Abstract

p53 tumor supressor, que é ativado por vários stress e ativação de oncogenes, é um alvo para o desenvolvimento de drogas anti-câncer . Neste estudo, por rastreio de painéis de inibidores de cinase de proteína e inibidores de fosfatase de proteína, identificaram-5-Iodotubercidin como um forte activador p53. 5-Iodotubercidin é derivado de purina e é utilizado como um inibidor de várias cinases, incluindo de adenosina-quinase. Descobrimos que 5-Iodotubercidin poderia causar danos no DNA, verificada por meio de indução de quebras de DNA e focos nuclear positivos para γH2AX e TopBP1, ativação de ATM e Chk2, e fosforilação S15 e up-regulação da p53. Como tal, 5-Iodotubercidin induz a paragem do ciclo celular G2 de um modo dependente da p53. Itu também induz a morte celular em p53-dependentes e independentes de maneiras. quebras de ADN foram provavelmente gerado por incorporação de 5-Iodotubercidin metabolito no ADN. Além disso, 5-Iodotubercidin mostrou actividade anti-tumoral, uma vez que pode reduzir o tamanho do tumor em modelos de murganho de xenoenxerto de carcinoma in-p53 dependentes e independentes de maneiras. Estes resultados revelam 5-Iodotubercidin como uma nova droga genotóxico que tem potencial quimioterápico

Citation:. Zhang X, Jia D, Liu H, Zhu N, Zhang W, Feng J, et al. (2013) Identificação de 5-Iodotubercidin como uma droga Genotóxico com Anti-Cancer Potencial. PLoS ONE 8 (5): e62527. doi: 10.1371 /journal.pone.0062527

editor: Carl G. Maki, Rush University Medical Center, Estados Unidos da América

Recebido: 17 de dezembro de 2012; Aceito: 22 de março de 2013; Publicado em: 07 de maio de 2013

Direitos de autor: © 2013 Zhang et al. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Licença Creative Commons Attribution, que permite uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o autor original ea fonte sejam creditados

Financiamento:. O trabalho foi apoiada por doações do National Natural Science Foundation da China (81130039, 31071229 e 81121001), do Ministério da Ciência e Tecnologia da China (o programa científico Key Nacional (2012CB966901, a BL)), Xangai Programa Pujiang (10PJ1405000), Cheung Kong Scholars Programa do Ministério da Educação. Os financiadores não tiveram nenhum papel no desenho do estudo, coleta de dados e análise, decisão de publicar ou preparação do manuscrito

CONFLITO DE INTERESSES:.. Os autores declararam que não existem interesses conflitantes

Introdução

o cancro é uma das principais causas de mortalidade em todo o mundo. De acordo com os dados divulgados recentemente, havia 12,7 milhões de novos casos de câncer e 7,6 milhões de pacientes com câncer morreu em 2008, com câncer de mama sendo mais comum em mulheres e câncer de pulmão mais comum em homens [1]. O tratamento do câncer inclui procedimentos cirúrgicos para remover o tecido maligno e o uso de radioterapia e quimioterapia para matar as células malignas e /ou reduzir o crescimento do tumor. fármacos quimioterapêuticos são classificados em agentes alquilantes, anti-metabolitos, os inibidores da topoisomerase, alcalóides de plantas e terpenóides, antibióticos anti-tumorais, e outros [2]. Até agora, há uma falta de tratamento à prova de falhas para a maioria dos tipos de câncer [3].

Anti-metabólitos são derivados de nucleosídeos, incluindo análogos de pirimidina. por exemplo, gemcitabina e análogos de purina, por exemplo, fludarabina [4]. Eles podem ser incorporados no ADN, levando a terminação da extensão cadeia de ADN nascente. Alguns análogos de nucleósidos também podem inibir as enzimas envolvidas na síntese de enzimas que mantêm ou desoxinucleótidos homeostase de DNA, ainda interferir com a síntese de ADN. Como tal, muitos destes análogos de nucleosídeos causar danos ao DNA incluindo DNA dupla e de cadeia simples quebra para acionar os mecanismos de defesa internos para matar células ou células em divisão rápida submetidos ao reparo de DNA ativo, ou provocar paragem do ciclo celular na fase S [4]. Este é um mecanismo importante pelo qual a maioria dos anti-metabolitos executar sua atividade anti-câncer.

Nas células, o dano ao DNA ou drogas genotóxico ativa uma família de PI3K como quinases (PIKKs), incluindo ATM, ATR, DNA- PKcs nas quebras de DNA ou garfos de replicação paralisadas, onde fosforilam diversas proteínas, incluindo γH2AX, TopBP1, Chk1 /2 e p53. A activação integrada destas proteínas efectoras induz a paragem do ciclo celular, senescência celular ou a apoptose [5], [6]. Como resultado, as células com genoma instáveis ​​são eliminados, o que impede a formação de tumores [7] – [11]. A via ATM-p53 é a principal via de supressão tumoral p53 e é mutante em mais de 50% dos tumores primários humanos [12] – [14].

de activação de p53 promove a paragem do ciclo celular, senescência e apoptose. A activação ou aumento da regulação da proteína p53 em tumores tem sido mostrado para inibir o crescimento do tumor, p53, que estabelece como um alvo para o desenvolvimento de drogas anti-cancro [13], [15]. Vários compostos de moléculas pequenas que têm sido desenvolvidos especificamente alvo interacção Mdm2-p53, p53 estabilizar e inibir o crescimento do tumor. Além disso, a p53 pode ser entregue a tumores com vírus e isso tem sido demonstrado ter efeitos terapêuticos significativos [16]. Para procurar novos potenciais drogas anti-tumorais, nós analisamos os inibidores de moléculas pequenas de um painel de cinases de proteína e um painel de fosfatases de proteína para os compostos que pode activar a p53 [17]. Aqui nós relatamos a identificação de 5-Iodotubercidin (Itu) como um ativador do p53. ITU está a ser utilizado como um inibidor de quinase geral, especialmente de adenosina-quinase (ADK) devido à sua afinidade para os locais de estas enzimas de ligação a ATP e tem sido demonstrado que afectam a proliferação celular e sobrevivência. ADK catalisa a transferência do grupo γ-fosfato de ATP em adenosina, assim, reduzir-regulação dos níveis celulares de nucleótidos de adenina [18] – [20]. Itu tem uma estrutura semelhante à adenosina e foi mostrado para gerar danos no ADN, activar a via ATM-p53, e induzem a paragem do ciclo celular na fase G2 em modos dependente de p53. Itu também promove a morte celular in-p53 dependentes e independentes de boas maneiras. Mais importante ainda, a ITU se verificou ter actividade anti-tumoral, também de maneiras p53-dependentes e independentes de. Estes resultados sugerem que a UIT é uma potencial droga quimioterapêutica com propriedades distintas da maioria dos outros anti-metabolitos. Desde Itu executa a sua actividade anti-tumoral essencialmente por via de geração de danos no ADN, ITU também podem causar instabilidade no genoma em células normais e, potencialmente, conduzir ao desenvolvimento de cancro. Assim, recomenda-se precaução quando se utiliza Itu para o potencial não-relacionadas com o cancro finalidade terapêutica.

Materiais e Métodos

Declaração de Ética

A experimentação animal neste estudo, incluindo BALB /ratinhos nus cASlac, normal C57B /6 ratos, Caixa ATM +/- ratos, foi realizado em conformidade com as recomendações contidas no Guia do Conselho de Pesquisa Nacional para Cuidado e Uso de Animais de laboratório, com os protocolos aprovados pelo Comitê de Cuidado e Uso Institucional animal de Shanghai , China [SYXK (SH) 2011-0112]. Todos os esforços foram feitos para minimizar o sofrimento de ratos

Cultura de Células

O embrião de fibroblastos de rato primária (MEF) células (de C57B /6 ratos) e ATM -. /- MEFs (de 129 ratos ) foram geradas em laboratório, como descrito anteriormente [11]. O HCT116 linhas celulares de cancro do cólon humano (p53 + /+) e HCT116 (p53 – /-) foram um presente do laboratório de B. Vogelstein [21], [22]. Estas células foram cultivadas em DMEM suplementado com soro fetal de bovino inactivado pelo calor a 10% (Hyclone) a 37 ° C numa atmosfera humidificada com 5% de CO

2.

Análise Western Blot

As células foram lisadas em tampão de TNEN (Tris 50 mM, NaCl 150 mM, EDTA 5 mM, 0,5% de NP-40, e 0,1% de Triton X-100) suplementado com NaF 1 mM, na

2VO

3, PMSF a 1 mM, e 1 ug /mL de aprotonina, leupeptina, pepstatina e A. concentração de proteína foi determinada utilizando um ensaio Bio-Rad. As proteínas foram resolvidas por SDS-PAGE e transferidas para membranas de difluoreto de polivinilideno (Millipore). Os anticorpos contra p-ATM, p-Chk2 (Thr68), Chk2, p-p53 (Ser15) ou p53 foram obtidos a partir de sinalização celular. Os anticorpos contra ATM (GTX70103) eram de Genetex. Os anticorpos contra β-actina foram de Santa Cruz Biotechnology.

ARN silenciamento

RNA de interferência pequeno (ARNsi) segmentação de ADK humano foram obtidos a partir da empresa GenePharma e foram transfectados em células HCT116 seguindo o protocolo do fabricante. A sub-regulação de ADK foi avaliada por PCR em tempo real 72 horas após a transfecção. As sequências de siGENOME ADK SmartPool foram AGGGAGAGAUGACACUAUA; GGAGAGAUGACACUAUAAU; AAAGUUAU GCCUUAUGUUG; e GAGAGAUGACACUAUAAUG. controle negativo UUCU CCGAACGUGUCACGUTT; ACGUGACACGUUCGGAGAATT.

Imunofluorescência Histoquímica

MEFs ou células HCT116 cultivadas em lamelas foram lavadas com solução salina tamponada com fosfato (PBS) duas vezes e em seguida fixadas em paraformaldeído a 4% (PFA), que foram permeabilizadas com 0,1% de Triton X em PBS durante 30 minutos à temperatura ambiente. Os anticorpos primários foram diluídos em PBS com 1% de BSA (1:200). As lâminas foram bloqueadas (1% de BSA em PBS) durante 60 minutos à temperatura ambiente, incubadas com anticorpos primários durante a noite a 4 ° C, e de seguida por incubação do anticorpo secundário por 60 minutos à temperatura ambiente. As lâminas foram então montadas e observadas ao microscópio confocal.

RNA Extração e em tempo real PCR

RNAs das células foram extraídas com Trizol (Invitrogen). O ADNc foi sintetizado utilizando um kit de RT Quantscript (Tiangen). Os níveis de ARNm de interesse foram determinadas por PCR em tempo real, e normalizadas para os níveis de β-actina. Em tempo real de PCR foi realizada utilizando Applied Biosystems 7500 sistema.

célula de análise do ciclo

As células foram semeadas em placas de 35 mm e cultivadas durante 24 horas, atingindo 60-70% de confluência. As células foram tratadas com diferentes concentrações de ITU para 24 ou de 48 horas, colhidas por tripsinização, ressuspensas em 200 ul de PBS e fixadas em etanol a 100% durante a noite a 4 ° C. As células fixadas foram sedimentadas por centrifugação, ressuspensas em 800 ul de PBS contendo ribonuclease A (100 ug /ml) e incubou-se durante 30 min a 37 ° C. Em seguida, 10 ul de iodeto de propídio (PI, 4 mg /ml de PBS) foram adicionados às amostras, que foram avaliadas num fluxo FACSCalibur utilizando o software citómetro celular Quest (BD Bioscience).

celular Ensaio de sobrevivência

para medir as taxas de sobrevivência de células após tratamento Itu, as células foram plaqueadas a 1 x 10

4 em placas de 96 poços e cultivadas durante a noite, que foram depois tratados com Itu durante 48 horas. Celular reagente de proliferação de WST-1 (Roche) foi adicionado a cada poço e foi ainda incubada durante 4 horas a 37 ° C. A absorvância foi medida contra um controlo usando o leitor de microplacas a 440 nm. O comprimento de onda de referência foi de 630 nm.

Carcinoma xenoenxerto mouse Modelos

ratos macho BALB /cASlac-nu (3 semanas de idade) foram adquiridos a partir de Xangai SLAC Animais de Laboratório C. LTD. Os ratinhos foram mantidos na instalação de rato SPF durante 1 semana antes de serem inoculados com as células HCT116. HCT116 (p53 + /+ e p53 – /-) as células foram colhidas por tripsinização, contadas e ressuspensas em PBS a uma concentração de 5 × 10

7 /ml. Nós injectado por via subcutânea 3 × 10

6 células nas costas de ratinhos nus BALB /cASlac, com p53 + /+ células do lado esquerdo e p53 – /- células do lado direito. Após 2 semanas, os ratos foram divididos em vários grupos e foram tratados com Itu ou solvente (PBS). Os ratos foram pesados ​​e o tamanho do tumor medido. O comprimento (L) e largura (W) do tumor foram medidos por um paquímetro digital e expressa como volume tumoral (0,5 L × W

2, mm

3).

análise do DNA genômico por HPLC-MS

fase e células HCT116 MEF em parado ou log foram tratados com Itu por diferentes períodos de tempo. O ADN genómico foi extraído com fenol /clorofórmio, lavou-se cuidadosamente com 70% de etanol, e em seguida digerido utilizando um método relatado anteriormente com modificações [23]. Resumidamente, alíquotas de ADN genómico foram incubadas com 1 ml de DNase I (2 U /jil, NEB), 10 uL de veneno de cobra da fosfodiesterase (0,26 mU /uL, Sigma Aldrich), e 2 ul antárctica Fosfatase (5 U /jil, NEB) durante a noite a 37 ° C. A digestão completa deu origem a uma mistura de mononucleosides, julgado por HPLC. As amostras de ADN digeridos foram analisados ​​num sistema de HPLC-MS equipado com uma coluna C18 Agilent (Agilent, San Jose, CA, EUA). O solvente A era água contendo 0,5% (v /v) de ácido fórmico e o solvente B foi metanol contendo 0,25% (v /v) de ácido fórmico. Um perfil de eluição usado foi de 2-20% de B durante 30 minutos aumentando para 98% durante mais 20 min, em seguida, 98% de B durante 10 min, e, finalmente, retornando a 2% de B ao longo de 20 min. A taxa de fluxo foi fixado em 20 l /min e o eluato foi monitorizado a 254 nm. Tipicamente, 5 ul de cada amostra foram injectados utilizando o amostrador bem-placa.

Análise de massa espectrométrica de as amostras de formar o sistema de HPLC foi realizada directamente com um espectrómetro de massa Agilent ESI-TOF. Mass dados espectrais foram registrados no modo de iões positivos ao longo de toda a duração do prazo HPLC. Os dados foram analisados ​​usando QS analistas (Agilent, San Jose, CA, EUA).

análise dos níveis de dNTP celular

Um previamente validado abordagem LC-MS /MS foi utilizado para determinar as concentrações de dNTP [24]. Soluções padrão de dATP e dGTP (dCTP e dTTP foram deixadas de fora, devido a dificuldades técnicas usando este sistema) a uma concentração de 100 mmol /l, foram utilizados para construir um 0, 19,5, 39, 312,5, 625, 1250 e 2500 ng /mL curva de calibração padrão.

As células foram recolhidas e foram ressuspensas em 500 ul de gelo-metanol a 60% frio, agitada em vórtice, e colocado a 95 ° C durante 3 minutos e submetida a ultrassons durante 30 s num sonicador Branson 450 ( Branson, Danbury, CT, EUA). Os extractos foram centrifugados a 16000 g durante 5 min a 4 ° C para remover os detritos celulares e precipitados de proteína e ADN. Os sobrenadantes resultantes foram passados ​​através de filtros Amicon centrífugos-0,5-ml Ultra pré-equilibrada a 4 ° C para remover macromoléculas ( 3 kDa) seguindo o protocolo do fabricante (Millipore, Billerica, MA, EUA). O filtrado foi evaporado sob vácuo centrífuga à temperatura de -70 ° C e o sedimento resultante foi ressuspenso em 25 de água isenta de nuclease ul pronto para ensaiar ou armazenado a -80 ° C até à sua utilização. Antes da análise por HPLC, as amostras foram novamente seca sob vácuo, suspenso em 0,5 ml de HPLC de H

2O que continha duas unidades de fosfatase ácida (0,26 mU /uL, Sigma Aldrich) e foram incubadas durante 30 min a 37 ° C, para gerar desoxinucleótidos. 30 ul da amostra foram injectados num sistema de HPLC Acquity UPLC (Waters, EUA) que corre Thermo coluna C18 de 100 x 2,1 milímetros, seguido de partícula 5 um quadrupolo espectrómetro de massa em tandem (Applied Biosystems TRIPLO QUAD 5500). Analyst 1.5.2.A programa de gradiente passo foi aplicado para separar todos os analitos com uma taxa de fluxo de 300 ml /min. A fase móvel consistia em metanol (componente A) e /l de tampão de acetato de amónia 20 mmol, a pH 4,5 (componente B). Após a separação, os analitos na eferente HPLC foram introduzida no espectrómetro de massa, através de uma interface TurboIonspray juntamente com uma corrente de azoto aquecida turbo para evaporar o solvente e para aumentar a eficiência de ionização. Os seguintes transições de massa foram monitorados-DA: 252,2 /234,1; dA1:252.2 /96,0; dG: 268,1 /232,1; dG1:268.1 /184.1; dG2:268.1 /124.1. A e A1 são derivados de dATP e G, G1 e G2 são derivados de dGTP.

Resultados

Identificação de Itu como um Activator p53

Para procurar p53 ativadores, que testados por análise de western blot de um painel de inibidores de quinase e um painel de inibidores de fosfatase para procurar compostos conhecidos que podem sobre-regular a p53 nos níveis de proteína (para a lista dos inibidores, ver Tabela S1) [17]. MEFs primários foram utilizados para o rastreio por linhas de células têm, normalmente, as mutações em p53 e /ou os seus reguladores a montante. Estes inibidores foram aplicadas a 10 uM, a concentração recomendada pelo fabricante para a inibição de quinases ou fosfatases. Dois compostos de entre os 113 inibidores foram capazes de induzir a expressão da proteína p53 nos níveis de proteína. Uma é 5-Iodotubercidin (Fig. 1A), um composto que é utilizado como um inibidor de adenosina-quinase e de outras quinases tais como Erk2. Itu tem sido demonstrado ter actividade anti-convulsiva, bem [19]. p53 induzida pela ITU-regulação foi observada em ambas as MEFs e HCT116, com o último sendo uma linha celular de cancro do cólon positiva para a p53 (Fig. 1B e 1C). experiências de dosagem indicado que Itu foi capaz de sobre-regular a p53 em concentrações tão baixas como 0,25 uM (Fig. 1B e 1C).

. As estruturas de Itu, adenosina e fludarabina. B. mancha ocidental mostra que a UIT-se regula-p53 em MEFs de uma forma dependente da dose. As células foram tratadas com várias concentrações de Itu durante 8 horas e os níveis de p53 foram analisados ​​por Western blot. C. mancha ocidental mostra que a UIT-se regula-p53 em células HCT116 de uma forma dependente da dose. As células foram tratadas com várias concentrações de Itu durante 8 horas e os níveis de p53 foram analisados ​​por Western blot. Um filme de longa exposta também foi mostrado para indicar que o p53 foi expressa em células HCT116 ao nível basal. D. Knock-down de ADK não ativar p53. Painel esquerdo: a redução do ARNm de ADK na presença de ADK siARN; Painel direito:. os níveis de proteína de p53 na presença de controle e ADK siRNA em células HCT116

Como o Itu induzir a p53-regulação? expressão da p53 é sobre-regulada por vários stress e ativação de oncogenes, estresse, especialmente genotóxico [25]. Desde Itu é um inibidor de ADK amplamente utilizado, que desempenha um papel crítico na homeostase da adenosina [26], [27], é possível que a adenosina Itu perturba a homeostasia, interfere com a síntese de ADN e provoca danos no ADN e, assim, da p53 activa. Se isso for verdade, derrubando ADK imitaria inibição ADK com Itu em up-regulação p53. Utilizou-se ARNsi reunidas para derrubar ADK nas células HCT116 (Fig. 1D, painel da esquerda), e verificaram que o decréscimo dos níveis de ADK, ao contrário de inibição de ADK com a ITU, não alterou significativamente os níveis de proteína de p53 no nível basal ( Fig. 1D, painel da direita), sugerindo que a p53-induzida Itu-regulação não é provavelmente causada por inibição direta da ADK.

Itu causa danos ao DNA

Itu tem uma estrutura purina-like com “NH” ser substituído por “CI” no 7

th posição do nucleósido de purina (Fig. 1A). Itu pode ser incorporado no ADN depois de ter sido convertido para desoxirribose pelo ribonucleótido-redutase [4]. Itu, teoricamente, poderia formar 2 ligações de hidrogênio com timidina em DNA de cadeia dupla (Fig. S1). No entanto, ITU-T emparelhamento pode causar um problema de espaçamento como “C-I” de Itu (posição 7) é muito maior do que “N-H” de adenosina, e o anel de purina alterada pode não ser reconhecível por ADN-polimerases. Além disso, “C-I” de Itu é bastante ativa e instável. Itu é, portanto, susceptível de ser metabolizado e subsequentemente incorporada no ADN a causar danos no ADN. Para confirmar isso, primeiro testamos se Itu poderia alterar os cariótipos de células HCT116. As células foram primeiro tratados com a ITU durante 36 horas e, em seguida, com colchicina veneno do fuso para condensar os cromossomas. O número e aparência dos cromossomos foram analisadas em microscópio óptico após coloração gimsa. É evidente que o tratamento Itu conduziu ao aparecimento de cromossomas quebrados em 32% das células tratadas com Itu em comparação com 0% de células não tratadas (Fig. 2A), sugerindo que a UIT poderia causar quebras de ADN de cadeia dupla.

UMA. imagens representativas dos cariótipos de HCT116 na ausência ou na presença de UIT. B. Detecção de derivado Itu no ADN genómico de células em replicação. A análise por HPLC-MS de metabolitos Itu no ADN genómico de células tratadas com Itu. O ADN genómico foi isolado a partir de células tratadas com Itu e digerido em nucleósidos, que foram analisados ​​por HPLC (painel da esquerda), que foi directamente ligado ao espectrómetro de massa. A análise MS da molécula com o tamanho de DTU foi mostrado no painel da direita. C. Os intracelulares piscinas dATP e dGTP não foram afetados pelo tratamento Itu. A e A1 são derivados de dATP e G, G1 e G2 são derivados de dGTP.

Alguns dos fármacos quimioterapêuticos trabalhar por intercalantes de ADN (por exemplo, doxorrubicina) ou ADN de reticulação (por exemplo, cisplatina), enquanto que os análogos de nucleósidos geram quebras de ADN por ser incorporada no ADN e perturbando o emparelhamento de nucleótidos. Para testar se Itu pode ser metabolizados e incorporados no ADN durante a replicação genómica, analisou-se directamente os nucleótidos derivados a partir de ADN genómico isolado a partir de células tratadas com Itu que eram ou na fase estacionária, ou a fase logarítmica, com o espectrómetro de massa de HPLC-. A identidade dos nucleosídeos foi confirmada pela comparação com a substância de referência correspondente. Itu (MW 392,153) pode ser metabolizado em desoxi-iodotubercidin (DiTu, MW 376,154), tubercidina (TU (com o -I instável removido), MW 266,257), e desoxi-tubercidina (DTU, MW 250,257). Em primeiro lugar, em relação aos derivados de nucleótidos do ADN genómico de HCT116 e MEFs e descobriram que HCT116 mostrou um espectro muito mais complicada de nucleotídeos e seus derivados do que os de MEFs, sugerindo que o metabolismo de nucleótidos pode ser alterado nas células cancerosas. Decidimos então usar MEFs para testar se derivados de Itu está incorporado no ADN. Descobrimos que DTU estava presente no ADN genómico de células em fase log-tratados Itu mas não em células estacionárias ou células não tratadas (Fig. 2B). Estes resultados sugerem que é metabolizado Itu (removidas com -I) e incorporado no ADN.

Vários estudos têm demonstrado que os análogos de purina tais como fludarabina e clofarabina poderia inibir a ribonucleótido-redutase, uma enzima que catalisa a conversão de ribonucleótidos a desoxirribonucleótidos, diminuindo assim os níveis de dNTP celular e interferir com a síntese do ADN [4]. Nós descobrimos que o tratamento com a ITU em doses suficientes para regular positivamente p53 mostrou qualquer efeito sobre os níveis de mRNA de ribonucleótido-redutase. Também comparamos as piscinas de dATP e dGTP, que são produtos de ribonucleótido-redutase, no controle e células tratadas com Itu com espectrometria de massa na sequência de um protocolo estabelecido, e descobriram que o tratamento Itu não afetou as piscinas de dATP ou dGTP nas células ( A Fig. 2C). Estes achados sugerem que Itu não inibe a ribonucleótido-redutase.

Para validar esta conclusão, nós tratados HCT116 e MEFs com Itu durante 8 horas e analisou a formação de DNA focos nuclear induzida por danos, que são postuladas como danos no DNA e centros de reparação [28], [29]. Entre as primeiras proteínas montados nas quebras de DNA são γH2AX, uma variante histona H2A que é expressa ubiquamente. Ele pode ser fosforilada por membros pikk, tais como ATM e Atr rapidamente após danos no ADN [30]. O hotel disse que o tratamento Itu resultou em um acúmulo de focos nuclear positiva para γH2AX tanto em HCT116 (10,39 ± 1,82% para células não tratadas vs. 90,19 ± 2,21% para células tratadas Itu) e MEFs (7,45 ± 0,29% para células não tratadas vs. 91,63 ± 0,73% para células tratadas UIT) (Fig. 3A e 3B). Além disso, o tratamento Itu também resultou numa acumulação de focos nuclear positiva para TopBP1, outra proteína localizada-focos, em HCT116 (14,25 ± 5,12% vs células não tratadas para 95,24 ± 1,39% para células tratadas UIT) e MEFs (13,08 ± 5,15% para células não tratadas vs. 93,32 ± 2,70% para células tratadas Itu) (Fig. 3A e 3B).

a. Tratamento de HCT116 com 1 M de Itu durante 8 horas induzidas focos nuclear positiva para γH2AX, TopBP1, e ATM activado. O tratamento com cafeína diminuiu a formação desses focos. As células HCT116 foram pré-tratados com cafeína (5 mM) durante 1 h e, em seguida, Itu foi adicionado às culturas por mais 8 horas. As células foram fixadas e coradas a para γH2AX, TopBP1, ou p-ATM. B. Tratamento de MEFs com 1 M de Itu durante 8 horas induzida focos nuclear positiva para γH2AX, TopBP1, e ativado ATM.

Itu Ativa Atm

Além de focos positivo para γH2AX e TopBP1, o tratamento Itu também resultou em focos nuclear positivo para p-ATM (10,13 ± 2,88% para células não tratadas vs. 85,84 ± 4,63% para células tratadas Itu) (S1981 fosforilação, uma indicação de activação ATM) (Fig. 3A e 3B) [31], indicando que Itu provoca danos no DNA e activa ATM. Consistente com esta observação, induzida Itu p-ATM e γH2AX focos formação em células HCT116 poderia ser diminuída (para baixo para 15,37 ± 1,15% e 9,00 ± 1,19%, respectivamente), por tratamento com cafeína, um inibidor da ATM e Atr (Fig. 3A ). Para fundamentar a constatação de que Itu ativa ATM, foi utilizado western blot para analisar a fosforilação Atm S1981, bem como ATM mediada por fosforilação Chk2. Embora ATM é pensado para ser apenas activado por quebras de ADN de cadeia dupla [7], [31], [32], estudos recentes demonstraram que os análogos de nucleósido podem também activar Atm, bem como as suas vias a jusante [30], [33], [ ,,,0],34]. Atm é encontrado para ser localizada nas forquilhas de replicação paralisadas e pode ajudar a evitar o colapso da forquilha nas células [30], [33]. Nós descobrimos que o tratamento Itu levou a uma fosforilação dependente do tempo em S1981 da ATM, bem como a fosforilação em Thr68 Chk2 em células HCT116 (Fig. 4A). tratamento Itu também conduziu à fosforilação de p53 em Ser15 (Fig. 4A), que é levada a cabo por PIKKs bem. Da mesma forma, Itu poderia estimular a fosforilação p53 e fosforilação Chk2 em MEFs (Fig. 4B). Estes resultados suportam ainda mais a conclusão de que Itu causa danos ao DNA e ativa ATM.

A. As células HCT116 foram tratadas com 1 uM ITU para diferentes períodos de tempo e de activação da ATM, Chk2, e p53 foi avaliado com western blot utilizando anticorpos fosfo-específicos. células B. MEFs foram tratadas com 1 mM Itu por diferentes períodos de tempo e ativação de ATM, Chk2 e p53 foi avaliada com western blot usando fosfo-anticorpos específicos.

Itu Led S fase de extensão e G2 /M de detenção num dependente de p53 Modo

Muitos análogos de nucleósidos causar a paragem do ciclo celular na fase S com excepções, tais como 20-C-ciano-20-desoxi-1-β-D-arabino pentofuranosylcytosine (CNDAC), que provoca a paragem do ciclo celular na fase G2 [4], [35]. Incorporação de análogos de nucleosídeos termina o alongamento da cadeia de DNA nascente e leva a adiamento de garfos de replicação. Para testar se Itu activa pontos de verificação do ciclo celular, que tratada p53 + /+ e p53 – células HCT116 com diferentes concentrações de Itu durante 24 ou 48 horas – /. Verificou-se que 24 h-tratamento com concentrações mais elevadas de Itu conduziu a um ligeiro aumento na percentagem de células em fase S, que foi acompanhado por uma diminuição na percentagem de células em fase G1, sem alterar significativamente a percentagem de fase G2 /M células (Fig. 5A e 5B). Quando as células foram tratadas com várias concentrações de Itu durante 48 horas, mais células estavam na fase G2, acompanhada por uma diminuição na fase G1, mas não houve alteração significativa na percentagem de células em fase S (Fig. 5C e 5D). Uma explicação é de que as células foram inicialmente preso na fase S, mas conseguiu passar pela fase S e, eventualmente, foram bloqueados na fase G2 /M. Assim Itu principalmente ativa o checkpoint G2. Isto está em contraste com a maior parte dos análogos de nucleósidos, que levam à paragem da fase S do ciclo celular [4], e a radiação ionizante (IR), que induz a paragem do ciclo celular em G1 e na fase G2 e é acompanhado por uma diminuição na fase S em As células HCT-116 [21]. Na ausência das proteínas p53, 24-hr-tratamento conduziu a um aumento inicial na fase S em doses mais elevadas de Itu (Fig. 5A e 5B), mas 48 horas após o tratamento, a diferença entre o controlo e as células tratadas tornaram-se mínima (Fig . 5C e 5D), indicando que p53 – /- células HCT116, mas não o p53 células + /+ HCT116, sofrem uma paragem de fase S e que p53 – /- células conseguiu escapar deste tipo de pontos. Além disso, p53 – /- células não mostram uma prisão fase G2 (Fig. 5A e 5B). Estes resultados indicam que a prisão fase G2 induzida Itu requer a presença de p53.

. HCT116 (p53 + /+ e p53 – /-) foram tratados com diferentes concentrações de Itu durante 24 horas. As células foram fixadas, coradas com PI, e analisados ​​com FACS. Percentagem de células em diferentes fases foi mostrado. B. representativos perfis do ciclo celular de p53 + /+ e p53 – /- HCT 116, na presença de 2,5 uM de Itu durante 24 horas. C. HCT116 (p53 + /+ e p53 – /-) foram tratados com diferentes concentrações de Itu durante 48 horas. As células foram fixadas, coradas com PI, e analisados ​​com FACS. Percentagem de células em diferentes fases foi mostrado. D. representativos perfis do ciclo celular de p53 + /+ e p53 – /- HCT116 na presença de 1,0 mM de Itu para 48 horas

Itu induz-p53 dependente e morte celular independente de

.

p53 tem um papel importante e pró-apoptótica que tenha sido bem estabelecido que os danos no ADN induz a morte celular, principalmente através da via da ATM-p53. Em seguida, testamos a citotoxicidade de Itu em HCT116 eo envolvimento de p53 induzida Itu-regulação. Itu tratamento conduziu a morte celular em p53 células + /+ HCT116 (EC50 = 1,88 | iM), ainda p53 – /- células HCT116 mostrou resistência à morte celular induzida pelo ITU (EC50 = 7,8 pM) (Fig. 6A), o que sugere um papel importante para p53 em mediar a morte celular induzida por Itu. Além disso, a deficiência de ATM, que é conhecido por diminuir a indução de p53, também inibiu a morte celular induzida por Itu em MEFs (Fig. 6B) [36], consistente com o papel bem aceite para ATM em promover a morte de células sob stress genotóxico. O resgate menos do que completa de morte celular pelo p53 sugere que a deficiência de Itu pode possuir citotoxicidade que é independente de p53, por exemplo, por inibição da pró-sobrevivência de sinalização tal como Erk2.

. células HCT116 (p53 + /+ e p53 – /-) foram tratados com várias concentrações de Itu durante 48 horas e o número de células foi medido pelo ensaio de WST-1. * P 0,05 quando p53 – /- em comparação com as células foram p53 + /+ células. B. Atm + /+ e ATM – /- MEFs foram tratados com várias concentrações de Itu durante 48 horas e o número de células foi medido pelo ensaio de WST-1. * P 0,05 quando ATM – /- em comparação com as células foram Atm células + /+. C. tipo selvagem e p53 – /- células HCT116 foram tratadas com Itu durante 24 horas e o número de células foi medido pelo ensaio de WST-1. Itu não induziu a morte celular quando as células foram cultivadas em soro ou 0,1% confluente em células HCT116 de tipo selvagem. * P 0,05 quando comparado com as células não tratadas

Muitos dos análogos de nucleósidos requerem a incorporação de ADN para executar o seu efeito citotóxico.. Para testar adicionalmente o efeito citotóxico sobre as células de Itu que não se dividem, se cultivadas HCT116 quer a fase estacionária ou na presença de soro a 0,1% durante 24 horas, com a maior parte das células estar em fase G1. Sob estas condições, a ITU falhou para matar as células (Fig. 6c), o que sugere que Itu necessita de ser incorporada no ADN, a fim de executar a sua actividade citotóxica. Isto é consistente com a nossa observação de que Itu metabolito está presente no ADN genómico de células (Fig. 2B) se replicar.

No entanto, ensaios de citometria de fluxo não revelou um aumento significativo nas células em fase sub-G1, uma indicação de células apoptóticas, após 24 ou 48 horas de Itu-tratamento com várias doses (Fig. 5B e 5D). Isto está em contraste com MGCD0103 inibidor IR ou HADC (histona desacetilases), o que levou a um aumento acentuado na fase sub-G1 em células HCT116 [21], [37]. Além disso, não há escadas de ADN foram observadas após o tratamento Itu (dados não mostrados).