Abstract
O ácido acetilsalicílico (aspirina) é altamente eficaz para o tratamento de pacientes com câncer de cólon postdiagnosis; No entanto, os mecanismos de acção da aspirina no cancro do cólon não são bem definidas. A aspirina e a sua apoptose induzida principal metabolito salicilato de sódio e diminuiu o crescimento das células do cancro do cólon e do sal de sódio de aspirina também inibiu o crescimento do tumor em um modelo de murganho de xenoenxerto nus atímicos. a inibição do crescimento de células de cancro do cólon foi acompanhada por regulação negativa de proteínas SP1, SP4 e SP3 e a diminuição da expressão de produtos de genes regulados incluindo Sp-Bcl-2, a survivina, VEGF, VEGFR1, ciclina D1, c-Met e p65 (NFkB). Além disso, também mostrou por interferência de RNA que beta-catenin, um importante alvo de aspirina em alguns estudos, é um gene Sp-regulado. Aspirina induzida clivagem dependente de caspase nuclear de proteínas SP1, SP3 e SP4 e essa resposta foi relacionada com o sequestro de íons de zinco desde adição de sulfato de zinco bloqueou a apoptose mediada pela aspirina e repressão de proteínas SP. Os resultados demonstram um mecanismo subjacente importante da acção da aspirina como um agente anti-cancro e, com base no rápido metabolismo de aspirina para salicilato em seres humanos e os rácios de alta salicilato /aspirina no soro, é provável que a actividade anti-cancro de aspirina é também devido ao metabolito salicilato
Citation:. Pathi S, Jutooru I, Chadalapaka G, Nair V, Lee SO, S seguro (2012) aspirina inibe celular cancro do cólon e crescimento do tumor e regula negativamente Especificidade Proteína (SP) Fatores de transcrição . PLoS ONE 7 (10): e48208. doi: 10.1371 /journal.pone.0048208
editor: Aamir Ahmad, Faculdade de Medicina da Wayne State University, Estados Unidos da América
Recebido: 09 de agosto de 2012; Aceito: 24 de setembro de 2012; Publicação: 26 de outubro de 2012
Direitos de autor: © 2012 Pathi et al. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Licença Creative Commons Attribution, que permite uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o autor original ea fonte sejam creditados
Financiamento:. Esta pesquisa foi apoiado pelo National Institutes of Health (R01 CA136571) e Texas AgriLife Research. Os financiadores não tiveram nenhum papel no desenho do estudo, coleta de dados e análise, decisão de publicar ou preparação do manuscrito
CONFLITO DE INTERESSES:.. Os autores declararam que não existem interesses conflitantes
Introdução
o ácido acetilsalicílico ou aspirina é uma droga não-esteróide anti-inflamatório não esteróide (AINE) largamente utilizado para o tratamento da dor, febre e outras condições inflamatórias [1] e o papel da aspirina e outros AINEs em cancro tem sido extensivamente investigada [2], [3]. O uso de aspirina está associado à diminuição do risco de colorretal, mama, esôfago, pulmão, estômago e ovário, e aspirina é tanto um quimiopreventivo e agente quimioterápico para câncer de mama e do cólon [4] – [8]. Um relatório recente sobre os efeitos quimiopreventivos de aspirina mostrou que a incidência de câncer de cólon na Escócia diminuiu significativamente na população em geral com a dose diária mais baixa de aspirina (75 mg) e a diminuição da incidência foi observada mesmo depois de apenas 5 anos de uso de aspirina [7]. Em outro estudo sobre os efeitos quimioterápicos de aspirina em pacientes com câncer de cólon, a taxa de risco de 0,53 (para a mortalidade) foi observado em pacientes que não usaram a droga antes do diagnóstico e esse valor diminuiu para 0,39 para um subgrupo de pacientes com superexpressão cyclooxygenase- 2 (COX-2) [5]
Vários estudos sobre células de cancro do cólon e modelos de tumor de cólon confirmaram que a aspirina inibe o crescimento e induz a apoptose em tais sistemas.; No entanto, os efeitos específicos da aspirina são tanto variável nestes relatórios. Por exemplo, a aspirina regula negativamente a expressão de Bcl-2 [9], inibe o factor de crescimento endotelial vascular, exibe actividade anti-angiogénico [10], [11], e inibe a via Wnt /β-catenina [12]. Dunlop e colegas também têm demonstrado que a regulação negativa induzida por aspirina de IκBα em células de cancro do cólon resulta em acumulação nuclear melhorada do NFkB complexo (p65 /p50) e esta foi ligada a uma via de pró-apoptótico em células de cancro do cólon [13] – [15]
etil-2 -. [(2,3-bis (nitrooxi) propil) disulfanyl] benzoato de metilo (GT-094) é um fármaco anti-inflamatório nitro-não-esteróide sintético (NO-AINE) e como a aspirina, GT-094 também inibe a célula de câncer de cólon e tumor de crescimento [16], [17]. estudos mecanicistas indicam que a atividade anticâncer de GT-094 é devido, em parte, à regulação baixa ROS-dependente de proteína especificidade (Sp) fatores de transcrição Sp1, SP3, SP4 e Sp regulamentados genes que incluem bcl-2, survivin, crescimento de hepatócitos receptor do factor de (c-Met), o VEGF e o seu receptor VEGFR1 [17]. Outros fármacos, incluindo NSAIDs, tais como inibidores do ácido tolfenâmico e COX-2, também inibem o crescimento de células de cancro e regulam negativamente factores de transcrição Sp [18] – [26] e, neste estudo, investigou-se o efeito da aspirina sobre as proteínas SP e outros SP- genes regulados incluindo β-catenina. Nossos resultados mostram que a aspirina e salicilato de regular negativamente SP1, SP3, SP4 e vários produtos de genes Sp-regulados em células de câncer de cólon e identifica uma via importante para a atividade anticâncer da aspirina que é consistente com a interferência de RNA estudos (RNAi) em que knockdown SP1, SP3 e Sp4 em células cancerosas, também inibe o crescimento e induz a apoptose [24] – [26]. Knockdown de proteínas Sp também demonstrado que β-catenina é um gene Sp-regulado em células cancerígenas do cólon. Os resultados deste estudo, juntamente com os relatórios anteriores sobre os mecanismos de inibição mediada pela aspirina do crescimento das células do cancro do cólon, também irá facilitar o desenvolvimento de terapias com aspirina e NSAID análogos em combinação com outros agentes utilizados para tratar o cancro do cólon. Os rácios de salicilato /aspirina alta de soro relatados observados em estudos humanos usando aspirina [27] sugerem que salicilato pode ser um importante contribuinte para a atividade anticâncer da aspirina em pacientes com câncer de cólon.
Procedimentos Experimentais
As linhas celulares, reagentes e anticorpos
RKO, SW480, HT-29 e HCT-116 linhas celulares de carcinoma do cólon humano foram obtidas da American Type Culture Collection (Manassas, VA). células RKO e SW480 foram mantidas em Dulbecco modificado /de Ham F-12 (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO) com vermelho de fenol suplementado com bicarbonato de 0,22% de sódio, soro de bovino fetal a 5%, e 10 ml /L 100X antibiótico /antimicótico solução (Sigma). As células HT-29 e HCT-116 foram mantidas em meio de McCoy 5A (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO) com vermelho de fenol suplementado com bicarbonato de 0,22% de sódio, soro fetal bovino a 10%, e 10 ml /L 100X anti-biótico solução anti-micótica (Sigma). As células foram cultivadas em
2 em placas de cultura de um aparelho de ar /CO
2 (95:5) atmosfera 150 cm a 37 ° C e passados aproximadamente a cada 3-5 dias. Todos os anticorpos foram adquiridos a partir de Santa Cruz Biotechnology (Santa Cruz, CA), excepto poli clivado (ADP) polimerase ribose (PARP) e c-Met (Cell Signaling Technology, Danvers, MA), SP1, survivina e VEGF-R2 (Millipore, Temecula, CA), e p65 VEGFR1 (Abcam Inc. Cambridge, MA), e anticorpos de p-actina (Sigma-Aldrich). β-catenina foi comprado de Epitomics, Inc., Burlingame, CA. O ácido de sódio e salicilato de AINEs acetilsalicílico foram adquiridos da Sigma-Aldrich. N, N, N ‘, N’-tetraquis (2-piridil metil) etilenodiamina (TPEN), glutationa (98%) (GSH), lactacistina e foram adquiridos da Sigma-Aldrich (St. Louis, MO). Dithiothretol (DTT) (98%) foi obtido a partir de Boehringer Mannheim Corp, (Indianapolis, IN). inibidores de caspases 2, 8 e 9 e pancaspase inibidores (Z-VAD-FMK) são comprados de Calbiochem (San Diego, CA). Leptomycin B era inibidor de exportação nuclear comprado de Enzo Life Sciences International, Inc. (Plymouth Meeting, PA). Lipofectamina e Lipofectamine 2000 foram adquiridos a partir de Invitrogen. reagente de luciferase foi de Promega (Madison, WI). reagente de p-galactosidase foi obtido a partir de Tropix (Bedford, MA). construção do promotor de NFkB foi adquirido da Stratagene (Cedar Creek, TX). As construções do promotor de VEGF e survivinas foram fornecidos pelos Drs. Gerhard Siemeister e Gunter Finkenzeller (Instituto de Medicina Molecular, Tumor Biology Center, Freiburg, Alemanha) e Dr. M. Zhou (Emory University, Atlanta, GA), respectivamente. SP1 e promotoras Sp3 construções foram gentilmente cedidas pelos Drs. Carlos Cuidad e Veronique Noe (Universidade de Barcelona, Barcelona, Espanha).
ensaios de proliferação celular
RKO, SW480, HT-29 e HCT-116 linhas de células de câncer de cólon foram semeadas (3 × 10
4 por poço) utilizando meio DMEM: F-12 de Ham contendo 2,5% de carvão despojado de soro fetal bovino (FBS) em placas de 12 poços e deixou-se aderir durante 24 h. As células foram então tratadas com quer veículo ou as concentrações indicadas de aspirina e salicilato de sódio. Após 24, 48 e 72 h de tratamento, as células foram contadas utilizando um contador de partículas Coulter Z1. Cada experimento foi realizado em triplicado e os resultados são expressos em média ± SE para cada determinação.
anexina V coloração
A apoptose, kit de detecção de celular por necrose e saudável foi comprado de Biotium, Inc (Hayward , CA). RKO, SW480, HT-29 e HCT-116 células cancerígenas do cólon (7,5 × 10
4) foram semeadas em Lab-Tek duas lâminas de vidro de cobertura câmaras e deixadas a ligar durante a noite. Após o tratamento com aspirina (10 mM) durante 24 horas, as células foram lavadas com soro fisiológico tamponado com fosfato frio (PBS) duas vezes e incubadas com FITC de anexina V, de etídio homodímero III e Hoechst 33342 em Anexina V tampão de ligação durante 20 minutos de acordo com o fabricante do instruções no protocolo. As células foram então lavadas duas vezes com tampão de ligação a Anexina V e detectado por flouroscence com microscópio de fluorescência digital.
Ensaios de interferência siRNA
siRNAs para SP1, SP3, SP4 e Lamin foram adquiridos da Sigma- Aldrich. Os complexos de siRNA utilizados neste estudo são indicadas da seguinte forma:
Lamin: SASI_Hs02_00367643
SP1: SASI_Hs02_00363664
Sp3 5′-GCG GCA GGA GGU GCC UUC ACU TT
Sp4 5′-GCA GUG ACA CAU UAG GCT T
UGA
RKO e câncer de cólon SW480 linhas celulares foram semeadas (6 × 10
4 por ml) em placas de 6 poços em DMEM: meio F-12 de Ham suplementado com FBS 2,5% de carvão despojado sem antibiótico e deixou-se aderir durante 1 d. Knockdown de SP1, Sp3, Sp4, individualmente ou uma combinação de todas as 3 proteínas realizada utilizando siRNA apropriado juntamente com iLamin como controlo foi realizada utilizando LipofectAMINE 2000 o reagente de transfecção de acordo com as instruções do fabricante.
A transfecção e ensaio da luciferase
RKO e SW480 células cancerígenas do cólon (1 × 10
5 por poço) foram plaqueadas em placas de 12 poços em meio F-12 DMEM /Ham suplementado com FBS 2,5% de carvão-descascada. Após 24 h, diversas quantidades de ADN [isto é, 0,4 ug pGL3-Luc, 0,04 ug β-galactosidase, e 0,4 ug pNFκB-Luc (4) -Luc] foram transfectadas utilizando o reagente Lipofectamine 2000 de acordo com o protocolo do fabricante. Depois de 5 horas da transfecção, a mistura de transfecção foi substituído por meio completo contendo quer veículo (DMSO) ou o composto indicado em DMSO.
Para estudos de interferência de ARN, células de cancro do cólon SW480 e RKO foram co-transfectadas com ARNsi de Sp1, SP3, SP4 ou Lamin juntamente com várias quantidades de ADN de pGL3-Luc ou 0,4 ug pNFκB-Luc. Após 22 h, as células foram então lisadas com 100 ul de tampão lise repórter 1X, e extractos de células (30 ml) foram utilizadas para ensaios de luciferase e β-galactosidase. Um luminómetro Lumicount foi utilizada para quantificar as actividades da luciferase e β-galactosidase, e as actividades de luciferase foram normalizados para actividade de p-galactosidase.
Western blots
RKO, SW480, HT-29 e HCT- 116 células de cancro do cólon foram semeadas em meio DMEM: F-12 de Ham contendo 2,5% de carvão despojado-FBS e, após 24 h, as células foram tratadas com quer veículo (DMSO) ou os compostos indicados. As células foram recolhidas utilizando tampão de alto teor salino (50 mM de HEPES, 0,5 mol /L de NaCl, MgCl 1,5 mM
2, EGTA 1 mM, glicerol a 10%, e 1% de Triton-X-100) e 10 mL /L de Protease inibidor de cocktail (Sigma-Aldrich). Após a centrifugação dos lisados a 15000
g
durante 15 min a 4 ° C, os sobrenadantes foram recuperados, e proteína foi quantificado pelo ensaio de proteína de Bradford. os lisados de proteína (15-60 ug) foram incubadas durante 5-10 min a 100 ° C, juntamente com tampão de carga 5X e, em seguida, separados por electroforese em 7,5-12% de gel de sulfato de poliacrilamida-dodecilsulfato de sódio a 120 V durante 3-4 hr. As proteínas foram transferidas para membranas de difluoreto de polivinilideno por electrotransferência molhado num tampão contendo Tris 25 mM, glicina 192 mM e metanol a 20% durante 1,5 h a 180 mA. As membranas foram bloqueadas durante 45 minutos com 5% TBST-Blotto (Tris-HCl a 10, NaCl 150 mM, pH 8,0, 0,05% de Triton X-100, e 5% de leite em pó magro) e incubou-se em fresco 5% TBST-Blotto com 1:500 anticorpo primário durante a noite com agitação suave a 4 ° C. Depois de lavar duas vezes com TBST, durante 10 min, a membrana foi incubada com o anticorpo secundário (1:5000) em 5% TBST-Blotto durante 3-4 h por agitação suave. A membrana foi lavada duas vezes com TBST, durante 10 min, incubou-se com 2 ml de substrato de quimioluminescência (Millipore, Temecula, CA) durante 1 min, e expostas a Kodak Image Station 4000 milímetros Pro (Carestream Health, Rochester, NY).
estudos de xenoenxerto em ratinhos atímicos
ratinhos nus atímicos fêmeas foram adquiridos de Harlan Laboratories (Indianapolis, IN). Os ratos foram alojados e mantidos sob condições específicas isentos de agentes patogénicos em instalações aprovadas pela Associação Americana de Acreditação do Laboratório Animal Care e de acordo com os regulamentos e as normas do Departamento de Agricultura dos EUA, Estados Unidos Departamento de Saúde e Serviços Humanos atuais. Este estudo foi realizado em estrita conformidade com as recomendações do Guia para o Cuidado e Uso de Animais de Laboratório do National Institutes of Health. O protocolo foi aprovado pela Texas A M University Institutional Animal Care e Use Committee (IACUC) (AUP # 2012-131). Todos cirurgia foi realizada sob anestesia pentobarbital de sódio, e todos os esforços foram feitos para minimizar o sofrimento. Para produzir tumores, células RKO foram colhidas de culturas subconfluentes por uma breve exposição a 0,25% de tripsina e 0,02% de ácido etilenodiaminotetra-acético. A tripsinização foi parada com meio contendo soro fetal bovino a 10%, e as células foram lavadas uma vez em meio isento de soro e ressuspensas em meio isento de soro. Apenas foram utilizadas as suspensões que consiste em células individuais com 90% de viabilidade para as injecções. Um xenoenxerto foi estabelecida por injecção subcutânea de células (3 x 10
6) nos flancos de ratinhos individuais. Os tumores foram deixados crescer durante 6 d até que eram palpáveis. Os ratinhos foram então divididos aleatoriamente em dois grupos de 6 ratinhos por grupo e doseado por sondagem oral em óleo de milho 200 mg /kg /dia (neutralizado com uma concentração equimolar de NaOH) de aspirina em todos os dias durante 14 d. Os ratos foram pesados, e o tamanho do tumor foi medido a cada segundo dia com pinças para permitir o cálculo dos volumes dos tumores: V = LW
2/2, onde L e W foram comprimento e largura, respectivamente. Após 14 d, os animais foram sacrificados; corpo e tumorais pesos finais foram determinadas e plotados. No final da experiência, os principais órgãos viscerais e os tumores foram recolhidos e analisados quanto a expressão da proteína SP e indução de apoptose utilizando manchas de Western e a coloração TUNEL respectivamente.
A análise estatística
A significância estatística de diferenças foi determinada por análise da variância e do teste t de Student, e os níveis de probabilidade foram anotados. Todos os testes estatísticos foram bilaterais. IC
50 valores foram calculados usando análise de regressão não-linear e expressos em mM, em intervalos de confiança de 95%.
Resultados
A aspirina inibe o crescimento e induz a apoptose em células cancerígenas do cólon
neste estudo, diferentes concentrações (2,5-10 mM) de aspirina inibiu o crescimento de SW480, RKO, HT29 e células HCT-116 ao longo de um período de 3 dias (Figs. 1A e 1B), e IC
50 valores para a inibição do crescimento induzida por aspirina estavam na gama de 2,5-5 mm em todas as linhas de células de 4. A dose mais elevada (10 mM) de aspirina foi usada para determinar os efeitos pró-apoptóticos deste composto após o tratamento por apenas 24 horas e os resultados mostram que a aspirina aumento de coloração Anexina V em todas as linhas celulares de cancro do cólon 4 (Fig. 1C). Os efeitos pró-apoptóticos de aspirina (5 e 10 mM) foram investigados em células cancerígenas do cólon, determinando as alterações na expressão de proteínas de sobrevivência bcl-2 e survivina e a indução da clivagem de PARP dependente da caspase. Aspirina induziu uma regulação negativa da sua concentração e dependente do tempo da survivina e Bcl-2 e clivagem de PARP induzida de, um marcador de apoptose (Fig. 1D e 1E).
Inibição de SW480 e RKO (A) e HT29 e HCT116 (B) a proliferação celular. As células foram tratadas com DMSO ou aspirina 2,5-10 mM durante 3 dias, e os números de células foram determinados como descrito nos Procedimentos Experimentais. Indução de coloração de anexina V (C) e respostas apoptóticas em RKO e SW480 (D) e HT29 e células HCT-116 (E). Coloração Anexina V foi determinada tal como descrito nos Procedimentos Experimentais. A expressão de proteínas apoptóticas clivagem de PARP foi determinada por análise de transferência de Western de lisados de células inteiras, tal como descrito nos Procedimentos Experimentais. Resultados em (A) e (B) são meios ± SE para 3 determinação replicado para cada grupo de tratamento, e significativa (p 0,05) inibição é indicado (*)
Aspirina e salicilato regula negativamente SP1. , SP3, SP4 e Sp regulamentados genes
estudos anteriores por interferência de RNA (RNAi) mostram que tanto survivina e Bcl-2 são reguladas pelo SP1, SP3 e SP4 células cancerosas [17], [22], [24] – [26]. Portanto, as células RKO, SW480, HT29 e HCT116 foram tratados com aspirina 5 e 10 mM durante 24 ou 48 h e análise de Western blot mostrou que houve uma diminuição da sua concentração e dependente do tempo nas proteínas SP1, SP4 SP3 e em todos os quatro células linhas (Figs. 2A e 2B). Além disso, o tratamento de RKO, SW480, HT-29 e HCT116 células cancerígenas do cólon com aspirina 5 ou 10 mM durante 24 ou 48 horas, também a diminuição da expressão de vários produtos de genes regulados pelo SP1, SP3 e Sp4 [24] – [29] e estes incluem o VEGF, VEGFR1, ciclina D1 e proteínas de c-Met (fig. 2C e 2D), e os efeitos da aspirina na sua expressão foram ambos sua concentração e do tempo-dependente.
regulação negativa de proteínas e Sp em RKO SW480 (A) e HT29 e HCT116 (B) e produtos de genes Sp-regulados em RKO e SW480 (C) e HT29 e células HCT-116 (D). As células foram tratadas com aspirina 5 ou 10 mM durante 24 ou 48 horas, e os lisados celulares totais foram analisados por análise de Western blot, conforme descrito nos Procedimentos Experimentais. Os resultados são típicos de experiências em duplicado. (E) A aspirina diminui a atividade do gene repórter. As células foram transfectadas com pSp1For4, pSp3For5, pVEGF e pSurvivin e tratadas com DMSO ou aspirina (5 ou 10 mM). A actividade de luciferase foi determinada como descrito nos Procedimentos Experimentais. Os resultados são expressos em média ± SE (3 repetições) e significativa (p 0,05). Inibição é indicado (*)
Nós também investigou os efeitos da aspirina 5 e 10 mM sobre a actividade luciferase em RKO e as células SW480 transfectadas com construções contendo inserções de promotores ricas em GC do Sp1 (pSp1For4, -751 a -20), Sp3 (pSp3For5, -417 a -38), VEGF (pVEGF, -2018 a +50), e survivin ( genes pSurvivin, -269 a +49) (Fig. 2E). Com a excepção da construção de VEGF, 5 e 10 mM de aspirina diminuiu significativamente a actividade de luciferase e estes resultados correlacionaram-se com a diminuição da expressão da correspondente SP1, SP3, VEGF e proteínas survivina em células RKO e SW480. O aumento na actividade da luciferase em células RKO tratados com aspirina 5 mM e transfectada com pVEGF pode ser devido à relativamente baixa regulação negativa desta proteína que só foi observada após 48 h à concentração de 10 mM, sugerindo que outras vias induzida por aspirina pode igualmente ser activação de VEGF.
a aspirina é rapidamente metabolizado em salicilato [27] e os efeitos de salicilato no crescimento das células do cancro do cólon, proteínas Sp e Sp genes regulados foi também investigado (Fig. 3). Salicilato de (sal de sódio) (2,5-10 mM) inibiu o crescimento também de todas as 4 linhas de células (Figs. 3A e 3B), e os efeitos inibidores de crescimento foi semelhante à observada para a aspirina (Figs. 2A e 2B). A inibição do crescimento foi acompanhada pela regulação negativa dependente do tempo de SP1, SP3, SP4 e produtos de genes Sp-regulados (Bcl-2, ciclina D1, survivina e VEGF) em RKO e SW480 (Fig. 3C) e HCT116 e HT29 (Fig. 3D) células. Este padrão de resposta para o salicilato de sódio foi comparável ao observado para a aspirina (Figs. 1 e 2) e efeitos semelhantes também foram observados para salicilato de metilo (dados não apresentados) que também é metabolizada rapidamente para salicilato.
Inibição de RKO e SW480 (A) e HCT116 e o crescimento de células HT29 (B). As células foram tratadas com salicilato de sódio 2,5-10 mM durante até 3 dias, e os números de células foram determinados como descrito nos Procedimentos Experimentais. regulação negativa de proteína na RKO e SW480 (C) e HCT116 e células HT29 (D). As células foram tratadas com salicilato de 5 ou 10 mM durante 24 ou 48 horas, e os lisados celulares totais foram analisados por Western blot como descrito nos Procedimentos Experimentais.
supressão induzida por aspirina e de NFkB β-catenina é devido, em parte, para o SP-downregulation
foi previamente relatado que a aspirina melhorada acumulação nuclear NFkB [13] – [15] e este foi adicionalmente investigada em células RKO e SW480 tratadas com 5 e 10 mM aspirina durante 48 h. Níveis de níveis de p65 e p50 citossólicos foram reduzidos, enquanto que os níveis de p65 e p50 nucleares permaneceram relativamente inalterados após tratamento com aspirina (Figs 4A e 4B.) E estes resultados diferiam com estudos anteriores [13] – [15]. Além disso, os níveis globais de proteínas nucleares foram 10% de proteínas citosólicas e isto foi confirmado por análise de transferência de Western de lisados de células inteiras a partir de células tratadas com aspirina 5 ou 10 mm, o que mostrou que ambas as proteínas p65 e p50 foram reduzidos em ambas as linhas celulares dentro de 48 horas após o tratamento com aspirina (Figs. 4A e 4B). A aspirina também diminuiu a actividade da luciferase em células SW480 e RKO transfectadas com um constructo pNFκB-Luc (Fig. 4C) e estes resultados foram consistentes com a regulação negativa observada de ambas as proteínas p65 e p50 (Fig. 4A e 4B). Estudos anteriores relataram que a aspirina diminuiu expressão β-catenina em células cancerígenas do cólon [12] e os nossos resultados confirmaram que a aspirina 5-10 mM também diminui a expressão β-catenina em células cancerígenas do cólon RKO e SW480 (Fig. 4D).
Diminuição p65 /p50 em RKO (a) e células SW480 (B). As células foram tratadas durante 48 h com 5 ou 10 mM, e células inteiras, extractos nucleares e citossólicos foram analisados por análise de Western blot, conforme descrito nos Procedimentos Experimentais. Os níveis de proteínas p65 e p50 (em relação ao p-actina) em lisados de células inteiras foram quantificadas a partir de 3 experiências em replicado e foram significativamente diminuída pela aspirina. (C) A aspirina diminui NFkB-Luc. A construção foi transfectada em células RKO e SW480 tratadas com DMSO ou aspirina, e a actividade da luciferase determinada tal como descrito nos Procedimentos Experimentais. Os resultados são médias ± DP (3 repetições) e significante (p 0,05) inibição é indicado (*). (D) regulação negativa do β-catenina. As células foram tratadas com aspirina 5 ou 10 mM durante 48 horas, e os lisados celulares totais foram analisados por Western blot como descrito nos Procedimentos Experimentais.
Desde NFkB (p65) e os promotores β-catenina conter locais de ligação Sp ricas em GC [28], [29], usamos RNAi para determinar o papel do SP1, SP3 e SP4 regulação da p65, p50 e β-catenina em células de câncer de cólon. células RKO e SW480 foram transfectadas com pequenos RNAs inibidoras de segmentação Sp1 (ISP1), Sp3 (iSp3) e SP4 (iSp4) isoladamente e em combinação (ISP1 /3/4). A Figura 5A mostra que cada oligonucleotídeo indivíduo diminuição da expressão do seu objectivo individual (SP1, SP3 e SP4) e ISP1 /3/4 derrubado todas as três proteínas. ISP1 também diminuiu expressão do SP4 (mas não SP3) e isso é consistente com estudos anteriores que mostram interações cruz-regulação entre os fatores de transcrição Sp devido aos seus promotores ricas em GC [22], [25]. A Figura 5B ilustra as diferenças dependentes do contexto das células nos efeitos de ISP1, iSp3 e iSp4 sobre a expressão p65 em RKO e células SW480 em que Sp1, SP3 e Sp4 knockdown resultaram em pequenas mudanças na p65 em células RKO e SP1 e em menor Sp4 knockdown extensão diminuiu p65 em células SW480. ISP1 /3/4 (oligonucleotídeos combinados) diminuição da expressão p65 em ambas as linhas celulares, enquanto foram observados efeitos mínimos de p50. Assim, a regulação negativa induzida por aspirina de p50 (Fig. 4A e 4B) foi Sp-independente. A Figura 5C mostra que ISP1 /3/4 também diminuiu a actividade da luciferase em RKO (90%) e SW480 (40%), as células transfectadas com o constructo de NFkB-Luc, e os diferentes efeitos de Sp knockdown nestas células sugerem um papel mais dominante para regulação dependente do Sp de NFkB na RKO do que as células SW480. knockdown Sp (combinado) também diminuiu proteína β-catenina em RKO e células SW480 e resultados de knockdown de proteínas Sp individuais sugerem que Sp1 e Sp4 são os factores de transcrição dominantes necessários para a expressão constitutiva de β-catenina em células RKO, enquanto knockdown de Sp1 , Sp4 SP3 e diminuir os níveis de β-catenina de proteínas em células SW480 (Fig. 5D). Interessantemente, os estudos de ARNi mostra que a clivagem de PARP (apoptose) é induzida principalmente após o knockdown de Sp3 em ambos RKO e células SW480 (Fig. 5E)
knockdown de SP1, SP3, SP4 e Sp1 /3/4. (a) e p65 /p50 (B) em células cancerígenas do cólon. As células foram transfectadas com vários oligonucleótidos, e os lisados celulares totais foram analisados por análise de Western blot, conforme descrito nos Procedimentos Experimentais. (C) Queda do SP1 /3/4 (combinado) inibe NFkB-Luc. As células foram transfectadas com iLamin (controlo) e ISP1 /3/4 (oligonucleótidos combinados) e NFkB-Luc, e a actividade da luciferase foi determinada como descrito nos Procedimentos Experimentais. Os resultados são expressos como média ± EP (3 repetições), e significativamente (p 0,05) a diminuição da actividade é indicado (*). Sp knockdown diminui β-catenina (D) e induz a clivagem de PARP (E). As células foram transfectadas com vários oligonucleótidos, e os lisados celulares totais foram analisados por Western blot como descrito nos Procedimentos Experimentais.
Mecanismo de regulação negativa induzida por aspirina de SP1, SP3 e Sp4
várias vias foram descritos para a degradação Sp melhorada em linhas celulares de cancro e que incluem a activação de proteossomas, caspases e ROS [17] – [20], [22] – [26] e também uma via que envolve a exportação nuclear de Sp1 seguido pela degradação proteolítica no citosol [30]. A análise Western blot das fracções nucleares e citoplasmáticas de RKO e células SW480 mostra que Sp1, SP3 e Sp4 está localizada no núcleo e o tratamento com aspirina diminuiu SP1, SP3 e os níveis de proteína SP4 no núcleo sem qualquer aparente a translocação para o citosol (Fig. 6A). Resultados semelhantes foram observados após a co-tratamento com aspirina e o inibidor de exportação nuclear leptomycin B (combinado), indicando que a exportação nuclear do SP1, SP3 ou Sp4 não era necessária para a regulação negativa induzida por aspirina do SP1, SP3 e SP4. Outros agentes, tais como a nitro-AINE GT-094 e ácido betulinico diminuiu proteínas sp em RKO e células SW480 através da indução de ROS-dependente de Sp transcricional repressor ZBTB10 e esta resposta foi atenuada por antioxidantes, tais como GSH ou DTT [17], [31 ]; No entanto, os resultados na Figura 6B mostram que estes antioxidantes não bloquear a regulação negativa induzida por aspirina de proteínas SP. Os resultados de estudos preliminares mostram que a regulação negativa induzida por aspirina de proteínas Sp também não foi bloqueada por inibidores de proteassoma (dados não mostrados), mas foi afectada por co-tratamento com o inibidor pancaspase Z-VAD-fmk. As Figuras 6C e 6D mostram que induzida por aspirina Sp regulação negativa em células RKO e SW480 foi inibida após co-tratamento com o inibidor pancaspase (Z-VAD-FMK), caspase-2 (Z-VDVAD-FMK), e caspase-8 (Z- Efeitos inibidores mas apenas parcialmente bloqueados com a caspase 9 (Z-LEHD-FMK) inibidor IETD-FMK).
(a) do leptomycin B. as células foram tratadas com aspirina 10 mM, na presença ou ausência de leptomycin B durante 48 h, e os lisados celulares totais foram analisados por análise de western blot, conforme descrito nos Procedimentos experimentais. Efeitos de antioxidantes (B) e inibidores de caspases (C, D) sobre a regulação negativa da proteína Sp induzida por aspirina. As células foram tratadas com DMSO, a aspirina por si só ou em combinação com antioxidantes ou inibidores de caspase, e após 48 horas, os lisados celulares totais foram analisados por Western blot como descrito nos Procedimentos Experimentais.
Favier e colaboradores [ ,,,0],32], [33] relatado anteriormente em células HeLa que o zinco quelação pelo quelante de iões metálicos permeável TPEN activado várias caspases (3, 8 e 9-) e diminuição da expressão de proteínas Sp1, SP3 e SP4 que contêm íons de zinco em sua sítios catalíticos. Tratamento da RKO e células SW480 com 25 ou 50? M TPEN de 18 h de clivagem PARP induzida e ativação (clivagem) de caspases 8, 9, 3 e 7 (Fig. 7A). O papel crítico da depleção de zinco em mediar esta resposta e regulação negativa de proteínas sp foi confirmado por tratamento das células de cancro do cólon com TPEN sozinho ou em combinação com 50