Sumário

Imunoterapias como transferência adoptiva de células T ou células natural killer, ou tratamento com anticorpo monoclonal (MoAb) foram recentemente reconhecidas como meios eficazes para tratar pacientes com câncer. No entanto, a transferência adoptiva de células B ou células do plasma produtoras de anticorpos específicos de tumor não tem sido aplicada como uma terapia porque a cultura a longo prazo e a expansão selectiva de células B específicas do antigénio tem sido tecnicamente muito difícil. Aqui, descrevemos a imunoterapia do cancro romance que utiliza a transferência adoptiva de células B. Nós demonstramos que as células B-germinal centers como iGB (células induzidas) in vitro a partir de células B virgens rato se tornarem células plasmáticas e produzir anticorpos IgG por mais de um mês na medula óssea de ratinhos não irradiadas destinatário. Quando transferidos para ratinhos, as células produtoras de anticorpos iGB contra um antigénio tumoral substituto suprimida metástase do pulmão e o crescimento de células de melanoma de ratinho que expressam o mesmo antigénio e sobrevivência prolongada dos destinatários. Além disso, temos desenvolvido um sistema de cultura de novo chamado FAIS para expandir selectivamente as células iGB específicas de antigénio utilizando o facto de que as células iGB são sensíveis à morte celular induzida por Fas, a menos que os seus receptores de antigénios estão ligados por antigénios ligados à membrana. As células seleccionadas iGB eficientemente suprimidos metástases pulmonares de células do melanoma no modelo de imunoterapia adoptiva. Como as células de sangue humano B pode ser propagada como células iGB utilizando condições de cultura similares às do rato culturas de células iGB, os nossos dados sugerem que será possível tratar os pacientes com cancro por transferência adoptiva de células iGB específico do cancro para o antigénio seleccionado em vitro. Esta nova imunoterapia adoptiva deve ser uma alternativa para o desenvolvimento laboriosa de drogas Moabe, contra cancros para os quais existem atualmente nenhum tratamento eficaz

Citation:. Moutai T, Yamana H, Nojima T, Kitamura D (2014) e A Novel Cancer Imunoterapia eficaz rato modelo usando células B antígeno-específica selecionada In Vitro. PLoS ONE 9 (3): e92732. doi: 10.1371 /journal.pone.0092732

editor: Yoshiki Akatsuka, Universidade Fujita Saúde, Faculdade de Medicina, Japão

Recebido: 28 de dezembro de 2013; Aceito: 24 de fevereiro de 2014; Publicação: 19 de março de 2014

Direitos de autor: © 2014 Moutai et al. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Licença Creative Commons Attribution, que permite uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o autor original ea fonte sejam creditados

Financiamento:. Este trabalho foi apoiado por Takeda Science Foundation, Grants-in-Aid para a Investigação científica (B) (22.390.097) do Japão Sociedade para a Promoção da Ciência (JSPS) e Grants-in-Aid para a Investigação científica em Áreas prioritárias (22021042) do Ministério de Educação, Cultura, Desporto, Ciência e Tecnologia do Japão (MEXT) (a DK), e por Grants-in-Aid para jsps Fellows (a TM). Os financiadores não tiveram nenhum papel no desenho do estudo, coleta de dados e análise, decisão de publicar ou preparação do manuscrito

CONFLITO DE INTERESSES:.. Os autores declararam que não existem interesses conflitantes

Introdução

a imunoterapia recentemente se tornou mais amplamente aceito como um meio eficaz para tratar pacientes com câncer. O principal jogador na imunoterapia do cancro mediada por célula foi linfócitos T citotóxicos (CTL) dirigidos contra as células tumorais, que reconhecem através do seu receptor de células T (TCR) que um determinado peptídeo derivado de um antigene tumoral (Ag) apresentado por MHC I na células tumorais. Tais células T a partir de tecidos de tumor excisado ou sangue do paciente são expandidos selectivamente in vitro sobre células singeneicas apresentando Ag (APCs) que expressam o Ag de tumor com citocinas como a IL-2 e, em seguida, transferidas de volta para os pacientes [1], [2]. versões relativamente não específico de imunoterapia celular também foram clinicamente testados, incluindo os que utilizam células T e células NK expandidos por meio da estimulação com IL-2 e anticorpos anti-CD3 (ABS), com /sem citocinas adicionais [3], [4] . células dendríticas Recentemente, in vitro expandido (DCs), que são muito eficientes a APC, também têm sido utilizados para estimular CTL Ag-específico de tumores, bem como de CD4

+ células T in vivo [5] – [7]. Estas terapias baseadas na transferência de células adotiva não tenham até agora sido comumente adotada como uma opção para terapia de câncer desde o seu sucesso clínico tem sido limitado, enquanto que requerem um trabalho de laboratório demorado, incluindo cultura de células individuais por várias semanas em uma sala limpa de qualidade controlada .

Por outro lado, a imunoterapia baseada em Ab vem crescendo rapidamente como uma imunoterapia do cancro promissor. Na verdade, mais do que uma dúzia de Abs monoclonais (MoAb) está actualmente aprovado para o tratamento do cancro em seres humanos [8] – [10]. Como uma droga anti-cancro, MoAbs tem enormes vantagens em comparação com quimioterapia, uma vez que alvejar apenas as células que expressam Ags específicos. A natureza bioquímica e características biológicas de cada isotipo de Abs são bem conhecidos, e por isso são os mecanismos através dos quais medeiam a lise de células alvo, isto é, citotoxicidade celular Ab-dependente (ADCC) e citotoxicidade dependente do complemento (CDC) [11], [12]. Como proteínas naturalmente existentes em todos os indivíduos, Abs se espera que tenham menos efeitos colaterais e, como tal, é mais fácil de prever o seu desempenho como uma droga. Em comparação com as imunoterapias mediadas por células descritas acima, a imunoterapia mediada por Ab é mais simples de realizar, se o fornecimento do MoAb é adequada. No entanto, as drogas AcMo também tem desvantagens: são caros e o seu desenvolvimento é ainda difícil, que requer um tempo considerável e custos, a partir da imunização de animais, através do rastreio de hibridomas, a clonagem e recombinação métodos gene para a humanização, o que é necessário para evitar um resposta imunológica pelo receptor [10], [13]. Tumorais Ags que as drogas AcMo alvo são tipicamente proteínas transmembrana, que são muitas vezes difíceis de se preparar como um imunógeno solúvel. Além disso, mesmo com MoAbs humanizados, segmentos residuais derivadas de rato de V-região pode ser antigénico em humanos e induzir ratinho-humano anti-Abs [14]. Devido a esses problemas, as empresas farmacêuticas tendem a limitar alvos Moab para os expressos pelo cancros relativamente comuns.

Tendo em conta os méritos acima mencionadas de drogas Moabe e os méritos de terapias de transferência de células adotivas como sendo principalmente-feitos e custando menos para desenvolver, parece plausível para desenvolver uma terapia para transferir células de plasma derivadas de pacientes que produzem Ab específico do tumor-Ag-, completamente humano. No entanto, não temos conhecimento de qualquer caso em que uma tal terapia tem sido bem sucedida. As células do plasma são células terminalmente diferenciadas e, portanto, não são capazes de crescer em cultura. Em vez disso, as células B, um precursor directo de células do plasma, poderia ser usado para a transferência. No entanto, mesmo as células B tem sido difícil a expandir em número suficiente para a terapia de transferência adoptiva. Além disso, não foi estabelecido se e até que ponto as células B transferidos podem sobreviver e diferenciam-se em células do plasma in vivo.

Normalmente, MoAbs são derivados de hibridomas específicos para células híbridas Ag, entre as células B esplénicas a partir de animais imunizados e repetidamente numa linha de células de plasmacitoma parceiro de fusão. No animal imunizado com um determinado Ag, Ag-células B ligadas são activadas e proliferam para formar centros germinais (GCs) nos baços ou linfonodos. No GC, as células B sofrer troca de isotipo e hipermutação somática dos genes de imunoglobulina para aumentar a afinidade dos seus receptores AG (receptores de células B, BCR). Entre eles, as células B que expressam BCR específica para Ag imunizados são selectivamente expandida e diferenciadas em células B de memória e células de plasma de longa duração (LLPCs) [15], [16]. Após uma imunização de reforço final, as células específicas de Ag-B de memória são activadas proliferam e se tornar plasmablasts, que normalmente formam os hibridomas específicos-Ag. Assim, embora as células específicas de Ag-B de memória pode ser encontrado num número considerável de indivíduos imunizados, as células B específicas do antigénio são geralmente raros em indivíduos não imunizados. Portanto, qualquer terapia de transferência adoptiva de células B exigiria um método para expandir selectivamente as células B específicas do tumor-Ag-raras a partir de células B periféricas extremamente policlonais dos pacientes.

Para desenvolver um sistema para expandir selectivamente tumoral as células B Ag-específicos para terapia de transferência adoptiva, utilizamos o sistema induzida GC B (iGB) cultura de células que, recentemente, relatada [17]. Neste sistema, células de ratinho naïve B são cultivadas sucessivamente com IL-4 e IL-21 em uma linha de células que expressam o CD40L e alimentador de BAFF (40 lb), o que resulta na proliferação extensiva (até 10.000 vezes em 8 dias) de aula ligado as células B com um fenótipo de GC, denominadas células iGB. Após cultura com IL-21 e transferir para ratinhos irradiados, as células iGB diferenciar em células do plasma e tendem a colonizar a medula óssea (BM) e secretar Abs [17]. Ao adaptar este sistema de células B humanas, que seria possível preparar um grande número de células B humanas que produziriam Abs completamente humano, quando transferidos para os pacientes. Em direção ao nosso objetivo de estabelecer de células B mediada por terapia de transferência adoptiva para o câncer, nós avaliamos em um modelo de camundongo quanto e por quanto tempo as células iGB transferidos produzir Ab em ratinhos não irradiados, e se eles inibem o crescimento de células cancerosas que de expressar uma Ag reconhecido pelo mesmo Ab in vivo. Além disso, através da aplicação da técnica de cultura de iGB, temos desenvolvido um sistema para seleccionar células B relativamente raras que se ligam a um Ag ligado à membrana, e mostraram que as células B seleccionadas são eficazes no modelo de transferência adoptiva imunoterapia do cancro.

Resultados

células iGB colonizar a medula óssea e Produzir Ab após a transferência em ratos não-irradiados

Como já relatado anteriormente, a maioria das células iGB após a cultura secundária com IL-21 foram submetidos a mudança de classe e expressar tanto IgG1 ou IgE por dia 8. Muito poucos deles expressam IgM, IgG2b ou IgA, e quase nenhum IgG2c expressa ou IgG3 (Figura 1A). Nós mostramos anteriormente que as células iGB diferenciam-se para células de plasma na medula óssea (BM), quando foram transferidas para ratos irradiados. Aqui, avaliamos a produção de anticorpo a partir das células plasmáticas iGB derivados em ratinhos não-irradiadas. As células iGB foram gerados a partir de ratos Hy10, que carregam uma lisozima de ovo de galinha (HEL) espec�ico de cadeia pesada (VDJ9) e genes em knock-in e configurações de transgênicos cadeia leve (κ5), respectivamente [18]. Entre as células iGB, IgE

– CD138

– células de ligação a HEL (HEL

+) foram FACS purificadas e transferidas para /6 ratos não irradiadas C57BL (B6), que foram sangrados semanalmente para medir a concentração de IgG1 anti-HEL. Como mostrado na Figura 1B, um elevado nível de IgG1 específica-HEL foi detectada nos soros uma semana após a transferência, e então gradualmente diminuído para um nível baixo, mas ainda detectável ( 1 ug /ml) por 10 semanas. Anti-HEL IgG1 foi indetectável nos soros dos ratinhos de controlo que receberam células iGB derivadas de ratinhos B6 WT. Um número significativo de células anti-HEL IgG1 Ab-produtoras (APCs) foram detectados na BM, mas muito poucos no baço, de ratos que receberam as células iGB Hy10 derivados de 4 semanas antes (Figura 1C). Anti-HEL anticorpo da classe IgG2b, mas não de IgG2c ou IgG3 (dados não mostrados), foi também detectável uma semana após a transferência de células com iGB Hy10-derivados, mas não com células WT iGB (Figura 1D). Embora a concentração exacta do anti-HEL IgG2b não pôde ser estimado por causa da falta de um padrão de isotipo-emparelhado anti-HEL Ab, a título de IgG2b foi muito menor do que a de anti-IgG1 de HEL (dados não mostrados). Tomados em conjunto, estes dados indicam que as células in vitro iGB gerados são capazes de se diferenciar em células do plasma que colonizam o BM de ratos não-irradiadas e podem continuar a produzir Ab há pelo menos 4 semanas.

(A ) células esplénicas B a partir de ratinhos C57BL /6 foram cultivadas durante 4 dias com IL-4, em seguida, durante 4 dias com IL-21 em 40 células de LB. A expressão de isotipos de Ig, CD19 e CD138 nas células iGB expandidas foi analisada por citometria de fluxo. Os dados representam as células dentro da porta de linfócitos definido por dispersão lateral e para a frente. Os números indicam as percentagens das células iGB nos quadrantes ou janelas. Os dados apresentados são representativos de três experiências independentes. (B) virgens, células de ligação a HEL ou B total dos baços de Hy10 WT ou ratinhos C57BL /6, respectivamente, foram cultivadas como em (A). Após a cultura, as células foram colhidas e iGB CD138

– IgE

– células iGB (2 × 10

7 células /ratinho) i.v. foram purificados e transferidos em não-irradiadas C57BL /6 ratos. PBS foi também injectado como um controlo. Estes ratinhos foram sangrados aos semanas indicado após a transferência e a concentração de IgG1 anti-HEL soro foi determinada por ELISA. Os dados são expressos como a média ± S.D. de soro individual de murganhos (n = 5 para cada grupo). Os dados são representativos de duas experiências independentes. (C) HEL-ligação ou total de células B foram cultivadas e transferidas para ratinhos não-irradiados como em (B). Quatro semanas após a transferência, os números de AFCs secretoras de IgG1 entre as células de baço ou de medula óssea de ligação HEL foram determinadas por ensaio ELISPOT. A média ± S.D. do AFCs em 10

6 baço ou células BM é indicado por cada barra. São mostrados os dados colectivos de três experiências independentes, cada uma usando 3 ratos receptores por grupo. * P 0,001. N.D. não .: detectado. Os títulos de (D) Anti-IgG2b HEL nas amostras de soro (diluições de 10 vezes) obtidas a 1 semana em (B) foram determinados por ELISA. Cada valor é a média ± S.D. das amostras (n = 5 por cada grupo). Os dados são representativos de duas experiências independentes.

Células iGB Inibição Lung metástase de células de camundongo melanoma in vivo

Estes resultados sugerem uma possível aplicação do sistema de cultura celular iGB para o uso clínico, ou seja, na terapia do cancro mediada por Ab. Testámos esta possibilidade com um modelo de ratinho bem estudado da metástase tumoral utilizando a linha celular de melanoma de ratinho B16. Utilizou-se células B16 com uma forma ancorada à membrana de HEL (mhel) [19] como um substituto do tumor de Ag, e gerado um clone de expressão transfectante com HEL homogénea na superfície da célula, designada B16-mhel (Figura 2A). Testou-se células HEL-iGB específica pode inibir metástases e o crescimento das células B16-mhel in vivo através da produção de anti-HEL Abs. Uma vez que a afinidade de ligação a HEL das células Hy10 baço B é conhecida por ser heterogénea [18], que classificados aqueles HEL de ligação forte de células Hy10 baço B e cultivaram-em 40 células alimentadoras LB durante 3 dias com IL-4 e posteriormente para 3 dias com IL-21 para fazer células iGB. As células do baço de ratinhos B6 B WT Também foram cultivadas em paralelo. IgE

– CD138

– células B ordenadas do Hy10 iGB (Hy10-iGB) ou WT iGB células (WT-iGB), ou apenas PBS como controlo, foram então injectados i.v. em ratinhos B6 não irradiado que receberam B16-mhel 24 h antes (Figura 2B). Os pulmões dos ratinhos receptores foram inspeccionados 3 semanas mais tarde. Os pulmões dos ratinhos que receberam células WT iGB ou apenas PBS, tinha numerosos grupos de células tumorais amplamente disseminadas, a maioria fundindo uns com os outros para formar massas indistinguíveis. Em contraste, apenas alguns pequenos aglomerados de células tumorais foram encontrados em ratinhos que receberam células Hy10 iGB (Figura 2C). Como controlo, os ratinhos inoculados com as células parentais B16 desenvolvido numerosos tumores do pulmão, mesmo quando tratadas com células Hy10 iGB (dados não mostrados).

(A) Expressão de HEL Ag sobre as células de melanoma B16 transfectadas com uma expressão mhel vetor (B16-mhel). células B16-mhel foram coradas com anti-IgG1 de MoAb HEL (linha preta) ou controlo de isotipo MoAb (sombreada), seguido pela APC-conjugado anti-IgG1 de ratinho Ab, e analisadas por citometria de fluxo. O número indica a percentagem de células que expressam mhel. Dados é um representante de dois experimentos independentes. (B) a estratégia Experimental. IgE

– CD138

– células iGB (2 × 10

7 células /ratinho) derivadas de células B do baço de ligação HEL de Hy10 ratos (Hy10-iGB) ou células totais do baço B do WT C57BL /6 IV ratinhos (WT-iGB), ou PBS sozinho, foram transferidos em não-irradiadas C57BL /6 ratos, que haviam sido transferidas i.v. com B16-mhel (C, D, E) ou B16-mhel-GFP células (F, G) (2 × 10

5 células /murganho) 24 horas antes. (C) As fotografias dos pulmões dos ratinhos receptores descritos em (B) 3 semanas após a transferência. Imagens de dois ratos selecionados aleatoriamente a partir de dez por grupo são mostrados. Quando possível, os pulmões do resto dos ratos foram inspeccionadas visualmente no dia da morte. Nos grupos não tratados, houve fusão de metástases individuais em muito grandes massas tumorais, tornando-sentido para contar o número de tumores. taxa (D) Sobrevivência do mesmo conjunto de grupos de rato (n = 10 por grupo) como em (B) foi comparada por meio do teste logrank. * P 0,001. (E) Concentração de soro anti-HEL IgG1 nos mesmos ratinhos utilizados em (D) foi determinada por ELISA nos pontos de tempo indicados. Símbolos abertos e fechados indicam os valores das amostras individuais e as médias de cada grupo, respectivamente. Os dados em (D) e (E) são representativos de quatro experiências semelhantes. (F) A ligação de anti-IgG1 de HEL-B16 mhel células no pulmão de ratinhos portadores de tumor. Os pulmões de ratinhos que tinham recebido as células Hy10 iGB (linha preta) ou PBS (sombreada) e as células B16-mhel-GFP (2 × 10

5 células /rato) como em (B) foram excisados ​​3 semanas após a transferência. As suspensões de células individuais a partir de pulmões foram coradas com anti-IgG1 de ratinho-APC e analisadas por FACSCantoII. histogramas representativos das amostras seleccionadas na GFP

+ células são mostrados. (L) Resumo das experiências mostradas em (F). As barras representam média ± S.D. das médias geométricas (Geom. A média) de APC intensidade da fluorescência da GFP

+ células de ratinhos de cada grupo (n = 3). Os dados são representativos de duas experiências independentes. ** P . 0,05

observação a longo prazo do mesmo conjunto de camundongos revelaram que os ratos transferidos com células Hy10 iGB sobreviveram significativamente mais do que aqueles transferidos com células WT iGB ou única PBS (Figura 2D ). Entre estes ratinhos, soro anti-HEL IgG1 foi detectado na concentração relativamente elevada no início do período de tempo ao longo apenas nos ratinhos transferidas com células Hy10 iGB, embora a concentração Ab diminuiu gradualmente (Figura 2E). Poderíamos mostrar por citometria de fluxo que o anti-HEL IgG1 foi ligada às células B16-mhel retiradas de tumores de pulmão ex vivo 3 semanas após a transferência de células Hy10 iGB (Figura 2F e 2G). Colectivamente, estes dados indicam que Abs específicos de HEL produzido por células de plasma-iGB-celulares derivadas de colonização directamente inibida e /ou crescimento das células B16-mhel no pulmão e sobrevivência prolongada dos ratinhos receptores. mecanismos possíveis para a supressão do tumor Ab-mediada e possíveis causas para a eventual morte dos ratos tratados são discutidos abaixo.

Desenvolvimento de um sistema de cultura para expandir seletivamente as células específicas-Ag iGB

As resultados destes estudos in vivo sugeriram que poderia ser possível utilizar a terapia de tumores de células-iGB mediada em seres humanos. Para este fim, seria necessário seleccionar as células B presumivelmente raros com especificidade para um determinado tumor Ag. Por conseguinte, temos primeiro tentaram desenvolver um sistema modelo para enriquecer e expandir células Ag-B de ratinho específicas presentes em níveis baixos no conjunto de células B policlonais. Concebemos um sistema baseado em Fas /apoptose mediada por FasL, uma vez que essencialmente todas as células expressam Fas iGB [17] e são sensíveis a apoptose mediada por Fas (dados não mostrados). Além disso, as células tornam-se resistentes iGB a apoptose mediada por Fas ao seu IgG1 BCR é ligado com Ag ligado à membrana (dados não mostrados), como previamente relatado para IgM activado

+ B células [20]. Por conseguinte, apenas Ag de ligação a células iGB deve sobreviver sob condições em que está envolvido o Fas (Figura 3A). Para testar esta hipótese, nós preparamos um sistema modelo e gerou duas linhas de células de alimentação novos, 40 células LB expressam de forma estável um substituto Ag mhel (40 LB-mhel) e aqueles que expressam estavelmente mhel e FasL (40 LB-mhel-FasL). Iniciou-se a culturas de células em 40 iGB células alimentadoras LB convencionais com uma mistura de células de baço a partir de B CD45.1

+ ratinhos Hy10 e CD45.2

+ WT ratinhos numa proporção de 1:99. Após a cultura sucessiva com IL-4 e IL-21 em 40 células LB (expansão), as células iGB expandidos foram plaqueadas em 40 células alimentadoras LB-mhel e cultivadas durante 6 horas (AG-estimulação), e em seguida plaqueadas de novo em 40 LB -mHEL-FasL durante 8 horas (de selecção), e, finalmente, em 40 LB durante 5 dias (recuperação), com IL-21 presente ao longo após a fase de expansão. Estas condições específicas foram determinadas depois de muitos testes com várias configurações (Figura 3B). Após a fase de expansão, confirmou-se que a proporção de CD45.1

+ células de ligação a HEL manteve-se em 1% (Figura 3C). A proporção permaneceu o mesmo após a cultura de Ag-estimulação, e fê-lo na cultura de controlo em 40 células alimentadoras LB, bem como, embora a intensidade da coloração HEL tornou-se menor no primeiro provavelmente porque a BCR foi internalizada (Figura 3D, “seleccionado “). Depois das fases de selecção e recuperação subsequentes, no entanto, a proporção de CD45.1

+ células aumentou-se a -80%, em média, ao passo que nenhum enriquecimento foi observada após a cultura de controlo paralelas em 40 células de LB ( “ligação não-HEL -selecionado”). As células seleccionadas iGB principalmente expressa BCR do isotipo IgG1 (dados não mostrados). Usando o protocolo “seleccionada”, em média, 3 × 10

5 células de ligação a HEL B foram recuperados a partir da cultura que começou com 10

4 tais células entre 10

6 células B no total (Figura 3E e 3F). Assim, nós estabelecemos a um protocolo de cultura de selecção que permite o enriquecimento e a expansão de células B específicas de Ag que estão presentes como uma pequena população entre uma grande maioria das células não-B policlonais específicos eficiente. Nós chamamos este sistema de seleção do “sistema Fas-mediada antígeno-específica de seleção de célula iGB (FAIS)”. Nós também conseguiram enriquecer células iGB específicos para o hapteno de acetilo de 4-hidroxi-3-nitrofenilo (NP), inicialmente presentes em ~ 5%, até ~ 80% por essencialmente o mesmo sistema, com as 40 células que expressam FasL LB exibindo proteína NP-conjugado na sua superfície (dados não apresentados).

(a) representação esquemática do princípio de sistema mediada por Fas selecção celular iGB Ag-specific (FAIS). Apenas as células iGB cuja BCR são ligados com Ag apresentados em células alimentadoras tornam-se resistentes à morte por Fas de ligação por FasL nas mesmas células alimentadoras. (B) O protocolo para o sistema FAIS. células B esplénicas de CD45.1

+ ratinhos Hy10 e CD45.2

+ WT ratinhos foram misturados numa razão de 1:99 (1%), e cultivadas numa camada alimentadora 40 LB com IL-4 para 3 dias e, subsequentemente, com IL-21 durante 2 dias. As células iGB resultantes foram passo a passo cultivadas em camadas alimentadoras de 40 LB-mhel por 6 h (Ag-estimulação), 40 LB-mhel-FasL durante 8 h (selecção), e 40 LB por 120 h (de recuperação) na protocolo “selecionado”. No protocolo de “não seleccionada”, o número apropriado de células iGB foi novamente plaqueados sobre uma camada alimentadora de células de 40 de LB com o mesmo intervalo de tempo que o protocolo “seleccionado”. Em cada tempo de replating, células iGB foram isolados a partir do alimentador, IgE

+ e CD138

+ células em ambos os protocolos. (C-E) perfis de citometria de fluxo Representante (HEL vinculativos vs. CD45.1; delimitação de CD19

+ células) das células iGB mistos antes da fase Ag-estimulação (0 h; C), após a Ag fase de estimulação (6 h; D), e depois a fase de recuperação (134 h; e). Em cada ponto de tempo, as células iGB purificadas foram coradas com HEL biotinilado e estreptavidina-APC, anti-CD19 e anti-Abs CD45.1 e analisadas por citometria de fluxo. Os perfis de células iGB cultivadas por “selecionado” (à esquerda) ou “não-selecionado” (à direita) protocolo são mostrados. Os números em cada janela representa a percentagem de células Hy10 iGB (CD45.1

+, de ligação a HEL) entre total de CD19

+ células iGB. Os dados são representativos de três experiências independentes. (F) O número absoluto (esquerda) e percentagem (direita) das células Hy10 iGB recuperação após a cultura quer com a não-seleccionados ou protocolo seleccionado, tal como determinado pela análise mostrado em (E) estão apresentados como médias ± S.D. de três experiências independentes. * P 0,05. ** P . 0,01

Em seguida, examinou se menos células B Ag específicos-em uma associação não-específico poderia ser enriquecido, antecipando a possibilidade de utilizar este sistema para a aplicação clínica. Desta vez, nós começamos as culturas com CD45.1

+ Hy10 células do baço B misturado com uma frequência de 0,1 ou 0,01% em 1 × 10

6 WT células B do baço B6 (CD45.2

+) , uma frequência que foi confirmado pouco antes da cultura Ag-estimulação de células IGB (Figura 4A). Cada mistura de células-B foi cultivada de acordo com o sistema de FAIS ( “seleccionada”) ou apenas em 40 LB células como um controlo ( “não seleccionada”). Após a cultura de recuperação, as células iGB de ligação HEL foram enriquecidas para ~ 40% e ~ 10% quando eles estavam inicialmente presentes em 0,1% e 0,01%, respectivamente (Figura 4B e 4C). Estes dados sugerem que muito raras células B específicas do Ag, tão poucos como 1 em 10

4, pode ser enriquecido e expandido, repetindo o protocolo de cultura FAIS.

(A e B) células esplénicas B a partir de camundongos CD45.1

+ Hy10 foram misturados com uma frequência de 0,1% ou 0,01% com 1 × 10

6 CD45.2

+ WT células B do baço. As células misturadas (1 × 10

6) foram cultivados como descrito na Figura 3B. São mostrados os perfis de citometria de fluxo (HEL de ligação vs. CD45.1; delimitação de CD19

+ células) das células mistas antes da fase Ag-estimulação (0 h; a) e após a fase de recuperação (134 h; B ) em uma experiência representativa. O número indicado em cada janela indica a percentagem de células Hy10 iGB (CD45.1

+, de ligação a HEL) entre total de CD19

+ células iGB. (C) A percentagem de células Hy10 iGB após cultura de recuperação em qualquer não-seleccionados ou seleccionado protocolo iniciado a partir da razão de mistura de 0,1% (painel da esquerda, n = 3) ou 0,01% (painel da direita, n = 2), conforme determinado pela análise mostrado em (B), estão indicados como média ± SD experimentos de independentes. * P 0,01. ** P . 0,05

In-vitro Selecionado específico do Ag Cells iGB suprimir o crescimento do tumor in vivo

Finalmente, testamos se as células iGB in-vitro seleccionados são um eficaz terapia anti-tumoral no modelo de metástases de melanoma em ratinhos. CD45.1

+ células B de ligação HEL de ratinhos Hy10 foram misturados com CD45.2

+ células B policlonais a partir de ratinhos B6 WT a uma razão de 1:99 e foram cultivadas no sistema FAIS ou em 40 LB células como um controle não seleccionado, tal como descrito na Figura 3 (Figura 5A). Após a cultura de recuperação, a frequência das células de ligação ao iGB HEL atingiu 85%, um enriquecimento mais do que 400 vezes, após a cultura em comparação com FAIS na cultura de controlo (Figura 5B). Nós transferimos essas células iGB (2 × 10

7) seja selecionado ou não selecionado, ou somente PBS, em ratinhos B6 não irradiadas que haviam sido transferidos com 2 × 10

5 células B16-mhel. Três semanas mais tarde, as células B16-mhel foram disseminados por todo o pulmão e formou inúmeros aglomerados de vários tamanhos nos ratos que receberam células iGB não-selecionados ou PBS. Por outro lado, apenas um pequeno número de tumores, principalmente de pequena dimensão, foram observadas nos pulmões de ratinhos que tinham recebido as células seleccionadas iGB (Figura 5C). Estes dados indicam que as células iGB seleccionados in vitro com base na sua especificidade de ligação Ag ainda são capazes de se diferenciar em células do plasma in vivo e inibir o crescimento de células tumorais que expressam o mesmo Ag.

Estratégia experimental

(A). Uma mistura de 1:99 de células B do baço de CD45.1

+ ratinhos Hy10 e CD45.2

+ WT ratinhos foi sujeito ao sistema FAIS como descrito na Figura 3B. As células seleccionadas iGB ou não seleccionados após a fase de recuperação, ou de apenas PBS, foram injectados em não-irradiadas C57BL /6 ratos que tinham sido transferidos i.v. com células B16-mhel, como descrito na Figura 2B. (B) Os perfis de citometria de fluxo Representante (vs. CD45.1 de ligação HEL) de células iGB após a fase de recuperação do “selecionada” e protocolos “não selecionado”. Os números em cada janela mostra a percentagem de células Hy10 iGB (CD45.1

+, de ligação a HEL; delimitação de CD19

+ células) entre total de CD19

+ células iGB. (C) As fotografias dos pulmões dos ratinhos tratados como em (a) 3 semanas após a transferência. Imagens representativas de dois ratos em cada três são mostrados.

Discussão

Com base nos resultados usando o nosso modelo de rato, aqui propomos um novo sistema de imunoterapia do cancro transferência adotiva utilizando células B. Com este sistema, pode-se expandir células B virgens para produzir um grande número de células de GC do tipo B (iGB) e a partir deles, as células B específicas do Ag raras pode ser seleccionada e expandida pelo sistema FAIS para utilização em terapia de transferência adoptiva . Demonstramos que as células transferidas iGB colonizado a medula óssea e produziu anticorpo, principalmente da classe IgG1, durante várias semanas. Usando este sistema, que mostrou um exemplo de um tratamento eficaz do cancro. A transferência de células iGB específicos para um tumor substituto Ag (HEL) suprimiu o crescimento e metástases nos pulmões de células de melanoma que expressa o mesmo Ag e prolongou a sobrevivência dos ratinhos receptores. Se este sistema pode ser adaptado para trabalhar com células B humanas, a transferência adoptiva de células B deverão ser uma alternativa muito atraente para os MoAb em imunoterapia do cancro: requer um período de tempo mais curto a partir da identificação de um tumor de Ag para iniciar o tratamento de pacientes do que a produção de um MoAb humanizado, portanto, servirá como uma terapia feita sob medida que poderia ter como alvo as doenças de baixa incidência. Além disso, as células derivadas de humanos iGB deve produzir AB humano completo no receptor.

No presente estudo, que continua a ser formalmente demonstrada como a transferência de células iGB resultou na supressão do crescimento de melanoma nos pulmões . Considerando-se o título do soro elevado de IgG1 específica-HEL sustentada pelo menos 4 semanas após a transferência (Figuras 1B e 2E) e a ligação de tais IgG1 para as células de melanoma que expressam HEL ex vivo (Figura 2F e 2G), a supressão do tumor é susceptível de ser mediada pela IgG1 anti-HEL produzida pelas células plasmáticas de células-derivadas iGB. Assim, os mecanismos responsáveis ​​pela supressão do tumor podem ser de ADCC e /ou CDC, os mesmos mecanismos atribuídas a drogas AcMo in vivo [9], [10]. A este respeito, estudos anteriores comparando diferentes isotipos de MoAbs rato pelos seus efeitos anti-tumorais in vivo, bem como in vitro demonstraram que a IgG1 mostrou efeitos moderados in vivo e in ADCC, mas não em CDC, enquanto IgG2a era o mais eficaz na maioria casos, com IgG2b e IgG3 sendo variável entre os relatórios usando diferentes conjuntos de MoAbs e células-alvo [21] – [24]. Assim, a propensão das células B derivadas de rato nosso sistema de cultura celular para alternar iGB quase exclusivamente, quer de IgG1 ou IgE isotipos podem ter limitado a eficácia da terapia no nosso modelo de ratinho; todos os ratos, mesmo aqueles tratados com as células iGB específicas-Ag, acabou por morrer. Deve notar-se que tais ratinhos morreram com enormes aglomerados de tumores de melanoma na cavidade peritoneal, mas apenas alguns pequenos tumores foram encontrados nos pulmões mesmo a morte (dados não mostrados), indicando que a actividade anti-tumoral de isotipos Ab pode diferir, dependendo dos tecidos a ser infiltrado.