Abstract

Há provas irrefutáveis ​​demonstrou que a expressão aberrante do ser humano antigénio da superfície celular trofoblasto (TROP2) foi associada com a agressividade do tumor e o prognóstico pobre em uma variedade de cancros humanos, no entanto o papel de TROP2 no cancro do colo do útero não foram investigadas. O objetivo do nosso estudo foi elucidar o significado prognóstico da expressão TROP2 em pacientes com câncer cervical e determinar seu efeito sobre a progressão do tumor. ensaio imuno-histoquímica mostrou que 88,7% (94/106 casos) dos espécimes de câncer cervical foram positivamente coradas com TROP2, ea superexpressão de TROP2 estava intimamente relacionado com o estágio FIGO, graus histológicos, metástase linfática, invasivo profundidade intersticial e alta expressão de Ki-67 . Pacientes com coloração TROP2-positivos exibiram uma diminuição significativamente a sobrevida global ea sobrevida livre de progressão; ele também foi um preditor independente para o prognóstico de acordo com a análise multivariada. Além disso, a sub-regulação de TROP2 mediada por siRNA em células SiHa e CaSki resultou numa forte inibição da proliferação e invasão, TROP2 revogação também elevada a proporção de apoptose e causou a paragem em G1. Por outro lado, imposta expressão de TROP2 em células HeLa e C33A notavelmente promoveu o crescimento celular, migração e invasão. Além disso, a função de tumorigénico TROP2 foi associada com o aumento de expressão de ciclina D1, ciclina E, CDK2 e CDK4, mas reduzida expressão de p27 e E-caderina através da activação da via de sinalização de ERK1 /2. Além disso, a inibição da expressão TROP2 em linhas celulares de cancro do colo do útero, aumenta a sensibilidade ao cisplatino. O presente estudo sugerem que a superexpressão de TROP2 pode desempenhar um papel crucial no desenvolvimento e patogénese do cancro do colo do útero humano, portanto, TROP2 pode representar um indicador prognóstico prospectiva e um potencial alvo terapêutico do câncer cervical

Citation:. Liu T , Liu Y, Bao X, Tian J, Liu Y, Yang X (2013) superexpressão do TROP2 prediz mau prognóstico de doentes com cancro do colo do útero e promove a proliferação e invasão das células cancerosas do colo do útero através da regulação ERK via de sinalização. PLoS ONE 8 (9): e75864. doi: 10.1371 /journal.pone.0075864

editor: Irina U. Agoulnik, Universidade Internacional da Flórida, Estados Unidos da América

Recebido: 10 de maio de 2013; Aceito: 22 de agosto de 2013; Publicação: 27 de setembro de 2013

Direitos de autor: © 2013 Liu et al. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Licença Creative Commons Attribution, que permite uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o autor original ea fonte sejam creditados

Financiamento:. O projeto foi apoiada pela National Science Foundation Natural da China e da Ciência (No. 81.372.809) e Tecnologia Planejamento do Desenvolvimento da Província de Shandong (No. 2011GSF12121). Os financiadores não tiveram nenhum papel no desenho do estudo, coleta de dados e análise, decisão de publicar ou preparação do manuscrito

CONFLITO DE INTERESSES:.. Os autores declararam que não existem interesses conflitantes

Introdução

o câncer cervical é a terceira neoplasia maligna mais prevalente entre as mulheres em todo o mundo [1], com aproximadamente 530.000 novos casos e 275.000 mulheres morte estimado a cada ano.

pacientes em início de carreira (I-IIA) pode obter um resultado satisfatório através de cirurgia radical ou radioterapia, com uma sobrevida global em 5 anos de 65%. No entanto, os pacientes com estágio avançado (IIB-IV) só podem ser tratados com radioterapia ou mais quimioterapia, a taxa de sobrevida em 5 anos para pacientes com estágio III é de 25 a 35%, mas para a fase IV é de 15% ou menos [2] , [3]. Existem vários fatores de alto risco são pensados ​​para ser intimamente associada com a evolução clínica desfavorável, incluindo Federação Internacional avançado de Obstetrícia e Ginecologia fase (FIGO), grande tamanho do tumor, metástase linfonodal, invasão profunda do estroma cervical e linfovascular invasão do espaço. Os pacientes com os fatores de alto risco sempre desenvolver resistência à quimioterapia e radioterapia, finalmente morreu de recorrência local ou metástases à distância. Portanto, há uma necessidade urgente de olhar para novos biomarcadores como um indicador preditivo complementar para o diagnóstico precoce e avaliação precisa prognóstico, o que seria útil na segmentação terapias de câncer cervical.

antigénio de superfície celular Trophoblast 2 (TROP2) é uma glicoproteína transmembranar de 36 kDa que pertence ao transdutor de sinal de cálcio associado ao tumor (TACSTD) família de genes. Foi originalmente identificada em linhas de células de trofoblastos humanos, e expressão aumentada foi encontrada em vários tipos de carcinomas epiteliais enquanto baixo ou expressão restrita foi encontrado em tecidos normais [4]. Além TROP2, molécula de adesão de células epiteliais (EpCAM) gene é o outro membro da família altamente conservadas de genes TACSTD, que partilham 49% de homologia de sequência com ambos tiroglobulina tipo I e receptores de interleucina-2 [5]. Embora a regulação da expressão do gene TROP2 não é totalmente compreendido, os locais de fosforilação da região cauda citoplasmática e um local de fosforilação de tirosina e serina conservadas são considerados para desempenhar um papel importante na transdução de sinal. Os primeiros estudos descobriram que cross-linking TROP2 com anticorpos resultar na cálcio citoplasmático [Ca

2 +] aumentou em três vezes do que o nível basal, que sugeriu uma mobilização de Ca

2 + das lojas internas [6]. Quando fosfatidilinositol 4, 5-bis fosfato (PIP2) de ligação à cauda citoplasmática de TROP2, poderia resultar potencialmente num aumento de inositol 1,4,5-trifosfato (IP3), que é essencial para o Ca

2+ mobilização . Com mais de Ca

2+ libertado a partir do retículo endoplasmático, a proteína quinase C (PKC) pode ser activado um mecanismo de feedback positivo que pode por sua vez conduzir à fosforilação de mais TROP2, este processo pode ter um efeito significativo sobre a activação das vias Raf, MAPK e NF-kB e assim por diante [7].

um trabalho recente demonstrou que TROP2 comportou-se como um verdadeiro oncogene que conduz à tumorigénese e invasividade em linhas celulares de cancro colorrectal [8], e o superexpressão de TROP2 estava intimamente associado com a progressão do câncer e de prognóstico reservado. Pesquisadores descobriram que a ciclina D1 bicistr�ica-TROP2 mRNA era frequentemente expressa em ovário, cancros do cólon e endométrio, e ambas as metades TROP2 e ciclina D1 na quimera poderia induzir a transformação maligna de células [9]. Estes resultados indicam que todos os TROP2 é não só um biomarcador potencial de prognóstico, mas também candidato como um alvo terapêutico que pode ser empregue no desenvolvimento de estratégias terapêuticas inovadoras. No presente estudo, investigamos a expressão da proteína TROP2 e sua correlação com as características clínico-patológicas e resultados clínicos em amostras de cancro do colo do útero. Além disso, foram avaliados os efeitos da expressão TROP2 sobre a proliferação, ciclo celular e invasão em quatro linhas celulares de cancro do colo do útero, também determinado se TROP2 desempenha um papel na quimioterapia do câncer cervical. Estes dados podem fornecer informações para a predição de prognóstico do câncer do colo do útero e do estabelecimento de terapias direcionadas.

Métodos

Informação clinicopatológico de pacientes com câncer cervical

Um total de 160 amostras obtidas por biópsia, biópsia em cone ou histerectomia foram recuperados do Departamento de Patologia da Qilu Hospital da Universidade de Shandong entre abril de 2005 a outubro de 2007 (Tabela 1). O estudo incluiu 106 pacientes com câncer de colo uterino (idade média de 43,6 ± 11,5 anos), 34 pacientes com neoplasia intra-epitelial cervical (NIC) (idade média de 40,2 ± 8,1 anos) e 20 pacientes com tecidos cervicais normais (idade média de 46,4 ± 4,8 anos). amostras de tecido cervical normal foram obtidos de pacientes que foram submetidos a histerectomia por leiomioma benigno. Todos os participantes inscritos tinha informações intactas de seguimento e não foram expostos à radioterapia ou quimioterapia antes da ressecção cirúrgica. Os espécimes foram histologicamente confirmados por três patologistas de acordo com os critérios de diagnóstico. estágio clínico do câncer cervical foi classificada de acordo com a Federação Internacional de Ginecologia e Obstetrícia (FIGO critérios). Durante o período de seguimento (mediana de acompanhamento, 60 meses; gama 9.6-82.5 meses), 68 pacientes (64,15%) estavam vivos e 38 pacientes (35,85%) foram mortos. Este estudo foi analisado e aprovado pelo Comitê Institucional de Ética Médica da Qilu Hospital, Universidade de Shandong. Todos os participantes desde que o seu consentimento informado por escrito para ser envolvido neste trabalho.

Imunohistoquímica

coloração imuno-histoquímica foi realizada em 4 mm de espessura dos tecidos embebidos em parafina, e o processo de coloração foi realizada estritamente de acordo com o método do complexo biotina-estreptavidina-peroxidase. Após deparaffinisation e re-hidratação, as secções foram tratadas com peróxido de hidrogénio a 3% para bloquear a peroxidase endógena. A ligação não específica foi bloqueada com soro de cabra normal durante 30 minutos a 37 ° C, em seguida, as secções foram incubadas com anti-TROP2 (Santa Cruz, EUA, 1:500 diluição) ou anticorpo monoclonal anti-Ki-67 (Dako, lostrup , Dinamarca, 1:100 diluição) durante a noite a 4 ° C. Após lavagem com PBS, as secções foram incubadas com um anticorpo marcado com peroxidase de rábano-polímero conjugado anti-ratinho secundário (Beijing Zhong Shan Biotech Co. Ltd, Pequim, China), a 37 ° C durante 30 min. Em seguida, as secções foram coradas com tetracloridrato de 3,3-diaminobenzidina durante 5 min e os núcleos foram contrastadas com hematoxilina durante 3 min, e em seguida, montado com bálsamo neutro. PBS foi usado para substituir o anticorpo como um controlo negativo.

Avaliação e quantificação de imunocoloração

Os resultados de positividade foram avaliados por três patologistas que foram cegados para os detalhes clínicos dos pacientes. TROP2 expressão foi definido como a presença de coloração da membrana amarela-castanha de células tumorais. Cada amostra deve ser estimado incluindo a intensidade da coloração e a percentagem de células tumorais positivas com nada menos que 1.000 células e 5 campos de alta potência. A intensidade de coloração foi pontuada como 0 (negativa), 1 (fraca), 2 (moderado) e 3 (forte), enquanto que a percentagem de células positivas foi pontuada como 0 (0%), 1 (1-10%), 2 (11-50%) e 3 (51-100%). Os resultados globais coloração imuno-histoquímica foram com base na pontuação intensidade × pontuação coloração percentual da seguinte forma: – (pontuação 0); + (Pontuação 1, 2, 3); ++ (Pontuação 4, 6); +++ (Escore 9) [10]. Para Ki-67, o índice de marcação (LI) foi avaliada como a percentagem de células com coloração nuclear entre 1.000 células tumorais invasivas em aleatoriamente selecionado, a pontuação final de Ki-67 foi categorizado em quatro grupos com base no índice de marcação e localização de coloração nuclear como descrito anteriormente [11]. A classificação era a seguinte: -, ( 10%, restrito para as camadas de células parabasais); +, (10% para 30%, exclusiva do terço inferior do epitélio); ++, (30 a 70%, atingindo o terço superior do epitélio); +++ (70% ou mais das células epiteliais, incluindo a espessura total de iões de expresso de Ki-67).

Cultura celular

Quatro linhas celulares de cancro cervical humano CaSki, Siha, HeLa e células C33A foram adquiridos a partir da American Type Culture Collection (Manassas, VA, EUA), cultivadas em meio Eagle Dulbecco modificado (DMEM; Gibco Inc., Carlsbad, CA, EUA) contendo soro fetal de bovino 10% (Invitrogen, Carlsbad, CA , EUA) e 1% de penicilina-estreptomicina (Invitrogen) numa incubadora humidificada a 37 ° C e 5% de CO

2 atmosfera.

coloração por imunofluorescência de células

SiHa e CaSki foram cultivadas em lâminas de vidro em uma placa de 6 poços e incubadas durante 24 h. As células foram fixadas com paraformaldeído a 4% e bloqueadas com soro de cabra normal durante 30 minutos a 37 ° C. Depois de lavagem cuidadosa com solução salina tamponada com Tris (TBS), as células foram incubadas com anticorpo monoclonal anti-TROP2 primária (Santa Cruz, EUA, 1:500 diluição) durante a noite a 4 ° C e coradas com FITC de murganho anti-IgG conjugado (Beijing Zhong Shan Biotech Co. Ltd, Beijing, China, 1:200 diluição) durante 30 min. O TROP2 marcados com fluorescência foi observada sob um microscópio de fluorescência e fotografia foi tirada.

Células Transfec�es

Para derrubar expressão TROP2 endógena, dois pares de sequências de siRNA segmentação TROP2 foram concebidos e sintetizados por Genepharma Co., Ltd (Xangai, China). Estas sequências foram: siARN-1100, 5′-GCACGCUCAUCUAUUACCUTT-3 ‘, 5′-AGGUAAUAGAUGAGCGUGCTT-3; siRNA-550, 5’-CCAAGUGUCUGCUGCUCAATT-3 ‘, 5′-UUGAGCAGCAGACACUUGGTT-3’. As sequências de controlo negativos precipitação foram: 5′-UUCUCCGAACGUGUCACGUTT-3 ‘, 5′-ACGUGACACGUUCGGAGAATT-3’. Para estudar os efeitos da TROP2 aplicada expressão, o plasmídeo que expressa TROP2 isoforma foi empregue em células HeLa e células C33A. O ADNc de comprimento completo foi amplificado TROP2 humano e inserido no vector pcDNA 3.1 (Genepharma Co., Ltd Xangai, China) para se obter pcDNA3.1-TROP2. Para a transfecção, as células foram semeadas em placas de 6 poços e espera-se ser de 50% de confluência no dia seguinte. Após a fixação das células, TROP2 siRNA ou o pcDNA3.1-TROP2 recombinante foram transfectados em células em Opti-MEM (Invitrogen) usando o reagente de transfecção Lipofectamime 2000 (Invitrogen) de acordo com as instruções do fabricante, o meio de cultura foi substituído após 6 horas de incubação. Após 48 horas da transfecção, as células foram contadas e submetidas a ensaio de viabilidade celular e análise de Western blot. células não transfectadas foram pensados ​​para ser controlo em branco, as células transfectadas com siRNA mexidos ou pcDNA3.1 (vector vazio) foram considerados como controle negativo.

Viabilidade Celular Ensaio

A viabilidade celular foi determinada utilizando uma célula contando kit-8 (CCK-8) de acordo com o protocolo do fabricante (Jingmei biotecnologia, Xangai, China). Resumidamente, o controlo e as células transfectadas foram semeadas a 5000 por poço em placas de 96 poços, depois de tratados com cisplatina (Sigma, St. Louis, MO, EUA) ou inibidor MEK U0126 (Cell Signaling Technology, Beverly, MA, EUA) em indicado Os pontos de tempo, 10 ul de CCQ-8 foi adicionada a cada poço, em seguida, incubou-se durante mais 2 h a 37 ° C. A densidade óptica (OD) foi medida utilizando um leitor de microplacas (Bio-Rad modelo 680, Richmond, CA, EUA) a 450 nm de comprimento de onda. As concentrações inibidoras de 50% de proliferação (IC50) de cisplatina foram calculados pelo software GraphPad Prism. A experiência foi repetida três vezes.

Ensaio de Apoptose

A 48 h após a transfecção, as células foram recolhidas e lavadas duas vezes com PBS frio, ressuspenderam-se em 400 uL de tampão de ligação de anexina V-FITC a uma densidade de 1 × 10

6 células /ml. As células foram coradas com 5 ul de anexina V-FITC e 10 ul de iodeto de propidio (PI) de acordo com o Kit de Detecção de apoptose (Jingmei Biotech, Xangai, China) instruções. Em seguida, submetido a citometria de fluxo (BD, San Jose, CA, EUA) para detectar a apoptose celular. Este experimento foi realizado três vezes.

Cell Cycle Analysis

As células transfectadas com TROP2 siRNA ou pcDNA3.1-TROP2 foram colhidas às 48 h após a transfecção, recolhidos por tripsinização e fixados em 75% a frio etanol durante 1 h a -20 ° C. Depois de ter sido lavada com PBS, as células foram incubadas com 100 ul de ARNase A (100 ug /ml) e 400 ul de iodeto de propídio, respectivamente durante 30 min a 37 ° C. Finalmente, o ciclo celular foi medido por citometria de fluxo utilizando um citómetro de fluxo FACScan (BD, San Jose, CA, EUA) a 488 nm, e as proporções relativas do G1, S, G2 e fases foi analisada por FlowJo 2,8 software. O experimento foi realizado em triplicado.

ensaio de cicatrização de feridas Ensaio

A monocamada cicatrização de feridas foi utilizado para avaliar a capacidade de migração celular. As células (5 × 10

5) foram semeadas em placas de 6 poços, incubadas durante a noite, em seguida, transfectadas com ARNsi TROP2 ou pcDNA3.1-TROP2. Depois de atingir 90% de confluência, a monocamada de células foi riscada com uma ponta de pipeta estéril, as células flutuantes foram removidos com PBS e cultivadas novamente em meio RPMI 1640 contendo 1% de FBS. As imagens fotográficas foram tomadas em 0, 24 e 48 h ao longo da linha de raspagem por microscópio. Os resultados foram expressos como a largura zero relativa, com base na distância migrada em relação à distância riscado inicial. O experimento foi realizado em triplicado.

celular Invasion Ensaio

A capacidade invasiva de células de câncer do colo do útero foi avaliada através de um poço de 24 transpoço câmara (kit de ensaio de células invasão), calculando-se as células passaram através de uma membrana de policarbonato (8 mícrons de tamanho de poro) (Corning Costar, Nova Iorque, EUA). A superfície de cada câmara de policarbonato foi coberta com 20 uL de matrigel (BD Biosciences, EUA; 01:04 de diluição) para criar uma membrana basal artificial. As células (1 x 10

5 células) transfectadas com ARNsi TROP2 ou pcDNA3.1-TROP2 foram suspensos em 200 ul 1640 isento de soro e cultivadas na câmara superior Transwell durante 24 h a 37 ° C, a câmara inferior foi preenchidos com 600 uL de 1640 suplementado com 10% de FBS. As células não-invasor que aderem à superfície superior da membrana foram removidos com uma mecha de algodão estéril, e as células de invasão penetraram através da membrana foram coradas com violeta de cristal a 0,1% durante 20 min à temperatura ambiente. Os números de células foram calculados sob um microscópio Leica em oito campos aleatórios. A experiência foi repetida três vezes para cada grupo.

Hoechst 33258 Coloração

24 h após a transfecção, as células transf ectadas e as células de controlo foram expostas a diferentes concentrações de cisplatina durante 48 h. Em seguida, as células foram fixadas com paraformaldeído a 4% durante 15 minutos, seguido por coloração com 100 ug /ml de Hoechst 33258 (Beyotime, Xangai, China) à temperatura ambiente no escuro durante 30 minutos, as características apoptóticas foram avaliadas pela observação a condensação da cromatina ou fragmentos sob um microscópio de fluorescência com um comprimento de onda de excitação de 340-360 nm.

Análise Western Blot

quantidade equivalente de amostras de proteína celular foram carregados sobre sulfato de electroforese em gel de poliacrilamida a 10% de dodecil de sódio (SDS -Página) e transferidas para membranas de PVDF utilizando o sistema Bio-Rad electrotransferência. Depois de bloqueadas em 5% de leite em pó desnatado w /v, durante 1 h, as membranas foram incubadas com anticorpos primários específicos para TROP2 (Santa Cruz Biotechnolog, CA, EUA; 1:1000 diluição), E-caderina, ciclina D1, ciclina E, CDK2, CDK4, ERK1 /2, P-ERK1 /2, P27, Bcl-2 e Bax (Cell Signaling Technology, Beverly, MA, EUA; 1:1000 diluição) durante a noite a 4 ° C. Em seguida, incubaram-se com anticorpo secundário de coelho anti-ratinho conjugado com peroxidase de rábano (Beijing Zhong Shan Biotech Co. Ltd, Pequim, China; 1:4000 diluição) durante 1 h, as bandas de proteína foram visualizadas por quimioluminescência aumentada (Millipore) e analisado densitometricamente usando Quantidade Um software de imagem (Bio-Rad, EUA). β-actina (Beijing Zhong Shan Biotech Co. Ltd, Beijing, China; 1:1000 diluição) foi utilizado como controle interno para carga de proteína e análise

Análises Estatísticas

SPSS (SPSS Inc. , Chicago, IL, EUA) 18,0 software foi utilizado para realizar a análise estatística.

os dados quantitativos foram expressos como os valores médios ± desvio padrão (SD). Diferenças entre os grupos foram avaliadas pelo teste t de Student não pareado ou ANOVA de uma via. foi usada Pearson teste qui-quadrado ou teste exato de Fisher para análise entre o grau de coloração e parâmetros clínicos, análise de correlação foi realizada com coeficiente de Spearman. As curvas de Kaplan-Meier foram plotados para descrever as informações sobrevida pelo teste de log-rank. A análise multivariada foi realizada utilizando modelo de riscos de regressão proporcional de Cox. P 0,05 foi considerado estatisticamente significativo

Resultados

TROP2 é Over-expressa em altamente proliferativas cancros cervicais

No total, 160 amostras foram determinados por imuno-histoquímica, incluindo 20 normal. tecidos cervicais, 34 tecidos CIN e 106 tecidos de câncer do colo do útero. Os dados demográficos e as características do tumor são descritos na Tabela 1. Nenhum dos pacientes tinha recebido radioterapia ou quimioterapia antes da cirurgia. De acordo com os critérios definidos antes, 55% de amostras cervicais normais apresentaram expressão TROP2 indetectável, 40% e 5% de amostras apresentado coloração fraca e moderada, predominantemente detectada em epitélio escamoso ectocervical (Figura 1A e B). Curiosamente, a expressão de TROP2 foi gradualmente aumentada de CINI (50%) para NICII (66,7%) e NICIII (76,9%; Figura 1C) (p = 0,037), indicando a expressão TROP2 foi significativamente correlacionado com o desenvolvimento e progressão do cancro do colo do útero . Além disso, a coloração intensa do membranoso TROP2 foi detectado na maioria (88,7%) de casos de cancro cervical, enquanto as células estromais foram regularmente negativo (Figura 1D, E e F). A análise estatística mostrou que o nível de expressão TROP2 em casos de cancro cervical foi significativamente mais elevada do que em tecidos cervicais normais e tecidos CIN (p 0,001).

A-B. expressão TROP2 negativa e fraca em tecidos cervicais normais. C. CIN III com coloração da membrana TROP2 forte (pontuação +++). D-E. expressão TROP2 fortes e fracos no carcinoma de células escamosas do colo do útero (pontuação +++, +). F. expressão forte TROP2 no adenocarcinoma do colo do útero (pontuação +++). G-H. expressão Ki-67 em NICIII e câncer cervical (pontuação ++, +++). Ampliações: × 200 (A, B, C, D, E) e × 400 (F, G, H)

Por uma questão de verificar a associação entre a expressão TROP2 e progressão do cancro, nós. também analisaram a expressão de Ki-67 nos mesmos conjuntos de amostras de colo do útero através do teste de imuno-histoquímica (Figura 1G e H). Ki-67 tem demonstrado ser um marcador proliferativa comum e usada para avaliar muitas lesões malignas de cancros. A análise estatística revelou que houve uma correlação significativa entre o aumento da coloração TROP2 e células Ki67-positivas que proliferam em amostras de cancro do colo do útero (p 0,001; Tabela 2)., que indicou que TROP2 foi sobre-expressos em células cancerosas cervicais humanos altamente proliferativas

correlação entre a expressão TROP2 e características patológicas clínicas

Os significados clínicos de TROP2 superexpressão em pacientes com câncer de colo uterino foram resumidos na tabela 1. Os resultados mostraram que os níveis de expressão TROP2 foram significativamente diferentes entre os grupos no que diz respeito ao grau histológico (p 0,001), metástase linfático (P = 0,001), a profundidade intersticial invasiva (p 0,001), fase Figo (p 0,001) e histológico-subtipo (p = 0,023). No entanto, não houve associação significativa entre a expressão TROP2 e idade (p = 0,100), o tamanho do tumor (p = 0,255).

alta expressão de TROP2 correlaciona-se com mau prognóstico no câncer cervical

Para avaliar o impacto da expressão TROP2 e características clínico-patológicas sobre os resultados clínicos dos pacientes, utilizou-se análise de Kaplan -Meier eo teste de log-rank para dados de sobrevivência censuradas. Como apresentado na Figura 2, as curvas de sobrevida de Kaplan-Meier mostrou que pacientes com expressão positiva TROP2 teve pior sobrevida global (OS) em comparação com aqueles sem expressão TROP2 (p 0,01), sobrevida livre de progressão (PFS) também diminuiu gradualmente com o aumento da TROP2 pontuações de expressão (p 0,01). Pela análise univariada, encontramos que as características clínico-patológicas, incluindo estágios avançados Figo, grau histológico mal, metástase linfática positiva e mais profunda invasiva profundidade intersticial teve um resultado clínico significativamente inferior (Tabela 3). Em seguida, a expressão de TROP2, bem como todos as variáveis ​​estatisticamente significativas avaliadas nas análises univariadas foram examinadas por análise multivariada modelo de regressão de Cox. TROP2 superexpressão da proteína, juntamente com grau histológico e metástases linfáticas foram identificados como fatores preditivos independentes para pobres OS (p = 0,022, p = 0,023 e p = 0,002, respectivamente) e PFS (p = 0,016, p = 0,04 e p = 0,005 , respectivamente).

TROP2 promove a proliferação celular em células de cancro do colo

Dada a evidência de que TROP2 elevada expressão foi intimamente associado com a agressividade do tumor e mau prognóstico clínico, ainda mais investigou as consequências funcionais de expressão TROP2 em linhas celulares de cancro do colo do útero. Primeiro de tudo, nós examinamos a expressão TROP2 em quatro linhas celulares de cancro do colo do útero Siha, HeLa e CaSki e C33A por Western blot (Figura 3A). Consistente com o ensaio de imuno-histoquímica, proteína TROP2 era, evidentemente, detectado em todas as linhas celulares em cerca de 36 células kDa, Siha e CaSki mostrou relativamente mais elevada expressão TROP2, enquanto sua expressão era fraco em células HeLa e C33A. Através de análise de imunofluorescência descobrimos que havia uma camada de coloração verde fluorescente do cytomembrane de Siha e células CaSki (Figura 3B). Para explorar melhor as funções biológicas de TROP2, foram identificados e validados duas sequências de siRNA independente e não sobrepostos para esgotar TROP2 expressão endógena em células SiHa e CaSki, HeLa e células C33A foram transfectadas com pcDNA3.1-TROP2 para aumentar a expressão TROP2. As células transfectadas com ARNsi mexidos ou pcDNA3.1 foram considerados como controlo negativo, as células não transfectadas foram usadas como controlo em branco. De acordo com os resultados de Western blot às 48 h pós-transfecção (Figura 3C), o nível de proteína de TROP2 exibida uma variação significativa, as duas sequências de siRNA todas conduzem a expressão TROP2 reduzida em 50% -80% das células SiHa e CaSki, e pcDNA3.1-TROP2 foi capaz de produzir pelo menos 30% up-regulação da expressão TROP2 de células HeLa e C33A.

a. A expressão de TROP2 foi encontrada em quatro linhas celulares de cancro do colo do útero por Western blot, as células SiHa e CaSki mostraram maior expressão em comparação com células HeLa e células C33A, β-actina foi utilizado como controlo interno. B. Imunofluorescência ensaio demonstrou que havia uma camada de coloração verde fluorescente do cytomembrane em células SiHa e CaSki. análise de mancha ocidental C. para confirmar o siRNA knockdown mediado e pcDNA3.1-TROP2 sobreexpressão mediada de TROP2 em diferentes linhas celulares de cancro do colo do útero. D. As células foram transfectadas com ARNsi TROP2 ou pcDNA3.1-TROP2, a viabilidade foi avaliada utilizando um ensaio de CCK-8 em cinco pontos de tempo (0, 1, 2, 3, 4 dias, respectivamente). Aos 2 dias após a transfecção, knockdown de TROP2 provocou um efeito significativo de inibição sobre a proliferação celular em células SiHa e CaSki, enquanto que a expressão forçada de TROP2 aumentaram a viabilidade das células de HeLa e células C33A. Os dados são expressos como média ± DP de três experiências independentes, * p 0,05, ** p . 0,01

ensaio CCK-8 foi utilizado para determinar o efeito da expressão TROP2 sobre a proliferação celular. Os nossos resultados mostraram que knockdown de TROP2 evocado um efeito de inibição marcadamente na proliferação após a transfecção em células SiHa e CaSki (p 0,05), enquanto que a viabilidade das células no grupo de transfecção pcDNA3.1-TROP2 foi melhorada significativamente (p 0,05; Figura 3D). Combinado com os nossos resultados imuno-histoquímica mostrou que TROP2 foi altamente expressa em células em proliferação Ki67 positivas, estes dados indicam que a expressão de TROP2 aumentou a viabilidade celular das células de cancro cervical.

Impacto de TROP2 expressão em celular e apoptose celular Ciclo

foi demonstrado que a apoptose de células desempenha um papel importante na progressão e desenvolvimento de tumores, que mais explorado se a inibição da proliferação celular devido à função induzida por apoptose. A citometria de fluxo foi utilizada para determinar a apoptose celular em 48 h após a transfecção. Os resultados demonstraram que as taxas de apoptose de células totais do grupo de transfecção TROP2 siARN (siARN-1100 e siRNA-550) foi significativamente mais elevada em comparação com o grupo de controlo negativo em ambas as células SiHa e CaSki (p 0,05; Figura 4A). Enquanto isso, a tendência de apoptose celular precoce e taxas de apoptose de células final foi consistente com o das taxas totais de apoptose celular. Pelo contrário, aplicada expressão de TROP2 apoptose celular significativamente inibida, as proporções de células positivas para anexina V e iodeto de propidio foram evidentemente diminuída em células HeLa e células C33A, em comparação com células não tratadas e células pcDNA3.1 transfectadas (P 0,01, respectivamente; A Figura 4B). Para explorar melhor os mecanismos moleculares subjacentes pelos quais TROP2 knockdown induz a apoptose, foi investigada a expressão de Bcl-2 e Bax por Western blot (Figura 4C). Os resultados mostraram que a expressão da proteína Bcl-2 foi obviamente diminuiu enquanto Bax foi marcadamente aumentada em ambas as SiHa e CaSki células transfectadas em comparação com células de controlo (siARN) mexidos. Em contraste, as células HeLa e C33A transfectadas com pcDNA3. 1-TROP2 exibiu o efeito oposto (Figura 4D). Estes resultados demonstraram que o efeito anti-apoptótica de TROP2 é conseguido através upregulating diretamente Bcl-2 expressão e inibição da activação do Bax.

A. A regulação negativa da apoptose induzida TROP2 celular em células SiHa e CaSki. As células foram colhidas às 48 h após a transfecção, seguido por ensaio de apoptose utilizando o kit de detecção de apoptose FITC anexina V-. As células nos quadrantes inferiores e superiores direito são considerar cedo e apoptose tardia, respectivamente, nos quadrantes superior esquerdo são considerados como células mortas. Os resultados foram analisados ​​pelo software FlowJo. B. forçado expressão de TROP2 apoptose das células C. A análise Western blot mostrou que inibiu significativamente a sub-regulação de TROP2 reduzida a expressão de Bcl-2 e aumentou a expressão da Bax, em células SiHa e CaSki. D. forçado expressão de TROP2 em células HeLa e células C33A aumentou a expressão de Bcl-2 e Bax reduziu a expressão. Estes dados são expressos como média ± DP de três experiências independentes, * p 0,05, ** P . 0,01

Para se obter uma compreensão mais detalhada da função do gene TROP2, investigou ainda mais os efeitos de expressão TROP2 sobre o ciclo celular por análise de citometria de fluxo. Como mostrado na Figura 5A, os resultados indicaram que a depleção de resultados de expressão TROP2 na acumulação de células em fase G1 e a redução de células na fase S em 48 h após transfecção (p 0,05). Em contraste, a expressão forçada de TROP2 em células HeLa e células C33A mostraram uma redução significativa de células em fase G1, mas um aumento de células na fase S e na fase G2-M (p 0,05; Figura 5B). Os resultados indicaram que TROP2 foi capaz de aumentar a proliferação de células cancerosas do colo do útero através da promoção de transições G2-M G1-S e.

A. Knockdown de TROP2 induzida prisão G1 em células SiHa e CaSki. células SiHa e CaSki foram transfectadas com TROP2 siRNA ou mexidos siRNA. 48-regulação da TROP2 induzida paragem do ciclo celular na fase G1. B. A sobre-expressão de TROP2 promovido transições G2-M G1-S e em células HeLa e células C33A. C, D. TROP2 regulados fatores do ciclo celular via ERK1 /2 via de sinalização em células de cancro do colo do útero. Siha e células CaSki (C) foram transfectadas com ARNsi TROP2 mexidos ou ARNsi.