Abstract
MUC16 (CA125) pertence a uma família de proteínas de alto peso molecular O-glicosilada conhecidos como mucinas. Enquanto MUC16 é bem conhecido como um biomarcador no cancro do ovário, o seu padrão de expressão no câncer de pâncreas (PC), a quarta principal causa de mortes relacionadas ao câncer nos Estados Unidos, permanece desconhecida. O objetivo do nosso estudo foi analisar a expressão de MUC16 durante a iniciação, progressão e metástase de PC para uma possível implicação no diagnóstico PC, prognóstico e terapia. Neste estudo, utilizou-se uma micromatriz contendo tecidos de pacientes saudáveis e PC para investigar a expressão diferencial de proteínas de MUC16 em PC. Os níveis de ARNm MUC16 foram também medidas por RT-PCR nos tecidos pancreático, pancreatite, e PC humanos normais. Para investigar o seu padrão de expressão durante a metástase PC, foram analisadas amostras de tecido de tumor pancreático primário e metástases (a partir do mesmo paciente) nos nódulos linfáticos, fígado, pulmão e omento de pacientes PC Fase IV. Para determinar a sua associação na iniciação de PC, a partir de tecidos de pacientes de PC contendo lesões pré-neoplásicas de diferentes graus foram coradas para MUC16. Finalmente, MUC16 expressão foi analisada em 18 linhas de células humanas de PC. MUC16 não é expressa nos ductos pancreáticos normais e é fortemente regulada positivamente em PC e detectado no tecido pancreatite. Ele é detectada pela primeira vez em lesões de alto grau de pré-neoplásicas anteriores adenocarcinoma invasivo, sugerindo que a sua regulação positiva ocorre tardiamente durante o início da doença. MUC16 expressão parece ser mais forte em lesões metastáticas, quando comparado com o tumor primário, o que sugere um papel na metástase PC. Também identificaram linhas celulares que expressam PC MUC16, que pode ser utilizado em estudos futuros para elucidar o seu papel funcional no PC. Ao todo, os nossos resultados revelam que a expressão MUC16 é significativamente aumentada no PC e pode desempenhar um papel potencial na progressão desta doença
Citation:. Haridas D, Chakraborty S, Ponnusamy MP, Lakshmanan I, Rachagani S, Cruz E, et al. (2011) Implicações Pathobiological de MUC16 Expressão em cancro do pâncreas. PLoS ONE 6 (10): e26839. doi: 10.1371 /journal.pone.0026839
editor: Rakesh K. Srivastava, The University of Kansas Medical Center, Estados Unidos da América
Recebido: 30 de julho de 2011; Aceito: 04 de outubro de 2011; Publicado: 31 Outubro 2011 |
Direitos de autor: © 2011 Haridas et al. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Licença Creative Commons Attribution, que permite uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o autor original ea fonte sejam creditados
Financiamento:. Este trabalho foi apoiado por bolsas de Institutos Nacionais de Saúde (SR1 CA78590, SR1 CA131944, UO1 EDRN CA111294 e P50 SPORE CA127297), Departamento de Defesa (BC101014), a Susan G. Komen Foundation (KG070826), Suporte Grant NCI Cancer Center 5 P30 CA036727-2452 e do Departamento de Saúde LB595 Institutional Grant para o cancro Nebraska e tabagismo Disease Research. Os financiadores não tiveram nenhum papel no desenho do estudo, coleta de dados e análise, decisão de publicar ou preparação do manuscrito
CONFLITO DE INTERESSES:.. Os autores declararam que não existem interesses conflitantes
Introdução
o câncer de pâncreas (PC) é uma neoplasia extremamente letal. De acordo com a American Cancer Society, o número estimado de novos casos e mortes por PC nos Estados Unidos em 2010 foram 43.140 e 36.800, respectivamente, com uma taxa de sobrevida de 5 anos de 6% [1]. Adenocarcinoma dos ductos pancreáticos é responsável por quase 95% de todos os tumores pancreáticos [2] e está associada com uma sobrevivência média de apenas 3-6 meses. Os pobres perspectivas de pacientes de PC é atribuído em grande parte à natureza clinicamente silenciosa deste tumor maligno que muitas vezes leva ao seu diagnóstico em um estágio avançado e, muitas vezes irressecável da doença.
Várias proteínas têm sido relatados a ser desregulada durante a iniciação e progressão de PC. Um desses família de proteínas cuja expressão é regulada de forma aberrante em PC é mucinas. Estes são de elevado peso molecular, proteínas altamente glicosiladas que servem várias funções em tecidos normais, incluindo a lubrificação e o aprisionamento de agentes patogénicos prejudiciais [3] – [7]. A sua expressão é aparentemente alterada em várias condições malignas, incluindo PC [8].
CA125 (MUC16) é uma glicoproteína da superfície celular que foi identificado pela primeira vez da fibra
et ai em 1981 [9]. MUC16 é clivado e derramado na corrente sanguínea e tem sido o foco de investigação activa como um biomarcador no soro para uma variedade de tipos de tumores [10]. É actualmente o único marcador tumoral soro utilizado rotineiramente em clínicas para o diagnóstico e prognóstico particularmente prevendo em pacientes com câncer ovariano [11]. CA125 é o anticorpo que reconhece melhor conhecido MUC16 tanto nos tecidos e nos fluidos corporais e é orientada para um epitopo localizado na região de repetição em tandem da proteína MUC16 [4], [12].
Estruturalmente a proteína MUC16 compreende de um domínio extracelular N-terminal consiste de mais de 22.000 resíduos de aminoácidos e acredita-se ser pesadamente glicosilada. O domínio central que contém até 60 sequências glicosiladas de péptido repetidas em tandem (uma característica da família mucina) seguido por um domínio C-terminal contendo um local de clivagem proteolítica potencial, um domínio transmembranar e uma curta cauda citoplasmática com vários locais potenciais de fosforilação [13], [14].
no presente estudo, analisamos a expressão de MUC16 em tecidos de PC e linhas celulares utilizando o anticorpo monoclonal CA125. Além disso foi analisada a expressão do seu mRNA em tecidos isolados a partir de pacientes de PC e pancreatite por RT-PCR. O objectivo geral do nosso estudo foi investigar se existe uma expressão diferencial de MUC16 durante a progressão e desenvolvimento de PC e examinar uma possível correlação entre a expressão MUC16 e características do tumor. Nosso estudo sugerem que MUC16 não é expressa nos ductos pancreáticos normais, mas regulada durante a progressão PC e desenvolvimento, o que sugere um papel potencial para MUC16 no PC patogênese e seu diagnóstico clínico.
Materiais e Métodos
Ética Declaração
Um consentimento informado foi obtido de todos os tecidos não-arquivo antes da coleta de tecido para todas as amostras obtidas através UNMC.
amostra de tecido e linhas celulares
Fifty PC -Oito e 8 amostras de tecidos normais do pâncreas (fixadas com formalina e embebido em parafina) foram obtidos a partir de Accumax (número da matriz A207IV). A matriz continha tecidos classificadas como não-neoplásicas (8 pontos), adenocarcinoma bem diferenciado (12 pontos), adenocarcinoma moderadamente diferenciado (22 pontos) e adenocarcinoma pouco diferenciado (24 pontos). Expressão de MUC16 foi analisado por RT-PCR a partir de 2 tecidos normais humanos pancreáticas, 6 pancreatite e 17 tecidos de câncer pancreático que foram obtidos após a aprovação do protocolo pelo IRB (IRB-491-97) na Universidade de Nebraska Medical Center, Omaha , NE. O mRNA foi convertido em cDNA utilizando iniciadores oligo dT. Os iniciadores utilizados para verificar se há MUC16 expressão são MUC16_F-5 ‘GTCCCCAACAGGCACCACACCG-3’ e MUC16_R-5’GGGCACTGTTGCTGGACGTTGTATT-3 ‘e o produto de PCR foi verificada sequência na instalação UNMC de sequenciamento de DNA.
Além disso, fixados em formalina e embebidos em parafina amostras (FFPE) de tecido PC de 34 pacientes de PC composto de pâncreas normal (7 pontos), PC primário (31 pontos) e metástase para o fígado (23 pontos), pulmões (11 pontos), linfonodo (17 pontos) e omento /diafragma (11 pontos), obtido a partir da Universidade de programa autópsia rápida do Nebraska Medical Center (IRB-091-01) também foram analisadas para investigar a mudança na expressão MUC16 durante PC metástase. No âmbito do programa de autópsia rápida a UNMC, tecidos de pacientes doadores são colhidas dentro de três horas após a sua morte e os espécimes flash congelados em nitrogênio líquido ou colocado em formalina para a fixação imediata. Tissue microarrays (TMAs) feitos a partir de blocos de parafina de tecidos a partir do programa de autópsias rápidas foram usadas para MUC16 imunocoloração. Além disso para os núcleos de tumores, cada bloco de amostras de controlo continha a partir dos não-neoplásica do cólon, rim e pâncreas tumorais adjacentes dos mesmos doadores. Os blocos de TMA foram cortados em 4 mm de seções e montadas em lâminas carregadas
Vinte e cinco amostras de tecido PC contendo lesões de diferentes graus (número de lesões pâncreas Intraepithelial Neoplasias (PanIN) identificou-PanIN I- 163;. PanIN II-197; PanIN III-26 e ductos-140 normais) adjacentes às áreas de PC também foram obtidos após a aprovação do protocolo pelo Institutional Review Board (IRB-491-97) na Universidade de Nebraska Medical Center, Omaha, NE. Quatro micron secções de parafina de espessura foram cortadas e coradas com hematoxilina e eosina para avaliação patológica. O grau de PanINs e expressão MUC16 em cada tipo de lesão PanIN foi avaliada pelo patologista cirúrgico (SML).
A expressão de mRNA e proteína MUC16 também foi analisada em um painel de linhas celulares PC (MiaPaCa, Panc89 , Dang, HPAC, SU86.86, Colo357, CD18 /HPAF, HUPT3, Capan1, Suit2, CD11, T3M4, FG, Aspc1, Panc1, HG625, Capan2 e BxPC3), utilizando os iniciadores mencionados anteriormente. As linhas celulares foram cultivadas a 37 ° C na presença de 5% de CO
2 em DMEM suplementado com 10% de soro fetal de vitelo e antibióticos (penicilina e estreptomicina 100 ug /ml). Todas as linhas celulares foram obtidas a partir de ATCC.
A imuno-histoquímica
As lâminas foram processadas para a imunocoloração, como descrito anteriormente [15], [16]. O anticorpo anti-MUC16 monoclonal de ratinho (clone M11, fabricado por Dako, Carpinteria, CA, EUA) foi utilizado como anticorpo primário. (Da: factor de 764 ug /ml de diluição 1:500)
Todas as lâminas coradas foram marcados por um patologista sob uma Nikon E400 Luz Microscópio e fotografias representativas tomadas. Intensidade de coloração para MUC16 (CA125) foi pontuada numa escala de 0-3 (3-imunorreactividade forte 0-negativa, 1-fraco, 2-moderada,). A percentagem de células positivas para MUC16 dentro de uma determinada lesão foi pontuada numa escala de 1-4 como se segue: 1: 0-25% de células positivas; 2: 26-50% positiva; 3: 51-75% positiva; e 4: 76-100% positivo. A pontuação da intensidade de coloração e a percentagem de células imunorreactivas foram então multiplicadas para obter uma pontuação composta variando de 0 a 12. Uma secção foi considerado “positivo” para MUC16 se a intensidade de MUC16 foi 1. Consequentemente tecidos também foram classificados como sendo “positivo” ou “negativo” para MUC16 expressão.
microscopia de imunofluorescência confocal
células PC foram processadas para microscopia confocal, como descrito anteriormente [17], [18] . Resumidamente, as células foram cultivadas a 37 ° C durante 48 h sobre lamelas de vidro estéreis, lavou-se com tampão de Hanks contendo HEPES a 0,1 M e fixadas em metanol arrefecido com gelo a 20 ° C durante 2 min. As células foram bloqueadas com soro de cabra a 10% em tampão fosfato salino (PBS) durante 30 min, seguido por incubação com anticorpo monoclonal anti-MUC16 (CA125) diluída em PBS (da CA125: 764 ug /ml; factor de diluição 1:500) para 1 h à temperatura ambiente. As células foram lavadas durante 10 min (× 4 vezes) com PBS e depois incubadas com o anticorpo secundário anti-ratinho de cabra conjugado com FITC durante 30 min. As células foram novamente lavadas (10 min x 4) e montadas em lâminas de vidro em anti-desbotamento meio de montagem Vectashield (Vector Laboratories, Burlingame, CA, EUA).
análise Western blot
de células PC linhas foram processados para a extracção de proteína e foi seguido por transferência de western por SDS-agarose, como previamente descrito [17], [18]. Os lisados de calor desnaturadas foram resolvidas num gel de SDS-agarose 2% por electroforese e subsequentemente transferidos para membranas de PVDF. Após a transferência, a membrana foi bloqueada com 5% de leite em pó magro em PBS durante 2 h, e incubadas com mAb anti-MUC16 (estoque: 764 ug /factor de diluição 1:1000 mL) ou anti-β-actina anticorpo monoclonal durante a noite a 4 ° C. As membranas foram lavadas com PBS contendo 0,1% Tween-20 e subsequentemente incubados com peroxidase de rábano anticorpos secundários anti-rato de cabra conjugado (diluído 1:2000 em 5% de leite em pó magro em PBS) (Amersham Biosciences Buckinghamshire, Reino Unido) durante 1 hora . O sinal foi detectado utilizando quimioluminescência aumentada (ECL, Amersham Biosciences, Buckinghamshire, Reino Unido).
Extração de RNA e RT-PCR
O ARN total foi isolado a partir de tecidos usando o
mir
Vana kit de isolamento de miARN (Ambion, Foster City, CA, EUA) e a partir de linhas de células usando o kit Qiagen RNeasy Mini (Qiagen, Valencia, CA, EUA) de acordo com o protocolo do fabricante. O ARNm isolado foi convertido em ADNc utilizando iniciadores oligo dT. O cDNA diluído 1:05 foi utilizado para determinar a expressão de ARNm de MUC16 utilizando PCR de acordo com o protocolo previamente descrito [19]. Os produtos foram corridos num gel de agarose a 1,5% contendo brometo de etidio (10 ug /ml). Os iniciadores utilizados para verificar se há expressão MUC16 são aqueles que foram mencionados anteriormente.
A análise estatística
As variáveis contínuas (pontuação egcomposite) foram comparadas pelo teste t bicaudal de Student assumindo desigual variância. As variáveis categóricas (estágio, grau de tumor, de órgãos de metástases à distância) foram comparadas pelo teste de Kruskal Wallis ANOVA ou o teste exato de Fisher. Um valor de p 0,05 foi considerado estatisticamente significativo. Toda a análise estatística foi feita usando Medcalc para 9.6.4.0 software versão do Windows (software MedCalc bvba, Mariakerke, Bélgica).
Resultados
MUC16 é diferencialmente sobre-expressos em tecidos de adenocarcinoma do pâncreas
Para identificar o padrão de expressão de MUC16 em PC patogénese, a sua expressão foi comparada entre condutas não-neoplásicas e adenocarcinoma pancreático utilizando uma micromatriz de tecido compreendendo pâncreas não neoplásicas (n = 8) e tecidos a partir de PC primário de variar os graus (N = 58 ). Uma amostra de tecido foi considerada como positiva se, pelo menos, 5% das células expressaram MUC16. MUC16 expressão não foi observada nas condutas não-neoplásicas (Figura 1A). No entanto, em 38/58 (65%) casos de PC, as condutas malignas foram positivas para MUC16. A expressão de MUC16 foi significativamente maior no PC, quando comparado com as condutas não-neoplásicas (p = 0,003 por teste exacto de Fisher bicaudal). Além disso, para determinar se há uma variação na expressão MUC16 com a progressão de PC, que comparou a sua expressão entre os tecidos de PC classificadas pela fase de tumor e grau. Houve um aumento progressivo na expressão de MUC16 com perda de diferenciação do tumor, com 50% do bem diferenciado (6/12), 59% de a moderadamente diferenciadas (13/22) e 66% dos tecidos PC pouco diferenciados (16/24) ser positivo (Figura 1A). Embora a expressão de MUC16 não foi significativamente diferente entre os três grupos, a pontuação composta média foi significativamente maior no PC moderada e pouco diferenciado em comparação com adenocarcinomas bem diferenciados (p = 0,02 e 0,001, respectivamente). No entanto, o escore composto não foi significativamente diferente entre os casos de PC moderados e pouco diferenciados. Isto sugere que MUC16 expressão aumenta significativamente com a perda de diferenciação de tecidos de PC.
O tecido obtido a partir de secções foram ACCUMAX sob a forma de uma matriz e foram coradas com anticorpo monoclonal anti-MUC16. As secções coradas foram observadas ao microscópio e a imunorreactividade foi julgado pela intensidade e espalhar da mancha escura. O anticorpo anti-MUC16 não revelaram nenhuma coloração no tecido de pâncreas normal (ambos os ductos e ácinos) enquanto uma coloração forte foi observada nos tecidos cancerosos. plot (A) Box representando a pontuação de MUC16 entre os vários tipos de PC. A partir do diagrama de caixa observou-se a imunorreactividade a ser maior no mal (D) e tecidos moderadamente diferenciadas (C) em comparação com (B) tecidos bem diferenciadas. O tecido de pâncreas normal (A) é também negativo. secções representativas demonstrando expressão MUC16 em ductos pancreáticos normais e vários graus de adenocarcinoma invasivo são mostrados. Note-se a coloração da membrana predominante de MUC16 em PC. (B) Estudos de expressão de MUC16 em condições normais, pancreatite e tecidos de cancro do pâncreas por RT-PCR. RT-PCR foi realizada em ARNm isolado a partir de tecido de pâncreas humano normal (N1, N2), a pancreatite tecido humano (Pt1-PT6) e tecido de cancro pancreático humano (PC1-PC17). Sem amplificação foi observada nos tecidos normais mas amplificação foi observada nos tecidos de cancro do pâncreas e pancreatite. Actina foi utilizado como um controlo interno.
A expressão diferencial de MUC16 em PC também foi examinada através da verificação da expressão de MUC16 ao nível da transcrição por isolamento de mRNA a partir de pâncreas humano normal, pancreatite e tecidos de PC. a expressão de ARNm MUC16 estava ausente em tecidos normais do pâncreas (0/2, 0%), mas estava presente em 12/17 (71%) do PC e 1/6 (16,7%) de pancreatite tecidos (Figura 1B). A maioria dos tecidos de PC foram classificados como moderados a PC pouco diferenciado (17/08). Houve um caso de PC bem diferenciadas, uma neoplasia de um pseudopapilar e cada um de adenocarcinoma mucinoso cística e tumor de células gigantes. 5/8 (62,5%) de a-moderada pouco diferenciado, 1/1 (100%) de bem diferenciada, 1/1 tumor de células gigantes e 1/1 de adenocarcinoma mucinoso cística expressa MUC16. Seis pacientes de PC também teve uma história de pancreatite crônica (CP). 5/6 (83%) desses tumores eram também positivas para MUC16. Em comparação, 7 pacientes de PC não têm qualquer história da CP. Destes casos, 5/7 (71,4%) foram positivos para MUC16. A expressão de MUC16 não foi significativamente diferente entre aqueles com ou sem história de CP (Tabela 1).
upregulation diferencial de MUC16 na displasia pancreático alto grau
Depois de ter observado que MUC16 é expresso de forma aberrante em adenocarcinoma ductal pancreático que próxima procurado para estudar a expressão de MUC16 durante o desenvolvimento do PC. Para isso, foi estudada a sua expressão em lesões pré-malignas conhecidas para preceder adenocarcinoma invasivo, denominado como neoplasia intra-epitelial pancreáticas (PanINs). lesões pancreáticas intraepiteliais são classificados como PanIN I, PanIN II e PanIN III que correspondem a displasia de baixo, intermediário e alto grau e são caracterizadas por alterações bem definidas histológicos incluindo atipia nuclear, apinhamento nuclear, originando pseudo e PanINs alto grau, cribriforming [20] . Observou-se que 20% dos PanIN-I (33/163), 28% de PanIN-II (55/197) e 42% de lesões PanIN-III (11/26) foram positivas para MUC16 expressão, mas a sua expressão não foi detectada nas condutas adjacentes normais (N = 140) como mostrado na Figura 2A. MUC16 expressão foi significativamente mais elevada em todas as três fases de displasia (p 0,00001) em comparação com as condutas normais. Mas MUC16 expressão foi significativamente mais elevada em displasia de alto grau (PanIN-III) em comparação com displasia de baixo grau (PanIN-I, p = 0,02). No entanto, não houve diferença significativa em MUC16 positividade entre PanIN-I e PanIN-II (Figura 2B). Tal como no carcinoma invasivo, MUC16 predominantemente localizada na membrana celular das células displásicas.
(A) MUC16 expressão foi avaliada em tecidos contendo ambos os pâncreas normal, e lesões displásicas adjacentes. Enquanto expressão MUC16 era fraco no de baixo grau, início de carreira lesões pancreáticas intraepiteliais (PanIN I), que aumenta progressivamente com o aumento displasia com a mais alta expressão observada na displasia de alto grau (PanIN III) e PC. Note-se a coloração predominante de MUC16 membrana em todos os tipos de PanINs (Ampliação original x 200). plot (B) Box representando a pontuação composta de MUC16 entre os diferentes graus de lesões pancreáticas intraepiteliais e condutas normais. A partir do gráfico de caixa observamos que MUC16 é fortemente expresso em PanIN II e III, quando comparado com PanIN I.
Comparação de expressão MUC16 entre
primário e metastático cancro pancreático
Várias proteínas são conhecido por ter uma expressão diferencial em cancro metastático vs primário [21], [22]. Para investigar se a expressão de MUC16 é alterada durante a metástase de PC para locais distantes, investigamos a sua expressão em adenocarcinomas e metástases pancreáticas correspondentes (obtido a partir do mesmo paciente) primários para os nódulos linfáticos, pulmões, fígado e omento /diafragma (obtido como parte do programa de autópsia rápida). MUC16 não era expresso em qualquer uma das condutas não-neoplásicas, enquanto que os tumores primários e metastáticos do mesmo paciente expressa MUC16 com quase a mesma intensidade. Os resultados estão resumidos na Figura 3A e 3B. Não houve diferença significativa na pontuação composta entre os locais primários e metastáticos (resumidas no gráfico de caixa). No entanto, os pacientes que manifestaram MUC16 em seu tumor primário também expressou MUC16 nos locais metastáticos. Isto sugere que os tumores pancreáticos manter MUC16 expressão durante a sua propagação, possivelmente, apontando para o papel de MUC16 na disseminação de células PC.
Para investigar a alteração na expressão MUC16 com a progressão, foi investigada a expressão de MUC16 no pâncreas primário combinado cancro e metástase, quer no pulmão, nódulo linfático, fígado ou o omento /diafragma. Em (A), enquanto a expressão de MUC16 foi maior no PC metastático do que no tumor primário, esta não foi significativa. A- pâncreas normal; câncer de pâncreas B-; metástase do fígado C-; D- Lung metástase; metástase E- Linfonodo; metástase F- Omento /diafragma. Além disso, (B) mostra que, no mesmo paciente, as condutas não neoplásicas eram negativos, enquanto que houve uma expressão forte de MUC16 no tumor pancreático principal e esta foi mantida mesmo na metástase.
expressão de MUC16 nas várias células cancerosas no pâncreas humanos
Tendo demonstrado que MUC16 foi diferencialmente expressos em tecidos de PC, investigamos ainda mais a sua expressão em linhas celulares PC. Expressão de MUC16 tanto no ARNm (tamanho do produto de PCR é 341 pb) e o nível de proteína foram observados em Colo357, T3M4, HPAF /CD18, Dang, HPAC, SU86.86, FG e células Capan-1 (Figura 4A e 4B). Todas as outras linhas celulares PC testadas foram negativas para a expressão MUC16. Para delinear a localização subcelular de MUC16, os estudos de imunofluorescência foram realizadas em Capan1 e HPAF /células CD18 (MUC16 que expressam) e SUIT2 e CD11 (MUC16 não expressam) células. A coloração foi observado em ambas as linhas de células positivas concordantes com a distribuição de MUC16 nos tecidos e não se observou coloração das linhas de células negativas (Figura 4C).
(A) análise de transferência de Western de expressão em PC MUC16 linhas de celular. Os lisados de proteína de dezoito linhas celulares de PC foram resolvidas num gel de SDS-agarose 2%. expressão MUC16 foi observada em Dang, HPAC, SU86.86, Colo357, CD18 /HPAF, Capan1 e linhas celulares T3M4. β-actina foi utilizado como um controlo interno (B) Análise de RT-PCR da expressão MUC16 em várias linhas de células PC. Actina foi utilizado como um controlo interno. (C) os estudos de imunofluorescência de duas linhas de células (CD18 e Capan1) que expressa MUC16 e duas linhas celulares (CD11 e SUIT2) que não expressam MUC16.
Discussão
PC é a quarta principal causa de mortes relacionadas ao câncer nos Estados Unidos com apenas cerca de 20% dos pacientes sobrevivem por 2 anos e apenas 6% por cinco anos. Sua incidência a taxa de mortalidade se manteve praticamente inalterada durante as últimas décadas, apesar de uma compreensão considerável de sua biologia [23], [24]. Esta elevada taxa de mortalidade entre os pacientes de PC é devido à tendência das células de cancro para metastizar precoce. Isto, juntamente com a fraca resposta à terapia e alta taxa de recorrência torna um dos cânceres mais letais conhecidos pelo homem [24]. PC é muitas vezes diagnosticada em um estágio avançado, principalmente devido à falta de marcadores de diagnóstico precoce de confiança [24]. Por conseguinte, existe uma necessidade urgente de identificar marcador específico de detecção precoce (s) e alvos moleculares adequados para combater PC. As mucinas são um dos principais biomarcadores que surgiram nos últimos anos, como marcadores de diagnóstico altamente específicos em várias doenças malignas incluindo pâncreas, ginecológica e neoplasias do trato aerodigestivo [25]. Além disso, a sua expressão aberrante tem sido demonstrada para modular o crescimento celular, diferenciação, a transformação, a adesão, invasão e vigilância imunitária [7].
CA125 /MUC16 é um biomarcador tumor que é actualmente utilizado para o seguimento de pacientes com câncer de ovário [26]. No entanto, seu papel no PC patogênese permanece inexplorado. No presente estudo, examinamos o padrão de expressão de MUC16 em tecidos de PC e comparou-o com os do pâncreas normal. Além disso, estudamos também a sua associação com o desenvolvimento de PC e com o estágio do tumor, grau e metástase. Curiosamente, os nossos resultados mostraram que o pâncreas normal não expressar MUC16, mas a sua expressão é regulada positivamente de forma significativa em 12/17 e 06/01 PC tecido pancreatite. Foi previamente demonstrado que existe uma associação entre o carcinoma do pâncreas e pancreatite crónica (esporádica e familiar) e a relação de incidente padronizado de desenvolvimento de PC em pacientes com pancreatite crónica é 14-18 [27]. Esta observação de MUC16 sendo significativamente regulada positivamente em PC é coerente com a expressão de outros ligados à membrana mucinas MUC4 e MUC-1 que também são expressas de forma aberrante em PC e foram identificados como potenciais marcadores de diagnóstico para este malignidade [24], [28] – [31 ] também foi observado que a expressão MUC16 aumentou progressivamente com perda de diferenciação do tumor PC. Foi previamente observado que os pacientes de PC que tenham sido diagnosticados com metástase distante tinha a tendência para ter o adenocarcinoma do pâncreas pouco diferenciada [32], [33]. Assim, nossos resultados sugerem que MUC16 pode ter um papel importante a desempenhar na progressão e metástase de PC.
De acordo com o modelo de progressão bem conhecido para PC, carcinoma ductal desenvolve a partir de ductos não-neoplásicos através de uma série de lesões pré-malignas denominado como PanINs [33]. Observou-se que a expressão MUC16 aumenta progressivamente de PanIN I PanIN III. Particularmente, a percentagem de MUC16 positividade em lesões de alto grau pancreáticas intraepiteliais foi significativamente mais elevada do que a de PanINs de baixo grau. Isto sugere que a expressão MUC16 é alterada na fase de displasia do pâncreas e pode desempenhar um papel fundamental na progressão da PC. MUC4, outra membrana mucina ligada foi anteriormente mostrado para ser diferencialmente regulada positivamente com o aumento progressivo da displasia, sugerindo a possibilidade de que pode haver certas vias de regulação comuns que modulam a expressão de ambas as mucinas durante o desenvolvimento PC [28], [34], [ ,,,0],35]
a alta taxa de mortalidade em pacientes PC é devido à ocorrência frequente de metástases à distância. Em uma análise de 4.012 autópsias realizadas em pacientes PC entre 1914 e 1943, foi relatado que o local mais comum de metástases à distância foi o fígado, seguida do peritônio, pulmão e pleura, ossos e glândulas supra-renais [33], [36] . Mas PC não está limitado a estes órgãos. Mesmo pequenas PC ( 2 cm de diâmetro) metástase exposição, apoiando a premissa de que a PC é um tumor maligno que metastiza muito cedo durante a sua progressão [33], [37] Entre as várias moléculas observadas para desempenhar um papel na metástase de PC células, mucinas têm emergido como um dos principais determinantes. Temos anteriormente demonstrado que MUC4, outro transmembrana mucina quando expressa promove metástase e invasão em células PC [18], [38], [39]. No presente estudo, observamos que esses PCs primários que expressam MUC16 também expressam MUC16 com quase igual intensidade nos locais metastáticos. Isto sugere que as células PC podem manter a sua expressão de MUC16 durante o processo metastático. MUC16 foi previamente demonstrado ser importante na metástase de tumores sólidos para o sistema nervoso central através da sua interacção com mesotelina, uma proteína expressa diferencialmente em células mesoteliais normais, mesoteliomas e algumas outras neoplasias mesenquimais [40], [41]. Por isso, é possível que possa interagir com MUC16 mesotelina e facilita a metástase em PC.
Os mecanismos moleculares de condução metástases em PC requer uma melhor compreensão das proteínas que modulam a transição epitelial-mesenquimal (EMT) e o processo inverso (Met ), que são necessárias para o desprendimento e re-ligação das células tumorais no sítio de metástases, respectivamente. Os resultados do nosso estudo sugerem que MUC16 pode ter um papel para o desenvolvimento e progressão de PC e estudar o seu papel específico na progressão da PC será a base do nosso próximo estudo. A sua regulação positiva, que foi particularmente forte durante os últimos estágios da PC displasia, sugere que os mecanismos que ligam a sua expressão está possivelmente ligado tarde durante o desenvolvimento do PC. Estudos sobre MUC4 mucina revelaram que a sua expressão é silenciada em condutas normais em virtude da hipermetilação do promotor [42], [43]. Se as alterações epigenéticas semelhantes também regular a expressão MUC16 continua a ser examinadas em estudos futuros. A detecção de MUC16 em PanINs de alto grau (considerados os verdadeiros lesões displásicas com um risco elevado para o câncer invasivo) sugere seu uso potencial na detecção precoce de lesões potencialmente malignas no pâncreas. MUC16 também é derramado no sangue (conhecido como CA125), tornando-se uma molécula atraente para a investigação como um potencial biomarcador secretado para PC [44].
Além disso para identificar um adequado
in vitro
modelo para investigar o papel funcional de MUC16, um painel de linhas de células PC foi pesquisada quanto a expressão MUC16, tanto a nível de ARNm e de proteína. Na realização de análise de Western Blot, observou-se que a expressão de ambos os MUC16 apareceu como uma banda única ou como uma banda entremeada. Foi previamente mostrado que, quando as mucinas são tratadas com 2-mercaptoetanol e analisados em um gel de SDS-PAGE, uma banda entremeadas é obtido como as mucinas foram reduzidas a partir da sua estrutura oligomérica a sua forma monomérica. Esta forma monomérica permite mucinas migrar mais rapidamente no gel e os oligómeros intactas permaneçam no poço [45]. Isso explica, assim, o padrão de expressão diferencial de MUC16 obtido através das várias linhas de células PC selecionados. Além disso, observamos também que as linhas celulares expressando MUC16, como Capan 1 (fígado preenchidas), Colo 357 (linfonodo atingida) e T3M4 (linfonodo atingida) foram derivadas de metástases, enquanto o MUC16 não expressar linhas celulares tais como Panc1 , AsPC1 e BxPC3 foram isolados a partir do local do tumor primário (pâncreas). Além disso, a partir dos estudos de RT-PCR foi observado que os níveis de mRNA de algumas linhas celulares PC não corroboraram com os seus níveis de proteína correspondentes. Especulamos que MUC16 ARNm passa por pós-processamento de transcrição em certas linhas celulares.