 e 31 de Dezembro

st 2007, no Serviço de Cirurgia Torácica, Hospital Universitário de Freiburg, foram escolhidos a partir da base de dados do Instituto de Patologia, Hospital Universitário de Freiburg. Ao lado NSCLC primário, critérios de inclusão foram o acesso ao tumor suficiente e tecido pulmonar não-neoplásica. A seleção dos pacientes foi realizada cego para evitar preconceitos resultantes de estágio do tumor e /ou subtipo histológico. Operação espécimes foram fixados em formalina a 4% tamponado durante 24 a 48 horas. Bilheteria procedimento e inclusão em parafina seguidos protocolos de rotina. Todos os blocos de parafina portadores de tumor foram recuperados a partir do arquivo. Após a nova H E seções todos os tumores foram reclassificados de forma independente por três patologista experiente (GK, AC, MW) de acordo com a classificação atual da OMS [2]. Nenhum resultado de coloração imuno-histoquímica tinham sido tomados em consideração para esta reclassificação. 5 casos discordantes e difíceis foram, de novo, revisado e discutido em comum. Com a presença de critérios da OMS, o consenso foi definido para análises posteriores. TNM-estágios foram uniformemente reavaliados após a actual classificação UICC (7

th edition) [15]. Para eliminar preconceitos, reclassificação histológica e UICC reestadiamento de todos os casos foram realizados antes dos procedimentos de imuno-histoquímica e sua avaliação. De todos os pacientes, dados clínico-patológicas, incluindo tabagismo e sobrevida global foram disponíveis (tabela 1).

Tissue multi-matrizes (TMA) foram construídos tomando três núcleos de cada tumor aleatoriamente de três diferentes áreas distantes. diâmetro do núcleo era de 2 mm. Em H E coradas secções de TMA todos os núcleos foram avaliados quanto à presença de padrões de crescimento glandular ou escamosa distintas que estes classificadas como LAC ou SCC, respectivamente. TMA núcleos falta padrões de crescimento específicos foram diagnosticados como NSCLC não especificadas (NOS).

imuno-histoquímica (IHQ)

Duas seções espessas micrômetro do TMA foram montadas em lâminas de vidro revestidas (Superfrost plus) , desparafinados e reidratadas em uma linha de álcool descendente. Para a recuperação de antigénio, as lâminas foram incubadas em tampão de citrato (pH 6,1) durante 2 minutos, utilizando uma panela de pressão. O tempo de incubação para os primeiros anticorpos primários, vimentina (clone VIM3B4) e TTF1 (clone 8G7G3 /1), foi de 30 minutos à temperatura ambiente. A incubação com o primeiro anticorpo secundário biotinilado seguido por 15 minutos. A activação e a visualização foi realizada por fosfatase alcalina estreptavidina acoplada (AP /estreptavidina; DAKO sistema de detecção real AP /vermelho, K5005 código). A segunda parte da mancha de multi-anticorpo consistia de um anticorpo primário dirigido contra p63 (clone 4A4) e um cocktail de anticorpos neuroendócrino segmentação cromogranina A (clone DAK-A3), sinaptofisina (clone SY38) e CD56 (clone 1B6). O tempo de incubação para estes anticorpos foi de 30 minutos. Um polímero de dextrano conjugado com peroxidase de rábano com moléculas de anticorpo acoplado, foi aplicado e coloração foi realizada por incubação com 3’3′-diamino-benzidina (DAB; DAKO imaginar FLEX +, código 8012). Finalmente, as lâminas foram contrastadas com hematoxilina. O procedimento de coloração foi realizada em um Autostainer Dako para todos os slides (detalhado passo-a-passo protocolo documento S1).

Avaliação do multi-anticorpo ensaio

Na sinopse com o padrão de crescimento histológica um diagnóstico histológico-IHC combinada para cada núcleo foi feita em concordância com as diretrizes IASLC propostas [9]: por este meio, os padrões de crescimento glandulares claras definidas LAC independente da expressão de marcadores de IHC. O mesmo foi definido para SCC, se ceratinization e /ou intercelulares pontes estavam presentes. Nos tumores sem definitiva H morfológica E-diagnóstico, avaliação de expressão IHC-marcador seguido este algoritmo hierárquico: 1) expressão TTF1: LAC positiva, negativa: 2) expressão p63: SCC positiva, negativa: 3) expressão de marcadores neuroendócrinos: LCNEC , negativo: NSCLC NOS (figura 1). Vimentina serviu como um marcador substituto para avaliar a arquitectura do estroma, bem como do estado de fixação do tecido, desde a sua robustez na qualidade de coloração. Cada marcador foi avaliada de forma independente, enquanto nuclear específica apenas distintas (TTF1 e p63) ou citoplasmático (vimentina, cromogranina A e sinaptofisina) e membranoso (CD56) com, pelo menos, moderada a forte em intensidade na maioria superior a de células tumorais foram considerados positivos para diagnóstico propósitos.

Para a avaliação final do tumor, um diagnóstico de consenso combinando todos os três núcleos TMA foi feito. Em concordância com a corrente Classificação OMS [15], câncer, se os núcleos de TMA não foram diagnosticados, por unanimidade, foi classificada como LAC para a combinação de LAC e NSCLC NOS, e como SCC para a combinação de SCC e NSCLC NOS. A combinação de LAC ou SCC com LCNEC foi agrupado em LCNEC. Se ambos, LAC e SCC, foram diagnosticados em diferentes núcleos TMA de um paciente estes foram classificados como misto LAC /SCC. Como a interpretação deste perfil de expressão IHC não está claramente definida na proposta IASLC e apenas 5 pacientes agrupados em que, nestes casos foram excluídos da análise de sobrevivência.

Estatísticas

Correlação entre os diferentes anticorpos foi avaliada por cálculo do coeficiente de correlação de Kendall b-tau. confiabilidade do diagnóstico dos diferentes anticorpos para IHC algoritmo de classificação das NSCLC foi julgado por cálculos curvas características (ROC) e área sob a curva operacional do receptor (AUC). diferenças Inter-core, bem como concordância diagnóstica entre H E-classificação de espécimes de ressecção e definitiva combinado classificação morfológica-IHC foram analisados ​​pelo cálculo do kappa de Cohen e V de Cramer, respectivamente. A análise de sobrevida foi realizada de acordo com Kaplan-Meier. testes de log-rank serviu para avaliar a significância estatística. O tempo de seguimento foi avaliada até 120 meses. Conforme publicado e internacionalmente aceite [16] – [19] 15 pacientes que morreram dentro de 30 dias da cirurgia foram excluídos da análise de sobrevivência para excluir viés resultante da mortalidade peri-operatória neste estudo de acompanhamento de longo prazo. Todas as análises estatísticas foram realizadas utilizando o pacote de software SPSS 17. alfa nível de significância estatística foi definido para 5% para todos os testes.

Resultados

Não há interações inter-anticorpos são observados

A fim de avaliar as possíveis interações entre os diferentes anticorpos utilizados , um conjunto de teste de 10 NSCLC e sondas de tecido de pulmão não neoplásicas foi corada usando o ensaio de multi-anticorpo. As secções em série de este conjunto de testes foram coradas utilizando apenas um dos anticorpos incluídos no protocolo de coloração multi-anticorpo. Revendo estas secções, em todas as amostras não há diferenças nos padrões de coloração pode ser detectada entre cada um único anticorpo e o protocolo multi-anticorpo (Figura 2). Para avaliar possíveis reações cruzadas do segundo sistema de detecção (DAB-based) com o primeiro aplicado anticorpo primário (vimentina e TTF1), que manchou o conjunto de teste omitir o segundo cocktail anticorpo primário (p63, CD56, cromogranina A e Sinaptofisina). Estas secções só revelou coloração cromogénio vermelho para vimentina e TTF1, nenhuma reação cruzada com o sistema de detecção baseado DAB marrom foi observado (figura S1.). Além disso, nas análises, incluindo toda a coorte que não poderia detectar qualquer correlação estatística positiva entre os anticorpos utilizados para cada método de detecção cromogénica, i. e. TTF1 e vimentina para AP /Estreptavidina e p63 eo coquetel neuroendócrino para DAB. Pelo contrário, p63 e expressão de marcadores neuroendócrinos mostraram uma correlação negativa significativa (p 0,001; coeficiente de correlação -0,300; Kendall-tau-b). correlação negativa significativa também pode ser detectado para TTF1 e p63 (p 0,001; coeficiente de correlação -0,262; Kendal-tau-b). Nenhum outro correlações entre anticorpos positivos ou negativos foram detectados. Estes resultados suportam ainda que os padrões de coloração e avaliação de cada anticorpo não sejam comprometidas por fundo potencial de coloração ou reações cruzadas cromogénio. No entanto, nuclear e /ou citoplasmática positividade dupla refletindo coloração específica para ambos os antígenos, i. e. TTF1 combinado com p63 e vimentina combinados com marcadores neuroendócrinos, respectivamente, ainda são claramente distinguíveis (figura S2).

o tecido de pulmão normal (A), ALC (B), SCC (C) e LCNEC (D) corado com o ensaio combinado de multi-anticorpo (em cima) e cada anticorpo incluído único. núcleos vermelhos – TTF1; citoplasma vermelho – vimentina; núcleos marrom – p63; citoplasma marrom – marcadores neuroendócrinos. Abaixo do bi-color ensaio IHC correspondente ensaios de anticorpos individuais são exibidos na mesma área do tumor. Comparação de cada coloração de anticorpos único e do ensaio de anticorpo de multi bi-color mostra positividade específica analógico nas mesmas celas e não revela qualquer coloração de fundo inespecífica ou reatividade cruzada cromogênico.

TTF1 e p63 são marcadores úteis para a avaliação da diferenciação da linhagem

a classificação atual da OMS propõe H e de classificação de espécimes de ressecção como padrão-ouro de câncer de pulmão [2]. A esse respeito, pode-se observar uma sensibilidade e especificidade de TTF1 de reconhecimento de LAC em um intervalo entre os três núcleos TMA de 80,4% para 84,6% e 70,6% para 76,9%, respectivamente. Avaliando p63 como um marcador para a diferenciação escamosa, sensibilidade foi calculada a partir de 62,1% para 66,7%, enquanto a especificidade variou entre 84,0% e 90,8%. Estes números são comparáveis ​​com a literatura atual em que estes dois marcadores são recomendados para ser usado em pequenas biópsias para investigação da linhagem diferenciação [8], [9]. Isso também se reflete no corte relações claras de ímpares (figura S3) e as análises ROC-AUC (figura S4; tabela S1). Ambos, TTF1 e p63 revelou resultados altamente significativos para a classificação de LAC e SCC, respectivamente (p 0,001; Tabela S1). Como esperado, os valores da AUC foram maiores no algoritmo de classificação de IHC em comparação com H E de classificação de amostras de ressecção (Tabela S1). Neste contexto também observamos uma correlação negativa significativa entre a expressão de TTF1 e p63 (total: p 0,001; coeficiente de correlação de -0,262; Kendall-tau-b)

heterogeneidade intratumoral é menos proeminente nos marcadores IHC. em comparação com os padrões de crescimento morfológico

a heterogeneidade da morfologia do tumor é conhecido por ser elevado em NSCLC nós incluídos três núcleos TMA de cada tumor. Esses núcleos foram colhidas aleatoriamente área de tumor relativa a excluir viés morfológica. Como publicado e internacionalmente aceite, a análise de cada núcleo de TMA pode ser assumido comparável à análise de biópsias de tumores na patologia de diagnóstico de rotina [20], [21]. No que diz respeito aos caminhos de diagnóstico na histopatologia, classificamos em primeiro lugar cada núcleo TMA em uma rotina H E mancha. Para a avaliação de Kappa intra-tumoral /inter-núcleo heterogeneidade de Cohen foi calculada para a H E de classificação, bem como para o algoritmo de classificação combinada morfológica-IHC. No geral, o kappa-valores observados pode ser interpretada como, de acordo com boa correlação para todos os algoritmos de classificação. Contudo, os resultados obtidos para a classificação IHC combinados foram sempre, pelo menos, tão bom quanto para a H E inter-núcleo variação (tabela 2). Atualmente, algoritmos IHC são exclusivamente recomendado para biópsias que não têm padrões de crescimento específicos e, portanto, são classificados como NSCLC NOS. Relativamente a esta recomendação, valores de kappa foram calculados separadamente para os casos em que pelo menos um núcleo TMA foi classificada como NSCLC NOS sobre H E morfologia. Dentro destes casos, kappa-valores para H E de classificação só mostrou fraca correlação passo que a classificação IHC atingiu valores de boa correlação inter-núcleo (tabela 2). Análise dos padrões de coloração imuno-histoquímica em combinação com os padrões de crescimento histológicos para a classificação de NSCLC, portanto, apresenta menor variabilidade intratumoral de classificação das NSCLC com base em H . E morfologia, sozinho

IHC adicionais analisa elevar a precisão diagnóstica em relação ao convencional com H e de classificação

após a H e morfologia dos núcleos de TMA entre 130 e 142 núcleos de cada um dos três conjuntos de núcleo TMA não podia ser classificada em padrões distintos de crescimento. Estes qualificado como NSCLC NOS. Combinando os três núcleos a um diagnóstico de consenso 48 (18,1%) foram classificados como NSCLC NOS, 14 dos quais expressaram marcadores neuroendócrinos e, portanto, foram diagnosticados como LCNEC. Em contraste com H E de classificação, utilizando o algoritmo de IHC combinado apenas 13 tumores (4,9%) expressaram nem TTF1 nem p63 nem neuroendócrinos marcadores e, por conseguinte, foram classificados como NSCLC de NOS (Tabela 3). Para definir concordância de diagnóstico de cada núcleo com TMA reclassificação histológica da peça de ressecção V de Cramer foi calculada para cada núcleo classificadas por H E e o ensaio de multi-anticorpo. Apesar de que se poderia verificar um significado alta estatística para a correlação de diagnóstico convencional de espécime ressecção com H diagnóstico de E, bem como a classificação IHC, respectivamente, conforme global foi sempre mais elevada, adicionando a informação de nosso ensaio multi-anticorpo (tabela 3) . Isto não só é reflectida numa percentagem mais elevada de casos corretamente classificados, mas também em um valor mais alto para o V de Cramer (tabela 3).

Inclusão de marcadores neuroendócrinos no painel IHC rotina proporciona definição clara de LCNEC

Expressão de marcadores neuroendócrinos foi considerado se, pelo menos, um núcleo TMA expressa coloração específica. Comparação de presença e ausência de expressão do marcador neurendocrine não teve impacto na sobrevida do paciente analisando toda a coorte (p = 0,208). Isso também era verdade em análises de sobrevivência para a ALC (p = 0,690) e SCC (p = 0,207). Por outro lado, investigando os NSCLC não tendo características morfológicas adenóide ou escamosas distintas nem expressar TTF1 ou p63, sendo assim classificado como NSCLC NOS, expressão de marcadores neuroendócrinos de fato revelou uma separação distinta das curvas de sobrevida obtidos com uma tendência estatística (p = 0,095; Figura S5). Na avaliação morfológica, todos esses casos LCNEC mostrou adicionalmente, os padrões de crescimento neuroendócrinos. Pelo uso do combinado LCNEC classificação IHC pode, portanto, ser diagnosticado de forma sofisticada e padronizada.

classificação morfológica e multi-anticorpo combinados em melhora significado clínico das NSCLC subtipos

comportamento biológico diferente de doenças malignas é geralmente refletida em diferentes resultados em longo prazo follow-up. Para avaliar se existe uma melhor estratificação usando um histológica combinados e classificação IHC, realizamos análises de sobrevivência para ambas as classificações, i. e. convencional H E morfologia de espécimes de ressecção e algoritmo de classificação morfologia-IHC combinado. Convencional, H classificação baseada E da nossa coorte resultou em perto paralelo Kaplan-Meier curvas de sobrevida (p = 0,904; Figura 3). Por outro lado, a qualificação morfologia-IHC dá uma separação clara das curvas de sobrevivência de cada entidade com uma tendência estatística (p = 0,088, Figura 3). Combinando LAC e NSCLC NOS acordo com a consequência terapêutica em “carcinoma não-escamosas” e comparando-os com SCC ea sobrevida global LCNEC foi significativamente diferente entre os dois grupos de pacientes (p = 0,045, figura 3).

subtipos de NSCLC foram diagnosticado por H e de amostras de ressecção (a) e pelo algoritmo de classificação de IHC combinada (B). classificação adicional IHC separa entidades histológicas distintas, sugerindo comportamento biológico diferente. Agrupando as diferentes entidades de acordo com conseqüências terapêuticas (C e D), nenhuma diferença na sobrevivência são evidentes por convencional H E classificação de espécimes de ressecção (C), enquanto que a classificação IHC combinada separa significativamente as diferentes curvas de sobrevida (p = 0,045; D) .

Bi-color ensaio multi-anticorpo economiza tecido e recursos económicos

O protocolo utilizado aqui para classificar imunohistoquímica NSCLC é constituído por uma mancha simultânea com 6 anticorpos diferentes. Assim, a quantidade de tecido necessário para a caracterização de biópsias NSCLC compreende apenas 16,7% em comparação com a necessária para 6 ensaios de anticorpos individuais. Consequentemente, apenas 1/6

th de sildes de vidro e lamelas são necessários. Uma vez que o protocolo utiliza misturas de anticorpos de TTF1 e vimentina, assim como p63, em combinação com o cocktail neuroendócrino, são necessários 1/3

rd de coloração e os reagentes de bloqueio. O mesmo vale para os frascos de detecção cromogénicos. Em nossa instituição, as despesas para reagentes são calculados a 3.30 €, mais adicionais de 0,20 € para a lâmina de vidro por mancha IHC. Em números por caso, isso resulta em um montante total de 6,80 € para o nosso ensaio multi-anticorpo em comparação com 21,80 € para 6 protocolos de anticorpos individuais. Assim, a utilização do nosso ensaio de multi-anticorpo conserva-se a 68,8% das despesas de reagentes de laboratório.

Devido ao procedimento doublestaining no entanto, o tempo total necessário para completar o protocolo leva aproximadamente 4 horas, em comparação com 1,5 a 2 horas para manchas de anticorpos individuais. Mas, como o protocolo pode ser facilmente estabelecido em máquinas automáticas de coloração imunohistoquímica, nenhum efeito negativo sobre a carga de trabalho dos técnicos de laboratório ocorre. Pelo contrário, a automação de coloração é prolongada e os técnicos podem realizar tarefas mais complexo e moroso, durante este procedimento. Além disso, o tempo para a classificação de slides é completamente omitido.

Para o patologista diagnosticar apenas um slide precisa ser avaliada. Por este meio, todos os padrões de coloração IHQ pode ser avaliada em paralelo e ainda mais importante nas mesmas células. lâminas microscópicas não precisa ser mudado e áreas de diagnóstico não deve ser realocados. Como os tempos de avaliação de diagnóstico em patologia de diagnóstico são muito variáveis, a quantidade de tempo economizado usando nosso ensaio multi-anticorpo só pode ser estimado. De acordo com as nossas experiências do ensaio multi-anticorpo economiza cerca de dois terços do tempo necessário para a avaliação das 6 manchas de anticorpos individuais correspondentes.

Discussão

O câncer de pulmão é a principal causa de morte Entre todas as doenças malignas [1], [22]. Embora tenha havido avanços na terapia do câncer moderna, as taxas de mortalidade de pacientes com NSCLC não mudaram significativamente nas últimas décadas [1], [2], [22]. Com o desenvolvimento da investigação em gestão de câncer personalizado, vários biomarcadores têm sido atribuídos um valor preditivo para os agentes específicos quimioterápicos [23] – [27]. Scagliotti et ai. descrito um benefício de gemcitabina num regime quimioterapêutico à base de platina para os pacientes que sofrem de NSCLC avançado se histologia mostrou uma diferenciação escamosa predominante. Além disso, os pacientes cuja histologia mostrou uma diferenciação LAC predominante apresentaram maior benefício se dado pemetrexed [3]. Consequentemente, as recomendações para regimes quimioterápicos estão agora baseada na diferenciação histológica das NSCLC e foram implementados em várias diretrizes nacionais de tratamento de NSCLC [4] – [6]. Na classificação atual da OMS, tipo histológico de câncer de pulmão é 1), em grande parte baseado no padrão H E coloração e 2) requer exame histopatológico de espécimes de ressecção, especialmente tendo em conta que quase 50% dos cancros do pulmão apresentam mais do que uma grande subtipo histológico [2]. Por outro lado, o trabalho de Scagliotti baseia-se num grupo de doentes com NSCLC diagnosticada em estágios avançados UICC IIIB e IV. Aqui, do tipo histológico tem que ser feita em pequenas amostras de tecido, como amostras de ressecção principalmente não estão disponíveis nestes pacientes. Portanto, os marcadores e os painéis de IHC têm sido propostos por vários autores para subtipos do NSCLC [8], [28], [29]. Entre estes, TTF1 para a detecção de glandular e p63 para diferenciação escamosa parecem ser os marcadores mais confiáveis ​​para subclassificação do NSCLC [8], [9]. Por estas razões, escolhemos TTF1 e p63 como marcadores de diferenciação linhagem em NSCLC, e estabelecido um caminho de diagnóstico combinando os padrões de expressão de morfologia e IHC convencionais em analogia com a proposta do [9] IASLC. Ultimamente, a proteína p63 truncado DeltaNp63 (P40) foi descrito para ter uma especificidade mais elevada para diferenciação escamosa em comparação com a proteína de comprimento completo [XPath ERROR:. Desconhecido variável “start2”], [31]. Mas, ambos os antigénios de p63 de comprimento completo e DeltaNp63, tem a mesma sensibilidade para o carcinoma de células escamosas [30], [31]. Uma vez que a expressão de p63 é diagnosticamente avaliada após TTF1 (figura 2), pode presumir-se que ambos os anticorpos que dão os mesmos resultados da classificação no nosso ensaio de multi-anticorpo. Para incluir LCNEC, que expandiu o nosso painel de anticorpos não só com vimentina, que pode servir como um marcador para o carcinoma sarcomatoide [8], mas também com marcadores neurendocrine (CD56, sinaptofisina, cromogranina A). A positividade de um ou mais destes marcadores é necessário para o diagnóstico de diferenciação neuroendócrina [2]. A fim de poupar o tecido finita de material BIOPTIC, foi implementado com sucesso um ensaio de coloração multi-anticorpo bi-color que permite não só a coloração simultânea de 6 anticorpos na mesma secção de tecido, mas também a avaliação simultânea verdadeira. Para demonstrar que não há interferências entre os anticorpos, vários experimentos de validação foram feitas: Um conjunto de teste foi corado com nosso ensaio multi-anticorpo e cortes seriados foram corados com cada anticorpo, individualmente. Aqui, não há diferenças nos padrões de coloração ou reações fundo Cromógena pôde ser observado (figura 2, figura S1). Para investigar possíveis cruzada coloração por o segundo sistema de detecção com base em DAB o ensaio foi realizado no conjunto de teste enquanto omitir o segundo anticorpos primários (p63, cromogranina A, sinaptofisina, CD56). Se os locais de ligação livres e /ou acessíveis dos primeiros anticorpos foram existente, estes seriam visíveis em cor castanho. Revendo as lâminas coradas, essas experiências provam que todos os locais de ligação dos primeiros anticorpos primários (vimentina, TTF1) são bloqueadas pelo sistema de detecção com base AEC-DAB como nenhuma coloração castanha foi visível (figura S1). Nem poderíamos elucidar qualquer correlação positiva entre os anticorpos a ser visualizado pelo mesmo método de detecção cromogénica. Se houvesse coloração de fundo, seja nuclear ou citoplasmática de marcadores que levam à falsa interpretação correspondente, este teria sido refletida em correlações estatísticas positivas. Pelo contrário, foram detectados correlação negativa estatisticamente significativa de p63 com marcadores neuroendócrinos, bem como com TTF1. Recentemente, Sterlacci et al estabelecida manchas dupla constituída por TTF1 /CK7, p63 /CK5 /6 e TTF1 /CK5 /6 para a classificação de NSCLC e revelou resultados semelhantes aos nossos [10]. Yanagita et ai. publicaram um ensaio de multi-anticorpo disponível comercialmente, contendo 4, anticorpos TTF1, napsina A, p63 e CK5 /6 [11]. Estes cocktails de anticorpos previamente estabelecidos revelar-se útil, mas servem apenas para distinguir LAC do SCC. A possibilidade de investigar para LCNEC não é tomado em consideração. No entanto, especialmente esta entidade de LCNEC não só habita um prognóstico infavourable, mas regimes quimioterapêuticos semelhantes aos utilizados em SCLC tem que ser considerado [14]. Na literatura actual, LCNEC são apenas para ser diagnosticado se NSCLC mostram padrões neuroendócrinas de crescimento em combinação com a expressão de pelo menos um dos marcadores CD56 neuroendócrinos, cromogranina A sinaptofisina ou [2].