Abstract

Fundo

periostina é uma proteína de matriz extracelular importante envolvida no desenvolvimento de células e aderência. Anteriormente, foram identificados periostina de ser up-regulada no cancro da próstata agressivo (PAC) usando glicoproteômica quantitativos e espectrometria de massa. A expressão de periostina foi ainda avaliada em prostatectomia radical primária (RP) tumores da próstata e tecidos da próstata não-tumorais adjacentes utilizando imuno-histoquímica (IHQ). Nossos resultados IHC revelou um fundo de baixo periostina níveis nos tecidos da próstata não-tumorais adjacentes, mas overexpressed níveis periostina no estroma peritumoral de tumores CaP primários.

Métodos

Neste estudo, a expressão periostina no Tampão foi ainda examinado em vários microarrays de tecido (TMAs), que foram realizados em quatro laboratórios. Para atingir a coloração consistente, todos os TMA foram coradas com mesmo protocolo e marcado por mesma ferramenta imagem computação para determinar o total das intensidades de coloração periostina. O TMA foram ainda marcado por patologistas para caracterizar a coloração estromal e coloração epitelial.

Resultados

A coloração periostina foi observada principalmente em células do estroma peritumoral e em alguns casos em células epiteliais tumorais embora o mais forte coloração foi encontrada nas células do estroma peritumoral. Ambos coloração estromal periostina e coloração epitelial pode diferenciar BPH de Cap incluindo baixa CaP grau (escore de Gleason ≤6), com valor de p significativo de 2.2e-16 e 0,001, respectivamente. PIN periostina epitelial coloração diferenciada de baixo CaP grau (escore de Gleason ≤6) (p = 0,001), enquanto estromal coloração periostina diferenciado de baixo grau (escore de Gleason ≤6) tampão de alto grau (escore de Gleason ≤6) Cap (p = 1.7e -05). Além disso, uma correlação positiva entre a coloração periostina total e escore de Gleason foi observada (r = 0,87, p = 0,002).

Conclusões

Os resultados mostraram que a coloração periostina foi positivamente correlacionada com o aumento Gleason marcar e a agressividade da doença da próstata

Citation:. Tian Y, Choi CH, Li QK, Rahmatpanah FB, Chen X, Kim SR, et al. (2015) sobre-expressão de periostina em Stroma positivamente associado com câncer de próstata agressivo. PLoS ONE 10 (3): e0121502. doi: 10.1371 /journal.pone.0121502

Editor do Academic: Varda Rotter, Weizmann Institute of Science, ISRAEL

Recebido: 03 de outubro de 2014; Aceito: 01 de fevereiro de 2015; Publicação: 17 de março de 2015

Direitos de autor: © 2015 Tian et al. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Licença Creative Commons Attribution, que permite uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o autor original ea fonte sejam creditados

Disponibilidade de dados: Todos os dados relevantes estão dentro do papel e seus arquivos de suporte de informação

Financiamento:. Este trabalho foi financiado pelo National Institutes of Health, National Cancer Institute, a detecção precoce Research Network (EDRN, U01CA152813) para HZ e Detecção precoce Research Network NCI CA86366 para DC. Os financiadores não tiveram nenhum papel no desenho do estudo, coleta de dados e análise, decisão de publicar ou preparação do manuscrito

CONFLITO DE INTERESSES:.. Os autores declararam que não existem interesses conflitantes

Introdução

Em nosso esforço anterior para identificar as mudanças de proteína entre o câncer de próstata agressivo e não agressivo (PAC), o nosso grupo analisado glicopeptídeos isoladas de tumores de próstata agressivo e não agressivo por glicoproteômica quantitativos usando rotulagem iTRAQ de conter glycosite- péptidos e espectrometria de massa em tandem [1]. Identificou-se a sobre-expressão de três glicoproteínas em tecidos agressivos CaP em comparação com tecidos CaP não agressivos. Duas proteínas, catepsina L e periostina, são de matriz proteínas extracelulares (ECM). Catepsina G actua como uma endopeptidase, o que pode degradar muitos proteínas intracelulares e extracelulares para modificar a sua função. A outra proteína, periostina, foi ainda verificado utilizando imunotransferência e imuno-histoquímica (IHC) analisa [1]. Portanto, as nossas observações suportam um papel importante para o microambiente do tumor em progressão PAC.

periostina, também conhecido como factor específico-2 osteoblasto (OSF-2), é uma proteína da MEC evolutivamente conservadas e um membro da fasciclina família [2]. Tem sido demonstrado que periostina interage com outras proteínas de ECM, como a f ibronectina, colagénio V, e tenascina-C. Periostina também interage com vários receptores de superfície celular, mais notavelmente as integrinas, e os sinais principalmente por via de PI3-K /Akt e outras vias para promover o crescimento celular, sobrevivência celular, epitelial-mesenquimal transição (EMT), invasão, angiogénese tumoral e metástase [ ,,,0],2-5]. Estudos recentes revelaram que periostina está envolvido no desenvolvimento de vários tumores, como o de mama, cólon, pulmão, câncer de ovário e câncer de próstata [6-11].

Neste estudo, pretendemos verificar o correlação de expressão periostina e Cap agressividade. IHC utilizando anticorpo específico periostina foi realizada para avaliar nove TMA de vários laboratórios, que consistem de um total de 3048 prostatectomia radial (RP) núcleos. Para atingir a coloração consistente, os protocolos e reagentes foram enviados para laboratórios colaborador ou TMA foram enviadas para o nosso laboratório para coloração TMA. Para eliminar a variação de pontuação dos laboratórios individuais, todos TMAs manchado foram escaneados usando mesmo scanner com as mesmas configurações, e as imagens digitalizadas foram marcados por mesma ferramenta imagem computação para determinar o total das intensidades de coloração periostina. O TMA foram ainda marcado por patologistas para caracterizar a coloração estromal e coloração epitelial.

anticorpo anti-humano Materiais e Métodos

Materiais

coelho periostina eram de Abcam (ab14041, Cambridge, REINO UNIDO); kit LSAB + System-AP da Dako (Carpinteria, CA); e todos os outros produtos químicos foram adquiridos da Sigma-Aldrich (St. Louis, MO).

Tissue microarray (TMA)

TMAs da Universidade da Califórnia Los Angeles (UCLA).

Três TMA consistem de 197 núcleos de próstata não-tumoral (NT), 140 núcleos de hiperplasia prostática benigna (BPH), 64 núcleos de intra-epitelial da próstata neoplasia (PIN), e 963 núcleos de adenocarcinoma da próstata a partir de 246 casos (3 núcleos sobre média para cada caso) foram relatados anteriormente [12, 13]. NT foi definido como o tecido da próstata não-cancerosas adjacentes.

TMAs da Universidade da Califórnia em Irvine (UCI).

Tissue Microarray (TMA) de 480 núcleos consistem em 199 casos de tumor (com mais de 10 anos de seguimento), 108 núcleos pareadas de neoplasias intra-epiteliais da próstata (PIN), 7 núcleos pareadas de estroma, 3 núcleos de HBP, e 86 núcleos de calibradores e linhas de células conforme relatado anteriormente [14, 15].

TMAs da Universidade Johns Hopkins (JHU) (laboratório de Bob Veltri).

Dois microarrays de tecido adenocarcinoma de próstata (0,6 mm de diâmetro, 6 núcleos por caso) referido como TMA 681-682, foram criados sob uma bolsa CEVC EDRN (PI Alan W. Partin) construído no departamento de Johns Hopkins University de patologia usando amostras RP ressecado cirúrgicos recuperados do departamento de arquivos de patologia. Cada um dos dois slides TMA representa 40 casos de CaP (4 núcleos por caso) e tecidos da próstata não-cancerosas pareados por tumor (4 núcleos por caso). Os tumores de próstata embebidos em parafina fixadas em formalina e e combinados-tumorais tecidos não cancerosos para TMA 681-682 foram obtidos com base em pedido apresentado ao Departamento de Patologia da Universidade Johns Hopkins Hospital através do Cancer biorrepositório Rede de próstata (PCBN). O uso de TMAs incluindo TMAs 681-682 estudar biomarcadores foi aprovado pela Johns Hopkins University IRB (Institutional Review Board) para câncer de próstata.

TMA da Universidade Johns Hopkins (JHU) (laboratório de Hui Zhang).

o tissue microarray tampa (0,6 mm de diâmetro, 6 núcleos por caso) foi construída na Universidade Johns Hopkins usando amostras RP ressecado cirúrgicos recuperados do departamento de arquivo de patologia na Johns Hopkins Hospital. O uso de tecido informação e tumor clínico foi aprovado pelo Institutional Review Board (IRB) da Universidade Johns Hopkins. Representado no TMA foram 60 casos de adenocarcinomas da próstata (4 núcleos por caso) e tecidos da próstata não-cancerosas pareados por tumor (2 núcleos por caso). Além disso, 60 casos de tecidos de controlo não cancerosos da próstata não foram incluídos na micromatriz, que consiste em rim normal, estômago, intestino delgado, cólon, fígado, pâncreas, do endométrio, do cérebro e do nó de linfa.

A imuno-histoquímica (IHC)

O TMA foram cozidas a 60 ° C durante 1 hora, desparafinizadas e reidratadas. A TMA foram incubadas com 5% de BSA /PBS, à temperatura ambiente durante 45 minutos, e, em seguida, incubou-se com 3% H

2O

2, à temperatura ambiente durante 15 minutos antes da aplicação de anticorpo primário. Coelho anti-humano periostina (Abcam, ab14041) foram utilizados numa diluição de 1:. 4000 para corar TMA e foram detectados utilizando o estojo Dako LSAB + Sistema de AP de acordo com as instruções do fabricante

Para analisar a coloração total de periostina, a contagem de pixels positivo (PPC, v11) algoritmo (Aperio imagem Âmbito) foi aplicado a partir de núcleos individuais 9 TMA para calcular a intensidade média do pixel (num canal colorimétrico correspondente ao precipitado castanho IHC) de todos os pixels dentro de cada região anotação. Resumidamente, foram utilizados parâmetros de entrada PPC que estão inadimplentes para a quantificação de cor marrom e, em seguida, correu o algoritmo. Uma imagem pseudo-color “mark-up” foi gerado como um resultado algoritmo, confirmando que as entradas especificadas mediu a cor desejada e intensidade varia. Positivo intensidade da cor da mancha foi classificada em três códigos de cores faixas: 1) A intensidade positiva fraca (IWP) = amarelo, 2) a intensidade positiva (Ip) = laranja, e 3) forte intensidade positiva (ISP) = vermelho. Percentagem da coloração foi calculado como o número total de pixels positivos dividido pelo número total de pixels e correlacionados com escores de Gleason.

A imunocoloração foi também avaliada cegamente pela Johns Hopkins Hospital (JHH) patologistas para caracterizar estromal e localização coloração epitelial. A TMA foi marcado semi-quantitativamente usando um sistema de quatro camadas com base na intensidade e distribuição: 0, não detectável; 1+, coloração fraca; 2+, coloração forma, 3+, coloração forte. Todos TMAs foram feitos a varredura em 20X e imagens IHC foram fotografados usando Aperio Âmbito Imagem (v11.2.0.780).

Análise Estatística

O Wilcoxon signed rank test ordem (emparelhado, frente e verso) foi realizada pela coloração periostina no estroma peritumoral estroma e não-tumoral que foi marcado por patologistas. A diferença de coloração periostina em qualquer estroma ou células epiteliais entre as diferentes condições de doença da próstata foi avaliado por pontuação individual por meio do teste do qui-quadrado. Pearson teste de coeficiente de correlação foi utilizado para analisar a correlação de escore de Gleason e a positividade da coloração periostina total, incluindo tanto estromal e coloração das células epiteliais da pontuação computacional.

P

-Valores. 0,05 foram considerados estatisticamente significativos

Resultados

análise glicoproteômica prévia de tecidos CaP agressivos e não agressivos mostraram que periostina foi significativamente aumentada em próstata agressivo tumores [1]. A descoberta inicial foi verificada utilizando IHC [1]. Este estudo tem como objetivo verificar que a superexpressão periostina em CaP usando grandes conjuntos de amostras de multi-laboratórios e métodos de conservação universais. O TMAs incluem um de Hui Zhang laboratório (JHU), constituído por 360 núcleos (60 casos), dois de Bob Veltri Brady Urological Institute laboratório (JHU) que consistem em 640 núcleos (80 casos), três de David Chia laboratório (UCLA) que consistem 1364 núcleos (246 casos), e três de Dan Mercola laboratório (UCI), que consiste 684 núcleos (199 casos).

Para eliminar lendo variação dos laboratórios individuais, todos TMAs manchado foram digitalizadas na Johns Hopkins University usando a imagem latente Aperio sistema e os 20X imagens digitalizadas foram analisados ​​usando as mesmas ferramentas de cálculo para determinar a intensidade geral coloração para cada núcleo. Nós ainda validado interpretação TMA por patologistas JHH para todos TMAs para separar a coloração estromal e coloração epitelial. leituras Os patologistas ‘utilizado um sistema de quatro camadas com base na intensidade e distribuição: 0, indetectáveis; 1+, coloração fraca; 2+, coloração forma, 3+, coloração forte (Fig. 1A). Em consistente com a nossa observação anterior, a coloração periostina foi observada principalmente nas células estromais peritumorais e, em alguns casos em células epiteliais tumorais embora a coloração mais forte foi encontrada nas células do estroma peritumoral (Fig. 1a). A análise estatística foi então realizada para responder às seguintes questões: 1) se a expressão periostina pode diferenciar tecidos da próstata, incluindo cancro da próstata, áreas não tumorais de tecidos da próstata, BPH e PIN; 2) se a expressão periostina está correlacionada com variáveis ​​clínicas, como a pontuação de Gleason

(A) critérios Os patologistas ‘para IHC de pontuação (a) 0, indetectável..; (B) 1+, coloração fraca; (C) 2+, coloração média; (D) 3+, coloração forte. Periostina foi manchado principalmente no estroma peritumoral. Parcelas (B) da caixa da positividade da coloração total de periostina no adenocarcinoma de próstata pareados por paciente e tecidos da próstata não-tumorais. (C) distribuição das alterações na pontuação IHC entre o estroma peritumoral e estroma de áreas não tumorais (NT). No eixo x-1: pontuação IHC em NT é maior do que no cancro emparelhado por um; 0: pontuação IHC são as mesmas para o NT emparelhado e câncer; 1: pontuação IHC no NT é menor do que no câncer pareados por 1; 2: NT menor do que o câncer por 2; 3: NT menor do que o cancro por 3. A altura das barras (eixo dos y) é o número de pacientes. A altura das barras vermelhas soma é muito maior do que a barra de verde, o que indica que as contagens de IHC entre as células do estroma peritumorais são muito mais elevadas do que as células estromais normais correspondentes.

Para determinar se a expressão de periostina poderia diferenciar a tampa de áreas não-tumorais de tecidos da próstata, análises estatísticas foram realizadas para os três TMAs de JHU porque estes TMAs consistem em ambos os tumores de próstata e tecidos da próstata não-tumorais pareados por paciente. coloração total de periostina coloração estromal e foram analisados ​​respectivamente. A coloração total de periostina foi aumentada no tumor da próstata com escore de Gleason 6 e até em comparação com pares de tecidos da próstata não-tumorais (Fig. 1B). Uma vez que a periostina foi manchado principalmente no estroma, análise de histograma foi utilizado para analisar as mudanças na pontuação IHC entre estroma peritumoral periostina e emparelhado estroma não-tumoral (Fig. 1C). O eixo x é a diferença na pontuação IHC, que foi calculado usando a pontuação IHC do estroma peritumoral periostina menos a pontuação de emparelhado estroma não-tumoral. As barras vermelhas indicam o número de pacientes que tiveram maior pontuação IHC em câncer em comparação com estroma não-tumoral, enquanto a barra verde indica os menores escores de IHC em câncer. A altura das barras (eixo dos y) é o número de pacientes. A altura das barras vermelhas soma é significativamente maior do que a barra de verde, o que indica que as contagens de IHC entre as células do estroma peritumorais são significativamente mais elevadas do que as correspondentes células estromais não-tumorais. O Wilcoxon assinado teste ordem de classificação (emparelhado, frente e verso) dá o valor p para o significado dessa diferença (p = 2.75e-12).

Para comparar a expressão periostina no tumor da próstata e outras condições de doenças da próstata, a TMA da UCLA, que consistem em 197 núcleos de próstata não-tumoral (NT), 140 núcleos de hiperplasia prostática benigna (BPH), foram analisados ​​64 núcleos de neoplasia intra-epitelial prostática (PIN), e 963 núcleos de PAC. Exceto os cones com um tecido queda-off, 1233 núcleos foram usados ​​na análise de coloração do estroma, enquanto 1247 núcleos foram usados ​​na análise de coloração de células epiteliais. A coloração periostina foi detectado com baixa experiência em próstata não-tumoral e BPH, e com o aumento da coloração em PIN, enquanto a maioria coloração intensa foi encontrada na tampa (Fig. 2). O teste do qui-quadrado revelou que tanto coloração estromal periostina e coloração epitelial BPH de Cap incluindo baixa CaP grau (escore de Gleason ≤6) diferenciado, com valor de p significativo de 2.2e-16 e 0,001, respectivamente (Tabelas 1 e 2, S1 Estatística Análise). PIN periostina epitelial coloração diferenciada da PAC, incluindo CaP de baixo grau (escore de Gleason ≤6) (p = 0,001). Além disso, a coloração do estroma periostina diferenciado baixo CaP grau (escore de Gleason ≤6) de Cap alto grau (escore de Gleason ≤6) (p = 1.7e-05) (Tabelas 1 e 2, S1 análise estatística). Os resultados mostram que a coloração periostina está positivamente correlacionada com a agressividade do cancro da próstata.

As imagens representativas de expressão periostina em tecidos de diferentes doenças da próstata. NT: Paciente emparelhado próstata não-tumoral; BPH: hiperplasia benigna da próstata, PIN: neoplasias intra-epiteliais de próstata; e Cap:. adenocarcinoma de próstata

Para determinar a correlação de expressão periostina e pontuação de Gleason, todos os nove TMAs foram analisados ​​utilizando a mesma ferramenta computacional imagem. Percentagem de coloração foi calculada como o número total de pixels positivos dividido pelo número total de pixels. Os aumentos de intensidade de coloração total de periostina foram encontrados nos tumores da próstata com o aumento da classificação de Gleason na três TMA de JHU (Fig. 1B) 3B, a três TMA da UCLA (Fig. 3A), e os três TMA da UCI (Fig. ). Os resultados mostram que uma correlação positiva entre a coloração periostina total e escore de Gleason (r = 0,87, p = 0,002) (Fig. 3C).

(A) Os diagramas de caixa da positividade da periostina para os três TMAs de UCLA, parcelas (B) da caixa da positividade da periostina para os três TMAs da UCI, (C) a correlação positiva de mudanças dobra e Gleason registos com todos os nove TMAs. Percentagem da coloração (positividade) foi calculado como o número total de pixels positivos dividido pelo número total de pixels.

Discussão

No presente estudo, investigamos o nível de expressão em periostina os tecidos de cancro da próstata primários, não-tecidos tumorais da próstata, hiperplasia prostática benigna, neoplasia intra-epitelial e da próstata. Este é o primeiro estudo utilizando tal coorte expandido para analisar a expressão periostina no câncer de próstata e tentar determinar a relevância clínica da elevação periostina com o fenótipo agressivo PAC.

High expressão de periostina localizada em ambos os epitélios tumor ou peritumoral estroma foi observado de forma consistente como os relatórios anteriores [16-19]. Curiosamente, enquanto forte coloração periostina peritumoral foi observada em todos os TMA, a coloração periostina no epitélio do tumor foi detectada apenas nas TMA da UCLA e UCI, mas não nas TMA de JHU. Isto pode ter sido causado por variações em coortes de pacientes e o pré-processamento técnico que inclui a recolha de amostras, selecção patologista, etc., durante a construção do JHU TMA. De acordo com a análise estatística, expressão epitelial e estromal periostina foi capaz de distinguir CaP formar próstata não-tumoral, BPH e PIN (Tabelas 1 e 2, as Figuras 1 e 2, e S1 Análise Estatística). Além disso, ficou demonstrado que a coloração periostina total (epitélio e estroma) para ser correlacionado com o aumento da classificação de Gleason (Fig. 3C). Isso indica a coloração periostina peritumoral foi altamente associado com a agressividade PAC.

Outros estudos têm sugerido que a expressão periostina está correlacionada com a metástase do câncer eo prognóstico sombrio [9, 20, 21]. Li

et al

informou que a sobre-expressão de periostina foi frequentemente observada no estroma da carcinoma nasofaríngeo e combinados linfonodo metástases em comparação com o estroma da mucosa nasofaríngea normais [16]. Também foi observada a expressão de alta estromal periostina para ser associado a menor sobrevivência de cancro da próstata [19]. No entanto, nomeadamente a TMA utilizado neste estudo consiste apenas em tumores da próstata primários. Seria extremamente útil para analisar a expressão periostina em casos de recorrência da PAC que podem evoluir para metástase e morte no futuro.

Em conclusão, embora periostina foi aumentada em ambas as células do estroma e Cap epitelial peritumoral, periostina teve grande a expressão no tipo de células ex. Nossos dados mostram que a expressão periostina está altamente correlacionada com a agressividade do tumor PAC, que apoia a nossa descoberta anterior. Os resultados indicam que periostina tem o potencial de ser utilizado como um biomarcador de diagnóstico do tecido.

Informação Apoiando

S1 Análise Estatística. A análise estatística de coloração periostina e estatuto da doença da próstata

doi:. 10.1371 /journal.pone.0121502.s001

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