Abstract
A gemcitabina (GEM) tem limitado os benefícios clínicos em adenocarcinoma ductal pancreático (PDAC). O presente estudo investigou combinações de gemcitabina com agentes anti-angiogénicos de vários mecanismos de PDAC, incluindo o bevacizumab (Bev), sunitinib (Su) e EMAP II. A proliferação celular e a expressão da proteína foram analisadas por ensaio de WST-1 e Western blotting. In vivo, as experiências foram realizadas por meio de xenoenxertos de murino. A inibição da proliferação em vitro de AsPC-1 por células PDAC gemcitabina (10 uM), bevacizumab (1 mg /ml), sunitinib (10 uM) e EMAP (10 uM) foi de 35, 22, 81 e 6 por cento; combinação de gemcitabina com bevacizumab, sunitinib ou EMAP não tinha efeitos aditivos. Em HUVECs endotelial, gemcitabina, bevacizumab, sunitinib e EMAP causaram 70, 41, 86 e 67 por cento de inibição, enquanto a combinação de gemcitabina com bevacizumab, sunitinib ou EMAP teve efeitos aditivos. Em WI-38 fibroblastos, gemcitabina, bevacizumab, sunitinib e EMAP causou 79, 58, 80 e 29 por cento de inibição, com efeitos aditivos em combinação bem. Net na inibição do crescimento do tumor in vivo em gemcitabina, bevacizumab, sunitinib e EMAP monoterapia foi de 43, 38, 94 e 46 por cento; combinações duplas de Gem + Bev, Gem + Su e Gem + EMAP levou a 69, 99 e 64 por cento de inibição. Combinações de mais de um agente anti-angiogénico com gemcitabina foram geralmente mais eficazes, mas não superior a + Gem Su. achados proliferação intratumoral, apoptose e densidade de microvasos correlaciona com dados de inibição do crescimento do tumor. sobrevivência do animal média foi aumentada em gemcitabina (26 dias), mas não por bevacizumab, sunitinib ou EMAP monoterapia em relação aos controles (19 dias). combinações gemcitabina com bevacizumab, sunitinib ou EMAP melhorou a sobrevivência de extensão similar (36 ou 37 dias). Combinações de gemcitabina com Bev + EMAP (43 dias) ou com Bev + Su + EMAP (46 dias) levou ao máximo benefício de sobrevivência observado. A combinação de agentes anti-angiogénicos melhora a resposta gemcitabina, com sunitinib induzir o efeito mais forte. Estes resultados demonstram vantagens de combinar agentes segmentação de vários com gemcitabina padrão para PDAC
Citation:. Awasthi N, Zhang C, Ruan W, Schwarz MA, Schwarz RE (2012) Avaliação de Poly-mecanicistas antiangiogênicas Associações a melhorar citotóxica Terapia Response no cancro do pâncreas. PLoS ONE 7 (6): e38477. doi: 10.1371 /journal.pone.0038477
editor: Chryso Kanthou, da Universidade de Sheffield, Reino Unido
Recebido: 28 de novembro de 2011; Aceito: 09 de maio de 2012; Publicado: 18 Junho 2012 |
Direitos de autor: © 2012 Awasthi et al. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Licença Creative Commons Attribution, que permite uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o autor original ea fonte sejam creditados
Financiamento:. Os autores não têm apoio ou financiamento para relatar
Conflito de interesses:. os autores declararam que não existem interesses conflitantes
Introdução
pâncreas adenocarcinoma ductal (PDAC) é um dos. a maioria dos cânceres humanos agressivos e continua a ser a quarta principal causa de mortes relacionadas ao câncer nos Estados Unidos. rápida progressão do tumor, diagnóstico tardio, início e metástase agressiva e elevada resistência à quimioterapia convencional leva a excepcionalmente mau prognóstico com uma taxa de sobrevida de 5 anos menos de 5% [1]. Tratamento de PDAC depende da fase do cancro; a taxa de ressecabilidade global é de apenas 10 a 15%, e a recorrência pós-operatória é comum [2], [3], [4]. Muita atenção tem sido focada para as opções de tratamento sistêmico para PDAC para possível benefício terapia definitiva ou perioperatória. Gemcitabina (Gem), um análogo de nucleósido desoxicitidina, é um agente citotóxico que provoca a inibição da síntese de ADN e morte celular. A Food and Drug Administration (FDA) aprovou gemcitabina para o tratamento de PDAC avançado em 1997. No entanto, a gemcitabina é clinicamente eficaz apenas em 20-30% dos pacientes PDAC, levando a uma sobrevivência livre de progressão mediana de 5,7 meses, em comparação com 4,4 meses em o grupo tratado com 5-fluorouracilo [5]. regimes de combinação de quimioterapia à base de gemcitabina não conseguiram demonstrar qualquer vantagem de sobrevivência significativa sobre o único gemcitabina agente [6], [7]. Estes factos demonstram claramente a necessidade urgente de novas estratégias terapêuticas mais eficazes e para PDAC.
A angiogénese, o processo pelo qual os tumores adquirem fornecimento de sangue para o seu crescimento contínuo, é essencial para a progressão de tumores sólidos primários e metastáticos, incluindo PDAC. A angiogénese é iniciada por hipoxia, factores de crescimento, citoquinas, e a activação de proto-oncogenes e a desactivação dos mecanismos de gene supressor de tumor [8]. Segmentação angiogénese para reduzir a progressão do tumor e a metástase podem produzir nova abordagem para a terapia de combinação. agentes antiangiogénicos, tais como anti-vasculares factor de crescimento endotelial (VEGF) agente bevacizumab (Bev), inibidores de metaloproteinase de matriz (marimastat) e inibidores da ciclo-oxigenase (celecoxib) tem sido estudada em terapia de combinação em modelos PDAC com benefício de sobrevivência limitada [9], [10 ], [11]. O erlotinib, o inibidor do receptor do factor de crescimento epidérmico, até à data tem sido o único agente de mediar um benefício modesto, a sobrevivência global em combinação com gemcitabina [12].
Muitos relatórios da literatura sugerem que a sinalização de VEGF desempenha um papel importante na progressão PDAC [13], [14], [15], [16]. Portanto bevacizumab, um anticorpo monoclonal humanizado recombinante contra o VEGF, foi avaliada na fase II e fase III de ensaios clínicos. Embora a combinação bevacizumab e gemcitabina mostrou alguma promessa em um estudo de fase II, nenhuma melhoria significativa foi observada em estudos de fase III posteriores [17]. Sunitinib (SU) é um inibidor de multi-alvo do receptor de tirosina cinase (RTK) com anti-angiogénicos e anti-tumorais actividades [18], [19], [20]. Sunitinib inibe RTKs expressos por células tumorais que estão envolvidos na proliferação de células de tumor e a sobrevivência, incluindo o receptor do factor de células estaminais (c-Kit), Fms relacionadas com a tirosina cinase 3 (FLT3), a linha de célula glial derivada do receptor do factor neurotrófico (RET) e estimulação de colónias de tipo fator 1 receptor (CSF-1R) [18], [19]. Sunitinib também inibe RTKs expresso em células endoteliais e mural, tais como receptores de VEGF (Tipo 1 e 2) e factor de crescimento derivado de plaquetas (PDGF) de receptores α e β [20], [21]. Em PDAC humano, receptores de VEGF e os receptores dos FCDP são sobre-expressos e têm sido correlacionadas com prognóstico pobre [22], [23], [24]. Sunitinib demonstrou ter eficácia antitumoral em PDAC experimental [25], [26], [27]. monócitos endotelial polipéptido activador II (EMAP) é uma citocina pró-inflamatória com actividades anti-angiogénicas e antiendoteliais. EMAP tem efeitos potentes sobre células endoteliais (ECs), tais como inibição de proliferação, migração e vascularização bem como a indução de apoptose [28], [29]. EMAP suprime o crescimento do tumor primário e metastático [28], [30], [31] que pode ser relacionado com a sua capacidade para ligar receptores de VEGF e integrina α5β1, levando a uma interferência na VEGF fibronectin- sinalização e [32], [33] . EMAP foi recentemente mostrado para melhorar a gemcitabina e docetaxel em resposta PDAC experimental [34], [35], [36]. O presente estudo avaliou e comparou os benefícios do tratamento combinação de gemcitabina com três agentes anti-angiogénicos bevacizumab, sunitinib e EMAP para aplicações clínicas PDAC potencialmente melhorados.
AsPC-1, HUVECs e células WI-38 culturas foram tratadas com Gem (10 uM), Bev (1 mg /ml), Su (10 uM) e EMAP (10 uM), quer isoladamente ou em combinação, durante 16 horas. lisado celular total a partir de grupos de tratamento foram sujeitos a SDS-PAGE e imunotransferência. Expressão de α-tubulina foi analisada como controlo de carga interna. Os dados são representativos de duas experiências independentes, com resultados semelhantes.
Materiais e Métodos
Materiais
A gemcitabina foi adquirida da Eli Lilly (Indianapolis, IN). Bevacizumab foi adquirido da Genentech (South San Francisco, CA). Sunitinib foi adquirido a LC Laboratories, Inc. (Woburn, MA). EMAP humano recombinante foi preparado como descrito anteriormente [37], enquanto que o reagente de proliferação celular WST-1 foi adquirido a partir de Roche Diagnostic Corporation (Indianapolis, IN).
Cultura celular
O cancro pancreático humano a linha celular AsPC-1, linha celular de fibroblastos humanos WI-38 e células endoteliais da veia umbilical humana (HUVECs) foram todos adquiridos a partir da American Type Culture Collection (ATCC, Rockville, MD). AsPC-1 e células WI-38 foram cultivadas em meio RPMI 1640 e DMEM, respectivamente (Sigma Chemical Co. St. Louis, MO) suplementado com 10% de soro fetal de bovino (FBS). As HUVECs foram cultivadas em meio LS-EndoGRO contendo suplementos de crescimento de células endoteliais (Millipore Corp., Billerica, MA).
Ensaio de viabilidade celular
in vitro a viabilidade celular foi avaliada através do ensaio de WST-1 . Quatro mil células foram plaqueadas numa placa de 96 poços e após 16 horas o meio foi substituído com meio contendo baixo teor de soro. As células foram tratadas com a gemcitabina, bevacizumab, sunitinib e EMAP. A gama de concentrações utilizadas para gemcitabina, sunitinib e EMAP (10 nM a 10 uM); e para o bevacizumab (1 ug /ml a 1 mg /ml) foi comparável a concentrações clinicamente praticáveis. Após uma incubação de 72 horas, 10 ul de reagente WST-1 foram adicionados em cada poço, e a absorvância a 450 nm foi medida após 2 horas, utilizando um leitor de microplacas.
ratinhos nus foram injectados subcutaneamente com AsPC-1 de células (0,75 x 10
6) e tratou-se com gema, Bev, Su e EMAP, quer isoladamente ou em combinação, durante 2 semanas. O crescimento do tumor foi medido 2 vezes por semana utilizando calibradores, e o crescimento do tumor líquido foi calculado subtraindo o volume do tumor no primeiro dia de tratamento do que no final do dia. Os dados são representativos dos valores médios 6-8 ratos por grupo.
Ratinhos nus foram injectados por via subcutânea com células AsPC-1 (0,75 × 10
6) e tratada com Gem, Bev, Su e EMAP, quer isoladamente ou em combinação, durante 2 semanas. secções (A) de tecido de tumor foram imunocoradas com o antigénio nuclear Ki67 e fotografadas sob um microscópio fluorescente. (B) células Ki67-positivas foram contadas em cinco campos de alta potência diferentes. Os dados são expressos como a média ± desvio padrão. Símbolos • e * representam diferenças significativas (P 0,05) em comparação com controles e grupo Gema, respectivamente
Ratinhos nus foram injectados por via subcutânea com células AsPC-1 (0,75 × 10
6) e. tratada com gema, Bev, Su e EMAP, quer isoladamente ou em combinação, durante 2 semanas. secções (A) de tecido de tumor foram corados com um procedimento de TUNEL e fotografadas sob um microscópio fluorescente. (B) As células apoptóticas TUNEL positivos foram contadas em cinco campos diferentes de alta potência. Os dados são expressos como a média ± desvio padrão. Símbolos • e * representam diferenças significativas (P 0,05) em comparação com controles e grupo Gema, respectivamente
Ratinhos nus foram injectados por via subcutânea com células AsPC-1 (0,75 × 10
6) e. tratada com gema, Bev, Su e EMAP, quer isoladamente ou em combinação, durante 2 semanas. secções (A) de tecido de tumor foram coradas com anticorpo PECAM-1 e fotografadas sob um microscópio fluorescente. (B) PECAM-1 microvascular positiva foram contadas em cinco campos de alta potência diferentes. Os dados são expressos como a média ± desvio padrão. Símbolos • e * representam diferenças significativas (P 0,05). Comparação com controles e grupo Gema, respectivamente
AsPC-1 células (0,75 × 10
6) foram injectados intraperitonealmente em ratinhos SCID, e depois de 2 semanas, seguidas por tratamento com gema, Bev, Su e EMAP, quer isoladamente ou em combinação, por um período de 2 semanas. A curva representa o tempo de sobrevivência dos animais desde o início do tratamento.
Análise Western Blot
Uma monocamada de células sub-confluentes foi tratado com gemcitabina (10 uM), bevacizumab (1 mg /mL), sunitinib (10 uM) ou EMAP (10? M) e incubou-se 12 horas para HUVEC e 24 horas para AsPC-1 e células WI-38. lisado celular total foi preparado, a concentração de proteína medido e quantidades iguais de proteína foram separadas por SDS-PAGE e transferidos para membranas de PVDF (Bio-Rad, Hercules, CA). As membranas foram bloqueadas durante 1 hora em solução de bloqueio (5% de leite em TBS-T [solução salina tamponada com Tris contendo Tween-20]) e incubados durante a noite a 4 ° C com os anticorpos seguintes: poli clivado (ADP-ribose) polimerase- 1 (PARP-1), caspase-3 clivada (Cell Signaling Technology, Beverly, MA) ou α-tubulina (Sigma). As membranas foram, então, incubadas com anticorpos secundários conjugados com HRP (Pierce Biotechnologies, Santa Cruz, CA) correspondente durante 1 hora à temperatura ambiente. As bandas específicas foram detectadas usando o reagente de quimioluminescência aumentada (ECL, Perkin Elmer Life Sciences, Boston, MA) em filme de autorradiografia e quantificadas por densitometria.
implantação do tumor e experiência in vivo no Crescimento do Tumor
Todos procedimentos e cuidados com animais foram realizados de acordo com as diretrizes e protocolos aprovados da Universidade do Texas Southwestern Medical Center (Dallas, TX) Institutional animal Care e Use Committee (animal número de protocolo 2008-0348). camundongos nu feminino atímicos (com idade entre 4-8 semanas) foram utilizadas no modelo de xenoenxerto subcutâneo. câncer pancreático células AsPC-1 humano (0,75 × 10
6) foram injectados por via subcutânea em cada rato. Após 14 dias, quando todos os ratinhos tinham tumores mensuráveis, os ratinhos foram agrupados aleatoriamente (n = 6-8 por grupo) e tratados por via intraperitoneal com PBS (controlo), a gemcitabina (100 mg /kg, duas vezes por semana), bevacizumab (10 ug por ratinho, duas vezes por semana), sunitinib (40 mg /kg para 1
semana r, 20 mg /kg para o 2
ND semanas, 5 vezes por semana) e EMAP (80 ug /kg, 5 vezes por semana) durante 2 semanas. O tamanho do tumor em todos os ratinhos foi medido duas vezes por semana com um compasso. O volume do tumor (V) foi calculado usando a fórmula [V = ½ (L x (W)
2], onde foi calculada L = comprimento e W = largura. O crescimento líquido no tamanho do tumor para cada animal por subtracção do volume tumoral no primeiro dia de tratamento do que no último dia. Após a conclusão do tratamento, todos os animais foram sacrificados, os tumores foram removidos, pesados, dissecados e processados para análise histológica ou imuno-histoquímica.
Histologia e análise imuno-histoquímica
espécimes de tecido tumoral fixas em paraformaldeído a 4% e embebidos em parafina foram usadas para análise histológica e imuno-histológica. actividade proliferativa intratumoral foi medida usando por Ki67 coloração antigénio nuclear de acordo com o protocolo do fabricante (Abcam, Cambridge, MA). Resumidamente, a parafina secções de tecido de tumor foram cortadas -embedded, desparafinados, re-hidratados e antigénio recuperadas. As secções de tecido foram incubadas com tampão de bloqueio CAS seguido por 1 hora de incubação com o anticorpo Ki67 (1:200 diluição). As secções de tecido foram então incubadas com Cy3 (1 :200 diluição) anticorpo secundário (Jackson ImmunoResearch Laboratories, West Grove, PA) durante 40 minutos. As lâminas foram montadas utilizando solução de montagem contendo 4 ‘, 6-diamidino-2-fenilindole (DAPI) (Invitrogen, Carlsbad, CA). actividade proliferativa foi avaliada calculando células Ki67-positivas a partir de cinco campos de alta potência (HPF) diferentes de uma maneira cega. Para a detecção de densidade de microvasos (MVD), as secções de tecido foram incubadas com 1:100 diluição de anticorpo PECAM-1 (CD-31) (BD Pharmingen, Bedford, MA) durante a noite a 4 ° C. As secções de tecido foram então incubadas com 1:200 diluição de anticorpo secundário Cy3 durante 40 minutos. As lâminas foram montadas utilizando solução de montagem contendo DAPI, e MVD foi avaliada através da contagem PECAM-1 positivos vasos dentro de uma HPF microscópica de uma forma cega. intratumoral apoptose foi analisada por coloração com secções de tecido “Apoptag Apoptosis Detection Kit” de acordo com as instruções do fabricante (Millipore). microscopia de fluorescência foi usado para detectar sinais fluorescentes usando IX81 Olympus microscópio e imagens foram captadas com uma câmara digital Hamamatsu Orca (Hamamatsu Corporation, Bridgewater, NJ) com uma unidade de fiação confocal DSU usando software Slidebook (Inovações de imagem inteligente, Philadelphia, PA).
Survival animal Análise
estudos de sobrevivência animal foram realizados utilizando camundongos SCID fêmea de 6 a 8 semanas de idade [38]. AsPC-1 (0,75 x 10
6) As células foram injectadas intraperitonealmente em cada ratinho e após duas semanas os ratinhos foram agrupados aleatoriamente (n = 6-8 por grupo) e tratados por via intraperitoneal com PBS (controlo), a gemcitabina (100 mg /kg, duas vezes por semana), bevacizumab (10 ug por ratinho, duas vezes por semana), sunitinib (40 mg /kg para 1
r semana, 20 mg /kg para 2
ND semanas, 5 vezes por semana) ou EMAP ( 80 ug /kg, 5 vezes por semana) durante 2 semanas. Os animais foram sacrificados quando virar moribunda de acordo com critérios pré-definidos, incluindo a rápida perda de peso ou ganho ( 15%), tamanho do tumor, letargia, incapacidade de permanecer em pé e falta de força. A sobrevivência foi avaliada a partir do primeiro dia de tratamento até a morte.
Análise Estatística
A significância estatística foi analisada pelo teste t de Student de duas caudas usando GraphPad Prism 4 Software (GraphPad Software, San Diego , CA). Na célula in vitro de proliferação de dados são expressos como média ± desvio padrão. Aditividade das combinações da droga foi determinada através do cálculo de um “índice de interacção” usando o Chou TC, Talalay P [39] e Lee JJ [40] métodos. A análise estatística para estudos in vivo foi realizada por ANOVA para comparação grupo múltiplo e teste t de Student para a comparação grupo individual. estatísticas estudo de sobrevivência foram avaliados com StatView para Macintosh (SAS, Carey, NC) por estatísticas de sobrevivência não paramétricos e testes logrank. Os valores de p 0,05 foram considerados para representar diferenças entre os grupos estatisticamente significativas
Resultados
Efeito da gemcitabina, Bevacizumab, sunitinib e EMAP na proliferação celular
In vitro análise de proliferação celular. em ASPC-1 por células gemcitabina (10 uM), bevacizumab (1 mg /ml), sunitinib (10 uM) e EMAP (10 | iM) mostrou 35, 22, 81 e 6 por cento de inibição da proliferação celular, respectivamente. Combinações de gemcitabina com agentes antiangiogénicos individuais bevacizumab ou EMAP não tinham efeitos aditivos, enquanto a combinação de gemcitabina com sunitinib não pode ultrapassar os efeitos de sunitinib único agente. Combinações de mais de um agente anti-angiogénico com gemcitabina teve nenhum aditivo Efeitos in vitro (Tabela 1). Embora gemcitabina tinha vários efeitos sobre as outras linhas celulares PDAC BxPC-3, MIA PaCa-2 e Panc-1, os efeitos de combinações de agentes anti-angiogénicos apresentaram resultados semelhantes aos observados com AsPC-1 (dados não mostrados).
em HUVEC, gemcitabina (10 uM), bevacizumab (1 mg /ml), sunitinib (10 uM) e EMAP (10 uM) tratamento provocou uma inibição de 70 por cento, 41, 86 e 67 na proliferação de células, respectivamente. Combinações de gemcitabina com único agente bevacizumab, sunitinib ou EMAP resultou em efeitos sinérgicos significativos na inibição da proliferação. No entanto, a combinação de mais do que um agente anti-angiogénico não têm efeito aditivo. Em células WI-38, gemcitabina (10 uM), bevacizumab (1 mg /ml), sunitinib (10 uM) e EMAP (10 | iM) causou 79, 58, 80 e 29 por cento de inibição da proliferação celular, respectivamente. Combinação de gemcitabina com bevacizumab, sunitinib ou EMAP teve efeito aditivo significativo e combinação de mais de um agentes anti-angiogénicos para gemcitabina não teve qualquer efeito aditivo adicional (Tabela 1). Para as combinações de gemcitabina com diferentes agentes anti-angiogénicos, a tabela de interacção média foi de 1,03 (intervalo de 0,9-1,34) AsPC-1 para as células, de 1,3 (intervalo de 1,06-2,59) para células HUVEC e 1,35 (intervalo de 1,06-2,47) para células WI-38. Os índices de interação foram obtidas no IC
25, IC
50, IC
75 e IC
90 níveis e não foram significativamente diferente de 1, indicando que em todas as combinações de medicamentos os efeitos combinados foram aditivos.
Efeitos da gemcitabina, bevacizumab, sunitinib e EMAP na apoptose proteínas relacionadas
Foi examinado se a inibição da viabilidade celular por gemcitabina, bevacizumab, sunitinib e EMAP poderia em parte ser correlacionada com a indução de apoptose. Avaliação de PARP-1 e a clivagem de caspase-3 clivada como marcadores de indução de apoptose em células que revelaram AsPC-1 gemcitabina tratamento causou um aumento pequeno, bevacizumab e EMAP não causou aumento, mas o tratamento com sunitinib conduziu a um aumento significativo. Combinação de gemcitabina com sunitinib teve efeitos aditivos (Figura 1). Em HUVECs, gemcitabina, bevacizumab e EMAP causou um aumento pequeno e sunitinib provocou um forte aumento da PARP-1 e caspase-3 clivagem. Combinações de gemcitabina com agentes antiangiogénicos teve efeitos aditivos. Em WI-38 células, gemcitabina e sunitinib tanto causou um aumento óbvio; enquanto o bevacizumab e EMAP demonstrado nenhum efeito significativo sobre a PARP-1 e caspase-3 clivada. Combinações de gemcitabina com bevacizumab, sunitinib e EMAP todos tiveram efeitos aditivos na PARP-1 clivada e 3 caspase-expressão da proteína (Figura 1).
Efeitos da gemcitabina, Bevacizumab, sunitinib e EMAP no crescimento do tumor local
subcutâneas murino xenotransplantes estudos PDAC mostrou que a gemcitabina, bevacizumab, sunitinib e tratamento EMAP inibiu o crescimento tumoral local, com sunitinib monoterapia ter o efeito mais forte. inibição de crescimento líquido de tumor depois de um tratamento de 2 semanas com gemcitabina, bevacizumab e sunitinib e EMAP foi de 43, 38, 94 e 46 por cento, respectivamente (Figura 2). A adição de bevacizumab agente único, sunitinib e EMAP a gemcitabina teve efeitos aditivos sobre a inibição do crescimento do tumor, como gema + Bev, Gema + Su e Gem + EMAP conduziu à inibição do crescimento tumoral de 69, 99 e 64 por cento. Combinações de mais de um agente anti-angiogénico com gemcitabina foram também eficazes mas não significativamente melhor neste ensaio do que o sunitinib sozinho (Figura 2, Figura S1). Não foram observados sinais aparentes de toxicidade relacionada com a droga em qualquer grupo de tratamento em termos de habitus animal, os níveis de atividade e peso (Figura S2)
Efeitos da gemcitabina, Bevacizumab, sunitinib e EMAP sobre intratumoral proliferativa e apoptótica Atividade
a análise de células Ki67-positivas como marcador da atividade proliferativa intratumoral revelou que a gemcitabina, bevacizumab, sunitinib e EMAP monoterapia resultou em 34, 28, 82 e 22 por cento de inibição no índice proliferativo. Combinações de gemcitabina com um ou mais agentes anti-angiogénicos foram eficazes, mas não aumentou a inibição do índice proliferativo intratumoral para além dos níveis atingidos pela sunitinib sozinho (Figura 3).
Avaliação da apoptose intratumoral por TUNEL demonstrou-coloração pequenos aumentos apoptose por gemcitabina, bevacizumab e EMAP, e um aumento significativo de sunitinib sozinho. Combinações de bevacizumab e sunitinib ou EMAP com gemcitabina levou ao aumento dos níveis de apoptose em comparação com os agentes individuais. índices apoptóticos (células TUNEL-positivos /total de células por HPF) nos controles, e em Gem, Bev, Su, EMAP, Gem + Bev, Gem + Su, grupos Gem + EMAP foram de 0,13 ± 0,03, 0,21 ± 0,06, 0,19 ± 0,03 , 0,47 ± 0,05, 0,18 ± 0,01, 0,26 ± 0,03, 0,53 ± 0,01 e 0,25 ± 0,02, respectivamente. Combinações de mais de um agente anti-angiogénico com gemcitabina também um aumento da apoptose, mas não foram significativamente mais eficaz do que apenas sunitinib (Figura 4).
Efeitos de gemcitabina, bevacizumab, sunitinib e EMAP sobre intratumoral de microvasos Densidade
PECAM-1 coloração de secções de tecido de tumor para estudar a vasculatura do tumor revelou que a gemcitabina, bevacizumab, sunitinib e EMAP todos causou uma redução significativa na densidade de microvasos em comparação com o controlo (Figura 5). Sunitinib sozinho induziu o efeito máximo na redução MVD entre todos os agentes testados. Combinações de gemcitabina com bevacizumab e EMAP mostrou efeitos aditivos sobre a diminuição contagem de microvasos em comparação com agentes únicos. Todas as combinações com sunitinib foram muito eficazes, mas não superou os efeitos sozinho sunitinib. Todos os grupos foram avaliados para a contagem de microvasos médios incluindo, controles (25,5 ± 3,5), gemcitabina (14,2 ± 2,1), bevacizumab (11,8 ± 2,6), sunitinib (5,0 ± 2,3), EMAP (11,1 ± 2,5), Gem + Bev (7.8 ± 2), Gem + Su (5,6 ± 1,1), Gem + EMAP (7,9 ± 1,7), Bev + Su (2,9 ± 1), Bev + EMAP (8,2 ± 1,5), Su + EMAP (5,2 ± 1,5), Gem + Bev + Su (3,9 ± 1), Gem + Bev + EMAP (5,5 ± 1,5), Gem + Su + EMAP (3,3 ± 0,6) e Gem + Bev + Su + EMAP (2,9 ± 1), respectivamente (Figura 5 ).
Efeitos da gemcitabina, Bevacizumab, sunitinib e EMAP no animal Survival
PDAC estudos de xenotransplante murino em ratinhos SCID-NOD resultou em uma sobrevida média de 19 dias no grupo de controle. A sobrevida média (M.S.) aumentou modestamente após a gemcitabina (26 dias, p = 0,02), mas não houve nenhum benefício significativo da sobrevivência com bevacizumab agente único, sunitinib ou EMAP, em comparação com o controle. tratamento de combinação de gemcitabina com bevacizumab agente único, sunitinib e EMAP tudo melhorou significativamente a sobrevida dos animais a um nível semelhante, com sobrevivência média do grupo Gem + Bev de 36 dias (p = 0,003 vs. controlo, 0,006 vs. Gem), depois de Gem + Su 37 dias (p = 0,003 vs. controlo, 0,01 vs. Gem) e após Gem + EMAP 36 dias (p = 0,002 vs. controlo, 0,001 vs. Gem). A combinação de gemcitabina com Su + EMAP (M.S. = 36 dias) não foi melhor do que a combinação de gemcitabina com sunitinib monoterapia ou EMAP. Combinação de gemcitabina com Bev + EMAP (ms = 43 dias, p = 0,001 vs. controlo, 0,005 vs. Gem) ou com Bev + Su + EMAP (46 dias, p = 0,001 vs. controlo, 0,003 vs. Gem) demonstrou a benefício de sobrevivência máxima (Figura 6).
Discussão
o câncer de pâncreas tem um extremamente mau prognóstico devido ao diagnóstico em estágio final, a propagação metastática precoce e alta resistência à radiação e quimioterapia. Embora a terapia gemcitabina único agente produziu alguns benefícios clínicos para PDAC metastático, o benefício de sobrevida global permanece limitada [1]. Desde a angiogênese é crítica para a progressão PDAC primário e metastático, o tratamento antiangiogênico é uma avenida terapêutica sensata e ainda promissor, devido ao seu potencial de interação sinérgica com outros agentes antitumorais, baixa toxicidade e efeito reforçada antitumoral [41], [42]. Vários factores de crescimento tais como VEGF, factor de crescimento de fibroblastos (FGF), factor de crescimento PDGF ou semelhante a insulina (IGF) estão entre as mais importantes na progressão activadores angiogénicos PDAC. Bevacizumab, o primeiro inibidor de angiogênese aprovado pela FDA mostrou alguma promessa em estudos PDAC iniciais em combinação com gemcitabina, mas não conseguiu confirmar qualquer benefício significativo de sobrevivência em estudos posteriores [17]. Sunitinib, um inibidor angiogénico RTKs multialvo de VEGFR, PDGFR, c-KIT, FLT-3 e RET, é um agente interessante em relação ao seu potencial terapia de combinação, em comparação com inibidores de espectro estreito que mostraram até agora actividade clínica bastante limitado. Nossos resultados mostram que 1 .: a combinação de agentes anti-angiogénicos com gemcitabina geralmente produz melhores resultados do que a monoterapia; 2 .: os efeitos de sunitinib sozinho pode ser bastante pronunciado, pelo menos nos modelos testados; 3 .: várias combinações de agentes anti-angiogénicos para além gemcitabina tendem para se obter os melhores resultados; e 4 .: sunitinib e bevacizumab parecem ter nenhum benefício combinação óbvia.
A progressão tumoral depende criticamente de uma interação complexa entre vários componentes, incluindo células tumorais, células do sistema imunológico, a ECS, matriz extracelular (ECM) e fibroblastos estromais. tratamento de tumores sólidos, visando a CE e compartimentos de fibroblastos dentro do microambiente do tumor tem mostrado alguns benefícios substanciais [43], [44]. EMAP, uma citocina anti-angiogénico e antiendoteliais derivado de tumor, na nossa experiência apresentaram efeitos anti-tumorais em diversos tipos de tumores, incluindo PDAC [28], [30], [31], [34], [35], [45], [46] . O âmbito do presente estudo foi avaliar a melhoria da resposta gemcitabina por combinação de mais de um agentes anti-angiogénicos com toda uma gama de diferentes mecanismos contra PDAC. Por exemplo, foi demonstrado recentemente que EMAP melhora efeitos gemcitabina com combinação bevacizumab contra PDAC [34]. Adicionando um multi-TKR agente de segmentação, como sunitinib apareceu, portanto, sensato. Gemcitabina teve resposta inibidor do crescimento diferencial em células PDAC in vitro. A gemcitabina foi observada sensibilidade na ordem de BxPC-3 MIA PaCa-2 Panc-1 ASPC-1, indicando BxPC-3 como mais sensível e ASPC-1 como mínimo, por células sensíveis (Figura S3). Talvez seja esta uma abordagem bastante útil que permite o teste de mecanismos adicionais para uma combinação in vivo benefício em contraste com as linhas PDAC que são sensíveis a gemcitabina. Entre os agentes anti-angiogénicos, bevacizumab e EMAP sozinho não teve qualquer efeito significativo na proliferação AsPC-1, enquanto o sunitinib foi muito eficaz. O efeito foi mais forte do que o sunitinib gemcitabina equimolar, enquanto que a adição de dois ou mais agentes anti-angiogénicos não foi mais inibitória que o sunitinib sozinho. Como esperado, todos os três agentes anti-angiogénicos, inibiram significativamente a proliferação de fibroblastos CE e in vitro, com sunitinib sozinha de novo sendo o mais eficaz. Nos nossos estudos, uma vez que sunitinib teve máxima actividade in vitro para as células tumorais, células endoteliais e fibroblastos, que suporta a hipótese de que in vivo actividades antitumorais de sunitinib podem parcialmente depende do seu impacto sobre as células tumorais, bem como os componentes da vasculatura do tumor e de estroma, como anteriormente relatada [20],. Mendel et al. [20] mostrou que o sunitinib IC
50 VEGF e para-induzida PGDF HUVECs estava numa gama nanomolar. Observou-se uma actividade relativamente fraca de sunitinib no presente estudo; assume-se que isto é devido ao uso de meio de crescimento completo para HUVECs, o que pode tornar as células mais resistentes aos efeitos inibidores de tirosina-quinase. Estes resultados suportam a noção de que os benefícios podem ser obtidos a partir de combinações de agentes sobre a segmentação de vários agentes com alvos limitados sozinho, ou em adição aos mesmos. A gemcitabina e sunitinib foram mostrados para induzir a apoptose em células tumorais, bem como as células endoteliais [49], [50], [51], [52], enquanto que o bevacizumab e EMAP principalmente possuem actividade pró-apoptótica em relação às células endoteliais [28], [53 ]. No presente estudo, a avaliação da indução da apoptose por gemcitabina e agentes anti-angiogénicos, quer isoladamente ou em combinação, foi correlacionada com os resultados da proliferação de células indicando que a perda de viabilidade celular por esses agentes podem, em parte, ser devido à indução da apoptose.
estudos in vivo de xenoenxerto de murino demonstraram que a gemcitabina, bevacizumab, sunitinib e EMAP inibiu o crescimento do tumor local como agente único. Efeitos antitumorais de bevacizumab e EMAP são mais provavelmente devido ao seu efeito em células endoteliais e fibroblastos, em vez de células de tumor e, consequentemente, o impacto destes agentes em monoterapia era limitada.