Abstract

Fundo

A associação do vírus relacionados com o vírus da leucemia murina xenotr�ico (XMRV) com câncer de próstata continua a receber maior atenção, como estudos relatam prevalências XMRV discrepantes variando de zero até 23%. Não está claro se as diferenças na testes de diagnóstico, gravidade da doença, geografia ou outros fatores são responsáveis ​​pelos resultados discordantes. Relatamos aqui a prevalência de XMRV em uma população com câncer de próstata bem definidos e RNase L polimorfismo. Utilizou-se ensaios de PCR e Western blot (WB) amplamente reactivos para detectar a infecção por XMRV e vírus relacionados leucemia murina (MLV).

Metodologia /Principais Achados

Nós estudadas amostras de 162 pacientes norte-americanos diagnosticados com câncer de próstata com um intermediário ao estágio avançado (Gleason Dezenas de 5-10; moderada (46%) tumores pouco diferenciados (54%)). ADN de tecido da próstata foi testada por ensaios de PCR que detectam variantes XMRV e MLV. Para excluir a contaminação com DNA do rato, também projetado e utilizado um teste de DNA PCR específico do mouse. análise filogenética detalhada foi usado para inferir relações evolutivas. RNase L digitação mostrou que 9,3% eram homozigotos (QQ) para o L mutação R462Q RNase, enquanto 45,6% e 45,1% eram homozigotos ou heterozigotos, respectivamente. O teste sorológico foi realizado por um teste WB. Três dos 162 (1,9%) DNA tecido da próstata foram PCR positivos para XMRV e tinha DNA indetectável mouse. Nada foi homozigotos para a mutação QQ. O plasma de todas as três pessoas era negativa para o ARN viral por RT-PCR. Todos os 162 pacientes foram WB negativo. A análise filogenética inferida a XMRV distinta.

Conclusões e seu significado

Nós encontramos uma prevalência muito baixa de XMRV em pacientes com câncer de próstata. A infecção foi confirmada por análise filogenética e ausência de contaminação de ADN do rato. A descoberta de anticorpos indetectáveis ​​e viremia em todos os três pacientes pode refletir infecção latente. Nossos resultados não suportam uma associação de XMRV ou MLV variantes com câncer de próstata

Citation:. Switzer WM, Jia H, Zheng H, Tang S, Heneine W (2011) No Association of Xenotropic da leucemia murina Virus-Related vírus com câncer de próstata. PLoS ONE 6 (5): e19065. doi: 10.1371 /journal.pone.0019065

Autor: Paul Dent, Virginia Commonwealth University, Estados Unidos da América

Recebido: 03 de fevereiro de 2011; Aceito: 15 de março de 2011; Publicado em: 04 de maio de 2011

Este é um artigo de acesso aberto, livre de todos os direitos autorais e pode ser livremente reproduzido, distribuído, transmitido, modificado, construído em cima, ou de outra maneira usado por qualquer pessoa para qualquer finalidade lícita. O trabalho é feito disponível sob a dedicação de domínio público da Creative Commons CC0

Financiamento:. O financiamento para o estudo foi fornecido pelos Centros de Controle e Prevenção por dotações anuais do Governo dos Estados Unidos de Doenças. Os financiadores não tiveram nenhum papel no desenho do estudo, coleta de dados e análise, decisão de publicar ou preparação do manuscrito

CONFLITO DE INTERESSES:.. Os autores declararam que não existem interesses conflitantes

Introdução

o câncer de próstata é um dos mais frequentes crescimento, lento, malignidades não-cutâneos de homens no mundo em desenvolvimento [1]. Por exemplo, estima-se que mais de 192.000 homens em os EUA, a maioria de ascendência Africano-Americano, serão diagnosticados com câncer de próstata este ano [2], [3]. Embora a história natural do cancro da próstata é actualmente desconhecida, múltiplas etiologias têm sido propostos, incluindo os defeitos genéticos [4], [5], [6]. Em 2006, utilizando microarrays de RT-PCR e análise xenotr�ico vírus da leucemia murina (MLV) relacionados com vírus (XMRV) foi identificado pela primeira vez em cerca de 40% dos doentes com cancro da próstata familiares contendo a mutação R462Q no gene de RNase L, um componente do antiviral imunidade inata [7]. As MLV são gammaretroviruses endógenos que se integraram no genoma do rato e podem causar cancro, doenças neurológicas, e desordens de imunodeficiência em ratinhos e são classificados em três grupos com base no seu tropismo hospedeiro [8]. Xenotropic MLV (XMLV) replicar apenas em células não-rato. Em contraste, ecotr�ica MLV (EMLV) replicar somente em camundongos, enquanto polytropic MLV (PMLV) têm um tropismo mais amplo e pode replicar em rato e não-rato anfitriões [8]. ações XMRV cerca de 93% e% de identidade 89 nucleotídeos com XMLV e PMLV em todo o genoma [7]. Identificação de uma possível causa viral de cancro da próstata é altamente significativo porque poderia facilitar o tratamento e prevenção desta doença debilitante.

tem sido relatada a evidência adicional para a infecção por XMRV de pessoas com cancro da próstata num estudo EU que mostra um maior prevalência de detecção de ADN XMRV por PCR (6%) e proteínas virais por imuno-histoquimica (IHC) (23%) em tecidos prostáticos de doentes com cancro 334 da próstata, em comparação com 101 controla benignos (1,9% por PCR e 3,9% por IHC) [9] . Este estudo também relataram a descoberta de XMRV mais frequentemente em doentes com um grau do tumor de próstata mais elevado sugerindo uma ligação causal entre o vírus ea doença. Uma tendência semelhante foi relatado em outro estudo que relatou uma taxa de prevalência XMRV 22% em pacientes com câncer de próstata do Texas, mas encontrou o vírus em ambos os tecidos tumorais e não tumorais [9], [10]. XMRV anticorpos neutralizantes foram identificados recentemente em 11 de 40 (27,5%) pacientes com câncer de próstata US e sequências XMRV foram confirmados em cinco dessas 11 pessoas usando DNA PCR e fluorescência aninhada hibridização in situ (FISH) [11].

em contraste, estudos realizados na Europa e dois de os EUA relataram infecção pouca ou nenhuma XMRV [12], [13], [14], [15], [16]. Um estudo de pacientes com câncer de próstata alemães e um na Holanda encontrou uma prevalência XMRV muito inferior (1/87, 1,2% e 3/74 = 4%, respectivamente) usando apenas RT-PCR e primers específicos de XMRV [12]. Um segundo estudo de maior na Alemanha, utilizando uma combinação de ADN e ARN por PCR encontrada qualquer evidência de infecção por XMRV em 589 pacientes [14]. Além disso, os soros a partir de um 146 pacientes adicionais de cancro da próstata foram todos negativos, testando com um ELISA incorporando envelope recombinante XMRV (Env) e as proteínas Gag e por imunofluorescência indireta expressando XMRV [14]. XMRV também não foi encontrado no DNA a partir de tecidos de 161 e 200 pacientes com câncer de próstata de duas populações dos EUA, respectivamente [13], [15]. O estudo de Aloia

et al.

Também não detectar proteínas XMRV em tecidos de 596 adenocarcinomas prostáticos e 452 amostras de tecido benigno da próstata utilizando IHC [13].

As razões para os resultados XMRV incongruentes não são conhecidos, mas pode estar relacionada a diferenças técnicas em testes XMRV ou a factores relacionados com as populações de pacientes, incluindo estágio da doença, fatores genéticos, ou concentração geográfica. resultados discordantes semelhantes também foram relatados recentemente para XMRV em pessoas com a síndrome da fadiga crônica (SFC) [17], [18], [19], [20], [21], [22], [23], incluindo um estudo realizado por Lo

et. al

relatórios sequências PMLV semelhantes entre os pacientes norte-americanos com CFS [24]. A maioria dos estudos do cancro da próstata utilizados por PCR com primers específicos de XMRV que não pode ser altamente sensível para outras variantes de MLV como [7], [9], [10], [11], [12], [15], [16]. Além disso, a maioria dos estudos não realizaram o teste sorológico para detecção de anticorpos que são características de infecções retrovirais e pode, assim, fornecem evidências adicionais de infecção que não é específico do tecido.

Nós relatamos aqui o teste XMRV de um bem coorte caracterizado de 162 pacientes com câncer de próstata de os EUA, usando uma combinação de sorológicos e de PCR ensaios capazes de detectar o XMRV e PMLV. Nós também medida a distribuição da RNase L QQ mutação para avaliar a associação de XMRV com este alelo mutante [7]. Temos também utilizado um teste de PCR sensível para detectar a contaminação com DNA murino e excluir resultados falsos positivos de PCR. Nossos resultados mostram que XMRV é raro nesta população de doentes e não suportam uma associação deste vírus com câncer de próstata.

Resultados

sequências XMRV Raras em tecidos tumorais de pacientes com câncer de próstata

sequências

ß-actina foram detectadas por PCR nos extratos de DNA de todos os tecidos da próstata, confirmando a sua integridade para o teste PCR. ADN a partir de apenas dois (5956 e 6203) de 162 pacientes (1,23%) testaram positivo para sequências XMRV no rastreio inicial (Fig. 1, Tabela 1). Dos 77 espécimes de DNA que foram adicionalmente testados em triplicado pela

pol

ensaio de PCR, apenas um paciente (5935) (1,3%) foi encontrado positivo. Esta amostra foi positiva em apenas uma de três réplicas. Assim, a prevalência global PCR foi 3/162 ou 1,85%. Paciente 5956 foi positivo para o

gag Comprar e

pol

sequências em 3/5 e 4/6 ensaios repetidos, respectivamente, e

env

sequências também foram detectados em 1/3 ensaios repetidos (Tabela 2). Espécime 5956 também foi positivo em todos os três repetições

testes pol

PCR. Apenas XMRV

pol

e

sequências env

foram detectados em DNA tecido do paciente 6203 próstata em 1/4 e 1/1 ensaios repetidos, respectivamente. Testes adicionais de DNA extraído de outra seção tecido da próstata de 6203 foi repetidamente negativo, o que provavelmente reflete uma distribuição desigual de baixo XMRV cópia neste tecido. DNA de todos os três pacientes repetidamente testados negativo para mtDNA murino demonstrando a ausência de contaminação dos DNAs do mouse. Para testar para a virémia foram analisados ​​extractos de ARN a partir de amostras de plasma a partir de todos os três pacientes. Todas as amostras tinham sequências indetectáveis ​​pelos testes qRT-PCR e NRT-PCR.

Representante aninhada

pol

resultados da PCR usando DNA do tumor da próstata. Lanes 1-24, pacientes com câncer de próstata, incluindo pacientes 5956 (pista 8) e 6203 (pista 19); pista 25, controle de ADN PBMC humano negativo; pistas 26 e 27, a água só controla para testes de PCR primárias e aninhadas, respectivamente; pistas 28 e 29, controles de sensibilidade do ensaio consistindo de 10 e 10

3 cópias de DNA plasmídeo XMRV VP62 diluídos em um fundo de 1 ug de DNA PBMC humana, respectivamente.

Identificação da diversidade XMRV em pacientes com câncer de próstata

a análise da sequência

mostrou que os pacientes 5935, 5956 e 6203 estão infectados com cepas variante XMRV. O 168-pb

pol

sequências de todos os três pacientes mostraram 90,5-100% de identidade de nucleótidos uma à outra, 94-100% de XMRV, 91,7-98,8% para XMLV, 94-100% de PMLV, e 91 -100% a ecotr�ica MLV (EMLV) neste curto região. 164-pb

sequências env

de pessoas 5956 e 6203 foram idênticos uns aos outros e partilhada a identidade mais elevada de nucleótidos (94,9-100%) para XMRV e outras estirpes MLV xenotr�icos, respectivamente, [25]. O

sequências env

de ambas as pessoas eram muito divergentes de EMLVs compartilhando apenas cerca de 46% de identidade de nucleotídeos. 413-bp

gag

sequências só foram amplificados a partir do DNA do tecido da próstata de pessoa 5956 e tinha cerca de 98% de identidade de nucleotídeos para XMRV, mas era idêntico a um Merv xenotr�ico encontrados no tapete do cromossoma 8 (GenBank # AC127575).

a análise filogenética de o

sequências env

inferida três grupos distintos, com o apoio de bootstrap forte baseado em tropismo viral como esperado, uma vez que esta região inclui uma porção de superfície da membrana viral implicada no tropismo celular (Fig . 2a). O

env

sequências de ambos os pacientes em cluster com sequências de XMLV mas eram distintos XMRV relatado anteriormente e PMLV protótipo (Fig. 2a). Em contraste, as relações filogenéticas inferidas de

pol

sequências de todos os grupos MLV mostrou que esta região não cluster gama de hospedeiros (Fig. 2b). Os três

pol

sequências a partir de pacientes com cancro da próstata formada uma linhagem bem suportado contendo um neuropatogénico Moloney MLV recombinante (estirpe ts-1-92b, GenBank # AF462057) (Fig. 2b). XMRV

pol

sequências de pacientes com câncer de próstata previamente relatados (codificados com VP), exceto dois (VP29 e VP184, gentilmente cedido por Joe DeRisi), agrupados com os de pessoas com SFC (codificadas com WPI) com inicialização significativa apoio. VP29 e VP184

POL

sequências eram idênticos uns aos outros, mas a partir de 1,2% divergente outro XMRV e formado um aglomerado fracamente suportada, contendo uma mistura de EMLV e PMLV (Fig. 2b). Estes resultados demonstram uma maior diversidade de XMRV nesta região do que observado anteriormente, mas são consistentes com a recombinação com Moloney MLV como relatado recentemente [7], [25]. VP29, VP79, VP86, VP88, VP90, e VP184 são pacientes com câncer de próstata presentes na Urismann

et al.

Papel, mas para o qual o XMRV

pol

sequências ainda não estão disponíveis no GenBank [ ,,,0],7]. Recentemente relatou

gag Comprar e

pol

sequências de DNA encontradas em linha de células de tumor humano foram localizados fora das regiões usados ​​em nosso estudo e, portanto, não foram incluídos nas análises [25].

A. envelope (

env

), B. polimerase (

pol

) e C.

gag

. Estabilidade da topologia da árvore foi testada usando 1000 inicialização replica em ambos os métodos de máxima verossimilhança (ML) vizinho juntar (NJ) e. valores de bootstrap 60 são exibidos nos mais importantes nós (NJ /ML). Novas seqüências do estudo atual são encaixotados. números de acesso para as sequências de MLV protótipos disponíveis no GenBank são XMRV VP35 = DQ241301, XMRV VP62 = DQ399707, XMRV VP42 = DQ241302, XMRV WPI-1106 = GQ497344, XMRV WPI-1178 = GC497343, XMRV PCA1-PCA17 = GU812341-GU812357, MLV DG -75 = AF221065, MLV MTCR = NC_001702, MLV AKV ​​= J01998, MLV BM5eco = AY252102.1, Moloney MLV = J02255, Moloney neuropthogenic MLV variante ts1-92b = AF462057, Rauscher MLV = NC_001819, amigo MLV = X02794, Merv Chr 7 = AC167978, Merv Chr 7 = AC127565, Merv Chr 8 = AC127575, Merv Chr 12 = AC153658, Merv Chr 9 = AC121813, Merv Chr 4 = AL627077, Merv Chr 1 = AC083892), XMLV A2780 = FR670594, XMLV BHY = FR670595, XMLV Daudi = FR670596, XMLV EKVX = FR670597, XMLV IMR-5 = FR670598, XMLV MUTZ-1 = FR670599, XMLV S-117 = FR670600, XMLV TYK-nu = FR670601. Sequências denotado RAW são do polytropic MLV isolado em células HeLa usados ​​para desenvolver o teste WB in-house. Sequências codificadas como VP XMRV e PCA e WPI são de câncer de próstata e pacientes com SFC, respectivamente. cancro da próstata adicional do paciente VP

gag Comprar e

pol

sequências foram gentilmente cedidas pelos Drs. Robert Silverman e Joe Derisi. tropismo viral, conforme determinado pela análise do

sequências env

, é indicado por azul (xenotr�ico), roxo (polytropic) e amarelos (ecotr�icos) esferas.

O

sequência

gag de paciente 5956 agrupado com sequências de XMRV de um paciente com câncer de próstata (VP88), um Merv xenotr�ico encontrados no tapete do cromossoma 8, e uma sequência PMLV identificado em um doador de sangue (BD-28) por Lo

et al.

(Fig. 2c) [24]. Esta linhagem foi entre clados contendo XMRV de câncer de próstata e de pacientes com SFC e a maioria dos PMLVs e os MLVs restantes encontradas no Lo

et al.

Estudar [24]. Um PMLV protótipo (MCF1233) agrupado com todos EMLVs e dois XMRVs, sugerindo que é um recombinante nesta região (Fig. 2c).

Estes resultados filogenéticos sugerem também a curto região de

env

alvo de nosso ensaio PCR nova é útil para determinar o tropismo viral para a digitação das sequências de parentes do MLV. Esta informação pode ser útil para compreender a origem das sequências identificadas em humanos PCR-positivas. Em contraste, o

gag e

pol

regiões apresentaram menor agrupamento por tropismo indicando recombinação viral nessas regiões. Por exemplo, o

gag

sequências de XMLVs prototípicas (MTCR), EMLVs (AKV, BM5eco), e PMLVs (MCF1233) aglomeraram-se junto com o apoio muito significativo de bootstrap (Fig. 2a).

topologias de árvores filogenéticas quase idênticos para cada região do gene foram obtidos com ambos os métodos de NJ e ML. As sequências XMRV de ambos os pacientes de cancro da próstata também eram distintos das sequências PMLV amplificados a partir da linha de células de murino (RAW) utilizado para a preparação de antigénios WB demonstram ainda que estes não são contaminantes de laboratório (Fig. 2). Estes resultados confirmam a presença de XMRV em ambos os pacientes e demonstrar que a diversidade XMRV é maior do que o actualmente apreciada.

As sequências XMRV apresentadas no documento atual estão disponíveis no GenBank com os números de adesão HM003608-HM003612 e HQ116790. Sequências de outros estudos com pacientes com câncer de próstata XMRV-positivos não estavam disponíveis no GenBank para inclusão em nossas análises [9], [11], [12], [16].

A ausência de anticorpos no plasma de próstata pacientes com câncer

Todo o câncer de próstata 162 amostras de plasma do paciente foram considerados negativos para anticorpos para XMRV /MLV no teste WB, incluindo plasma de pessoas 5935, 5956 e 6203 (Fig. 3). Na maior parte dos espécimes de plasma foi observado algum nível de reactividade não específica para o antigénio não infectado, mas sem evidência de reactividade específica para gag e /ou proteínas Env do antigénio infectado blot (Fig. 3).

marcadores de peso molecular (kD ) são proporcionados no lado esquerdo da EAP nos painéis superiores. tamanhos esperados de Gag viral (p30, capsídeo (CA)), pr65 e envelope (env, gp69 /71) proteínas são fornecidos em cada WB nos painéis superiores. resultados WB representativos dos onze pacientes com câncer de próstata, incluindo pacientes 5956 e 6203 (indicado por asteriscos). Determinação de MLV reactividade específica é determinada por comparação da reactividade sérica de antigénios HeLa xenotr�ico MLV-infectados e não infectados HeLa antigénios nos painéis superior e inferior, respectivamente. Ra, Rauscher MLV vírus inteiro policlonal de cabra anti-soro; Fr, amigo MLV Envelope (gp69 /71) policlonal de cabra anti-soro; pré-imune, soro de cabra antes da imunização.

RNase L R462Q distribuição alélica na população estudada e características clínicas das três pessoas infectadas pelo XMRV

15 das 162 pessoas ( 9,3%) foram determinados como sendo homozigótica (QQ) para o L mutação R462Q ARNase, 74 (45,6%) tinham o alelo homozigoto RR, e 73 (45,1%) eram heterozigóticos (RQ) para a mutação (Tabela 1).

paciente 5935 é o heterozigoto RQ RNase L genótipo. Ele tem um adenocarcinoma pouco diferenciado com a pontuação de um Gleason de 6, T2C estágio patológico, o nível de PSA de 4,6 ng /mL. Paciente 5956 é o de tipo selvagem homozigótico RR RNase L genótipo. Ele tinha um adenocarcinoma pouco diferenciado com a pontuação de um Gleason de 7, T3A estágio patológico, a /o nível de PSA 12,4 ng mL. Paciente 6203 é o heterozigoto RQ RNase L genótipo, e teve um adenocarcinoma moderadamente diferenciado com a pontuação de um Gleason de 6, T2C estágio patológico, e um nível de PSA de 7,1 ng /mL. Assim, não fomos capazes de confirmar uma associação da infecção por XMRV com o QQ RNase L alelo homozigoto. Dada a baixa prevalência de XMRV, nós não temos o poder estatístico para determinar se existe uma associação de XMRV com o grau do tumor.

Discussão

Usamos PCR e teste sorológico para estudar a prevalência de XMRV em 162 pacientes norte-americanos bem caracterizadas com câncer de próstata. Foram pesquisados ​​os cancros com intermediária para estágios avançados, e utilizados vários ensaios de PCR, incluindo testes com primers conservadas para permitir a detecção de XMRV diversificada e sequências de parentes do MLV. Quase metade das amostras também foram testadas em triplicado para maximizar a sensibilidade de detecção de sequências de baixo número de cópias. Utilizou-se um ensaio de WB amplamente reactiva para testar todos os pacientes para anticorpos. Os nossos resultados documentam uma prevalência muito baixa (1,9%) de sequências de ADN XMRV no tecido da próstata e ausência de positividade do anticorpo em todas as amostras. Combinado estes dados não suportam uma associação de XMRV ou relacionados com MLV com câncer de próstata.

Os resultados da PCR predominantemente negativos foram observados apesar do uso de 1 ug de DNA que é 4-10 × maior do que o DNA de entrada usado em estudos anteriores que relataram XMRV detecção [7], [9], [14], [16]. Da mesma forma, a baixa prevalência observada de XMRV não pode ser explicado por uma diminuição da sensibilidade do ensaio de PCR, uma vez que as amostras rastreadas com o mesmo ensaio utilizado originalmente por Urisman

et ai.

[7]. Nos três espécimes com sequências detectáveis, observamos que o número de cópias foi muito baixa, como PCR aninhado e replicar o teste foi muitas vezes necessários para a detecção. Importante, em todas as três amostras não fomos capazes de detectar rato mtDNA apesar do uso de um ensaio altamente sensível, o que sugere que a fonte de XMRV é improvável que o resultado da contaminação com ADN de rato. Estes resultados são importantes uma vez que a contaminação do DNA do rato foi relatado para ser a fonte de XMRV em um estudo recente de tecidos de câncer de próstata [26]. Os autores deste estudo utilizou uma técnica de PCR para o mouse intracisternal Uma partícula (IAP), que relataram ser mais sensível do que um ensaio à base de mtDNA D-circuito específico do rato [26]. Embora as amostras de DNA não estavam disponíveis para testes no ensaio de IAP, verificou-se que o ensaio de PAI é igualmente sensível ao nosso ensaio de mtDNA em tempo real COX2 (dados não mostrados), excluindo-se assim ainda mais a contaminação de ADN de rato como uma fonte para a PCR positiva resultados. Além disso, as amostras de ADN foram preparadas a CQMC em que apenas amostras biológicas humanas, e não linhas celulares, são tratados, reduzindo ainda mais a possibilidade de contaminação murino.

A análise da sequência das amostras de PCR-positivas foi altamente informativo porque confirmou que os três espécimes foram XMRV-relacionado. Além disso, a descoberta de uma estirpe viral em pacientes com cancro da próstata que três é distinto do XMRV observado em estudos anteriores é significativa e demonstra uma diversidade viral mais amplo [7], [9], [14], [16]. Este seria um resultado esperado de acordo com a evolução do vírus durante a disseminação e persistência. A ausência de anticorpos e viremia do plasma nestes três pacientes é notável porque pode reflectir infecções latentes ou sequestradas. Perda de anticorpo durante uma infecção latente, enquanto atípica da maior parte das infecções retrovirais, tem sido descrita anteriormente para a infecção natural de macacos com simian retrovírus do tipo D (SRV) [27]. SRV em macacos está associada a surtos de deficiência imunológica grave em colônias de primatas e infecção latente SRV nestes animais negativas para anticorpos é confirmada com maior sensibilidade por meio de análise de PCR [27]. Os nossos resultados são também consistentes com as observadas recentemente em macacos infectados experimentalmente com XMRV em que os tecidos no momento da necropsia são PCR-positivas mas viremia e detecção de provírus em PBMCs desaparecem rapidamente, seguido de perda de detecção de anticorpos [28], [29]. Embora um estudo relatou a detecção de anticorpo XMRV neutralizante em 11 pacientes com cancro da próstata, estes dados não foram confirmados por métodos mais sensíveis, como o WB, ou por teste de PCR em todos os casos, e, assim, podem representar a reactividade não específica [11], [17 ]. Estudos longitudinais podem definir melhor as respostas do hospedeiro à infecção XMRV.

A nossa população de estudo continha 15 pessoas com o QQ RNase L alelo mutante. No entanto, nenhum foi XMRV-positivo, o que contrasta com os achados originais de Urismann

et al.

[7]. As pessoas infectadas com o XMRV em nosso estudo teve tanto o tipo selvagem homozigoto (RR) ou heterozigotos alelos (RQ) RNase L R462Q. Os nossos resultados são consistentes com outros estudos norte-americanos e europeus que também identificados frequências mais altas do QQ alelo mutante homozigoto em pessoas XMRV-negativos [9], [10], [16]. Combinados, estes resultados sugerem que a infecção por XMRV não está associada com esta forma alélica da RNase L.

Embora nossos dados não suportam uma associação de câncer de próstata com XMRV, é importante para entender se XMRV tem qualquer papel causal no cancro da próstata quando é raramente detectada. Em geral, como gammaretroviruses XMRV induzir a transformação maligna por mutagénese de inserção, de modo que as células malignas em um tumor são clonalmente infectado. Este mecanismo da carcinogénese foi encontrado nos animais, bem como em crianças expostas a vectores MLV-derivados em ensaios de terapia génica [30], [31]. Portanto, a baixa frequência de células infectadas pelo XMRV encontrados em todos os três pacientes são inconsistentes com um papel direto de XMRV na carcinogênese de próstata nesses pacientes. Anteriormente, uma linha celular de cancro da próstata humano, 22Rv1, tem sido demonstrado que expressam altos níveis de XMRV, uma descoberta que suporta um papel na tumorigénese do XMRV cancro da próstata [32]. Contudo, relatou-se recentemente que o XMRV expressa por 22Rv1 não pode ser de origem humana, mas muito provavelmente surgiram através de recombinação dos dois genomas sobrepondo-XMRV como durante a passagem do tumor da próstata em ratinhos consanguíneos (T. Paprotka

et ai .

18

th Conferência sobre Retrovírus e Infecções oportunistas). Além disso, outros têm mostrado que os locais de integração XMRV clonados a partir de tecidos da próstata de dois dos nove pacientes pode ter sido o resultado da contaminação com ADN proveniente de células DU145 infectados experimentalmente [33], enquanto que outros locais de integração XMRV não são genes supressores de tumor ou perto proto oncogenes [34]. Combinados, estes resultados levantam questões sobre o papel do XRMV no câncer de próstata. No entanto, é necessário mais trabalho para entender melhor a prevalência de XMRV e MLVs em seres humanos e seu papel na doença humana.

Materiais e Métodos

População do estudo

Anonymous, arquivado tecido de plasma e de próstata estavam disponíveis de 162 pacientes com câncer de próstata US recolhidos pela Fox Chase Cancer Center (FCCC) bioamostra Repository Núcleo Facilidade entre 1997 e 2004. amostras de sangue total foram coletadas no momento do teste pré-cirúrgico ou no dia da cirurgia antes da anestesia a partir consentindo pacientes com câncer, como parte de um estudo aprovado pelo Seres Humanos Comitê de FCCC. consentimento informado por escrito foi obtido de todos os participantes. A Comissão de Ética Assuntos FCCC Humanos recolha, armazenamento e testes futuros dos espécimes coletados de todos os participantes do estudo com consentimento aprovado. A determinação não-pesquisa foi aprovado para o teste das amostras anónimos no CDC para XMRV e vírus relacionados. A idade no momento do diagnóstico dos 162 participantes variou de 36 a 71 anos, com uma média e mediana de 57 anos. 86% eram caucasianos, 12% Africano-americanos, e 1% eram asiáticos, não registradas, ou outra. O antigénio específico da próstata no soro média e mediana (PSA) foram 7,22 ng /mL e 5,5 ng /mL, respectivamente. O grau do tumor por 75 dos 162 (46%) dos participantes foi moderadamente diferenciado, enquanto 54% tinham tumores pouco diferenciados. Usando o sistema de Gleason, 42% da população do estudo tiveram grau 5-6 câncer, 40% tiveram grau 7, e 18% tinham adenocarcinoma da classe alta (pontuação de Gleason 8-10). estadiamento patológico classificados os tumores da próstata como T1C (0,6%), T2A (9,3%), T2B (3,1%), T2C (61,7%), T3A (17,9%), T3B (5,6%), e T4 (1,8%).

preparação de amostras

O plasma foi dividido em alíquotas e armazenadas a -80 ° C no prazo de 4 horas de recolha de sangue. As amostras de plasma foram alíquotas novamente no CDC após o descongelamento para o teste sorológico; as alíquotas restantes foram congeladas a -80 ° C. As amostras de ADN foram preparadas por extracção com fenol-clorofórmio de tecidos da próstata em CQMC utilizando procedimentos padrão. Apenas tecidos humanos, são processados ​​no CQMC. Para amostras seleccionadas Minikit DNA QIAamp (Qiagen, Carlsbad, CA) foi utilizado no CDC. Para o plasma por RT-PCR a testar um volume de 0,5-1,0 ml foi ultracentrifugado a 45000 rpm para concentrar vírus. 360 ul a 860 ul de plasma sobrenadante foi cuidadosamente removido e o sedimento foi ressuspenso em 140 ul de plasma centrifugado que permanece no tubo e, em seguida, o ARN foi extraído utilizando o QIAamp viral RNA minikit (Qiagen, Valencia, CA). As concentrações de ácido nucleico foram determinadas por espectrofotometria utilizando o instrumento Nanodrop (Thermo Scientific, Wilmington, DE). A integridade das amostras de ADN e ARN foi determinada utilizando ß-actina ou GAPDH de PCR, respectivamente, como descrito [35], [36]. Toda a preparação da amostra, cultura de tecidos, e os testes de PCR foi feito em salas fisicamente isolados para evitar a contaminação.

Detecção do XMRV

Para detectar o XMRV e outras variantes MLV foram utilizados ensaios de PCR separadas com iniciadores específica para a detecção de XMRV, ou @ primers @ conservados para a detecção genérica de MLV e XMRV, como previamente descrito [21]. amostras de ADN foram rastreadas utilizando dois ensaios de PCR aninhados. O primeiro ensaio usa o PCR primers GAGOF, Gagor, GAGIF e GAGIR empregado por Urismann

et al.

E por Lombardi

et al.

Para detectar 413 pb XMRV

gag

sequências em pacientes com câncer de próstata e em pessoas com CFS, respectivamente [7], [18]. O segundo ensaio de PCR detecta genericamente MLV e XMRV polimerase (

pol

) sequências de cerca de 216 pb de comprimento usando o XPOLOF primers, XPOLOR, XPOLIF e XPOLOR [21]. Tanto o

gag e

pol

testes de PCR pode detectar 10 cópias de DNA plasmídeo XMRV diluído em um fundo de 1 ug de DNA humano [21]. As amostras teste positivo para ambos os

da mordaça ou

pol

sequências foram re-testado com ambos os ensaios, e também foram testados com um terceiro teste PCR para envelope XMRV (

env

) sequências que também é genérico para XMRV /MLV. O XENVOF externo (5 ‘GGG GAT CTT GGT GAG GGC AGG AGC 3’) e XENVOR (5 ‘CAG AGA GAA CAG GGT CAC CGG GTC 3’) e primers XENVIF interna (5 ‘AGG GCT ACT GTG GCA AAT GGG GAT 3’ ) e XENVIR (5 ‘CCT TTT ACC CGC GTC AGT GAA TTC 3’) amplificar um 215-bp

env

sequência. Em adição, um subconjunto de amostras (n = 77) para os quais estava disponível ADN suficientes foram testados em triplicado usando o

pol

ensaio de PCR aninhada para melhorar a detecção do número de cópias baixo XMRV /MLV.

a PCR foi efectuada utilizando 1 ng de ADN de tecido prostático em um volume reaccional de 100 ul utilizando condições padrão de 94 ° C durante 30 seg, 50 ° C durante 30 seg, e 72 ° C durante 45 seg durante 40 ciclos num ABI 9700 termociclador ( Foster City, CA). Os produtos de PCR foram visualizados por electroforese em um gel de agarose 1,8% corado com brometo de etídio. Para aumentar a sensibilidade e especificidade dos ensaios, amplificada

gag

,

pol

, e

env

sequências foram confirmadas por análise de Southern blot usando os oligoprobes biotinilados XGAGP2 (5 ‘ ACC TTG CAG CAC TGG GGA GAT GTC 3 ‘), XPOLP (5’ TTG ATG AGG CAC TGC ACA GAG ACC 3 ‘), e XENVP (5’ TGG GCT CCG GTA GCA TCC AGG GTG 3 ‘) e detecção de quimiluminescência. Como o XMRV

gag e

pol

ensaios de PCR [21], o novo XMRV

env

teste de PCR também foi capaz de detectar 10 cópias do plasmídeo XMRV em um fundo de 1 ug de DNA humano (30/32, 93,8%). Nós não detectar qualquer XMRV /sequências de MLV no DNA PBMC de 41 doadores de sangue americanos utilizando cada um dos três testes de PCR aninhados [21].

Amostras

Quantitative XMRV RNA RT-PCR

de plasma de pessoas com resultados positivos XMRV de PCR no ADN do tecido de próstata foram testados ainda para o RNA viral utilizando dois ensaios de RT-PCR. O primeiro ensaio, referido como q

pro

usa MLV /XMRV protease genérico (

pro

) iniciadores Taqman Pro-UNV-F1 (5 ‘CCT GAA CCC AGG ATA ACC CT 3’) e Pro-UNV-R1 (5 ‘GTG GTC CAG CGA TAC CGC T 3’) e sondas Pro-UNV-P1C (FAM5 ‘AGA TAC TGG GGC CCA ACA CTC CGT GCT GAC 3’BHQ1) e Pro-UNV-PR1 ( Os resultados e conclusões deste relatório são de responsabilidade dos autores e não representam necessariamente os pontos de vista dos Centros de Controle e Prevenção de Doenças.