Abstract
As proteínas do motor mitóticas Cinesina-5 ligações cruzadas e deslize fuso além antiparallel microtúbulos, realizando, assim, funções essenciais na dinâmica do fuso mitótico. inibição específica da sua função por pequenas moléculas monastrol-like foi examinado em ensaios clínicos como um tratamento anticâncer, com sucesso apenas parcial. Deste modo, as estratégias que melhoram a eficiência de drogas anti-cancro monastrol-like são necessários. No presente estudo, nós examinamos a ligação entre a sensibilidade à monastrol e ocorrência de deslizamento mitótico em várias linhagens de células humanas. Descobrimos que o posto de sensibilidade à monastrol, do mais sensível ao menos sensível, é: AGS HepG2 Lovo Du145≥HT29. Mostramos correlação entre a sensibilidade de uma determinada linha celular para monastrol e a tendência da mesma linha celular de sofrer resvalamento mitótico. Nós também descobrimos que nas células HT29 resistentes monastrol, tratamentos prolongados monastrol aumentar os níveis de mRNA e proteína do survivin proteína passageiros cromossômica. Em contraste, os níveis de survivina, não são aumentados por este tratamento nas células sensíveis AGS-monastrol. Mostramos ainda que a sobre-expressão de survivina nas células sensíveis AGS-monastrol reduz o deslizamento mitótico e aumenta a resistência à monastrol. Finalmente, mostramos que, durante curta exposição à monastrol, Si RNA silenciamento da expressão survivin reduz a viabilidade celular em ambos os AGS e células HT29. Os nossos dados sugerem que a eficiência do tratamento anti-cancro com inibidores específicos de cinesina-5 pode ser melhorada através da modulação dos níveis de expressão de survivina
citação:. Asraf H, Avunie-Masala R, Hershfinkel H, Gheber G ( 2015) mitótico derrapagem e expressão de Survivin estão ligados a sensibilidade diferencial do câncer humano linhas celulares à cinesina-5 Inhibitor monastrol. PLoS ONE 10 (6): e0129255. doi: 10.1371 /journal.pone.0129255
Editor do Academic: Qiliang Cai, Universidade Fudan, CHINA
Recebido: 16 de maio de 2014; Aceito: 06 de maio de 2015; Publicação: 02 de junho de 2015
Direitos de autor: © 2015 Asraf et al. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Licença Creative Commons Attribution, que permite uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o autor original ea fonte sejam creditados
Disponibilidade de dados: Todos os dados relevantes estão dentro do papel
Financiamento:. Este trabalho foi financiado em parte pelo Fundo de inicialização, Faculdade de Ciências da Saúde, Universidade Ben-Gurion do Negev, concedido a MH e LG; pelo israelense Science Foundation subvenção 165/2013 DONO a LG (https://www.isf.org.il/english/) eo Science Foundation israelense conceder nenhuma. 891/2014 concedido a MH (https://www.isf.org.il/english/). Os financiadores não tiveram nenhum papel no desenho do estudo, coleta de dados e análise, decisão de publicar ou preparação do manuscrito
CONFLITO DE INTERESSES:.. Os autores declararam que não existem interesses conflitantes
Introdução
As proteínas Cinesina-5 motores de mitose (BIMC /Kif11 /Eg5 /N-2) executar funções conservadas na dinâmica do fuso mitótico. Descoberto no início de 1990, estes foram os primeiros kinesins para quais funções mitóticas foram demonstradas em vários organismos [1-5]. Cinesina-5 motores funcionam como homotetrâmeros com dois pares de domínios catalíticos automóveis localizados em lados opostos de um complexo tetramérico haltere semelhante [6, 7]. Por esta estrutura bipolar, cinesina-5 motores podem reticular e deslize os microtúbulos do fuso além antiparallel [8-11], realizando assim as suas funções na montagem do fuso [1-5] e anaphase eixo de alongamento [12-19].
A-5 humana cinesina HsEg5 é sobre-expresso numa variedade de tumores sólidos, o que sugere o seu papel na tumorigénese [20, 21]. Por causa das funções mitóticas essenciais do kinesin-5 motores na dinâmica do fuso, e porque a mitose é uma fase do ciclo celular aceites para intervenção anti-câncer [22, 23], foi, em geral, acredita-se que a inibição específica de cinesina-5 motores poderia servir como um potencial tratamento anti-cancro. Monastrol foi o primeiro relato inibidor específico da cinesina-5 humano, identificada num rastreio para pequenas moléculas que provocaram a paragem da mitose sem afectar dinâmica dos microtúbulos e outras funções celulares [24]. Desde a descoberta de monastrol, várias dezenas de moléculas foram relatados como inibidores alosticos de HsEg5, com potências variáveis [23, 25]. A maioria destas moléculas são específicos para o HsEg5 humano, porque eles se ligam a um sítio alostérico, circuito 5 no domínio catalítico de motores relacionada com a cinesina (revisto em [23, 26, 27]), a qual varia em comprimento e a sequência entre o homólogos cinesina [28, 29]. As células humanas tratadas com monastrol e monastrol-like moléculas de prisão na mitose, com fusos danificados monopolar [24, 30] e sofrem morte celular mitótico [31]. Em alguns casos monastrol células tratadas são encontrados numa fase G1 do tipo devido a resvalamento mitótico [32]. O último fenômeno permite que as células para avançar para a próxima fase G1 sem dividir seu DNA na presença de danos fuso (revisto em [33, 34]). Seguindo o deslizamento mitótico, as células podem morrer de apoptose causada por um posto de controle específica que monitoriza o conteúdo de ADN de células que saída da mitose, conhecido como o “ponto de verificação tetraploidia” [33, 35].
Vários inibidores específicos HsEg5 entraram ensaios clínicos como agentes anti-cancerígenos [36-38]. Apesar de o efeito citotóxico reprodutível em culturas de tecidos, estes ensaios clínicos revelaram um sucesso limitado (revisto em [27, 39]). Uma das razões propostas para esta ineficiência é o conhecimento incompleto das vias de paragem da mitose e, como resultado, a incapacidade para identificar os componentes moleculares que podem ser alvo para além da cinesina-5 inibidores de melhorar a sua eficiência no tratamento antineoplásico [27, 39] .
para abordar esta questão, no presente estudo, examinamos a sensibilidade para monastrol e ocorrência de deslizamento mitótico em várias linhagens de células humanas. Verificou-se que existe uma correlação entre a sensibilidade de uma determinada linha celular para monastrol e a tendência da mesma linha celular de sofrer resvalamento mitótico. Examinámos ainda mais a expressão de survivina, uma proteína de passageiros cromossómico anti-apoptótica que se demonstrou que tem várias funções mitóticas (revisto em [40-43]). Nós descobrimos que o tratamento com monastrol induz um aumento na expressão de survivina em células monastrol-resistentes, mas não em células que são sensíveis à monastrol. Consistentemente, que mostram que a sobre-expressão de survivina nas células sensíveis à monastrol reduzida deslizamento mitótico e aumentou monastrol-resistência. Finalmente, mostramos que o silenciamento parcial da expressão survivin por Si RNA reduz a viabilidade celular após curta exposição à monastrol. Assim, os nossos dados sugerem que a inibição combinada da HsEg5 e modulação da expressão de survivina pode melhorar a potência do tratamento anti-cancro por inibidores da cinesina-5.
Materiais e Métodos
cultura celular, viabilidade, transfecção, e tratamento monastrol
AGS e células LoVo foram cultivadas em DMEM /F-12 (HAM) 1: 1, as células HT29 em DMEM, células DU145 em RPMI 1640 suplementado com 1% de piruvato de sódio, e células HepG2 em MEM meio de -EAGLE Earle. Todos os meios foram suplementados com soro fetal de vitelo a 10%, 2 mM de L-glutamina, e solução de antibiótico-antimicótico a 1% contendo 10 unidades de penicilina /L, 10 mg /mL de estreptomicina, e 1250 unidades /ml de nistatina. reagentes de mídia foram adquiridos de Beit Haemek, Israel. A viabilidade celular foi examinada utilizando de sódio 2,3-Bis- (2-metoxi-4-nitro-5-sulfofenil) -2H-tetrazólio, sal-5-carboxanilida (XTT, Sigma, Israel), seguindo um procedimento padrão [44] ou por ensaio azul Trypan [30]. Para as experiências de viabilidade, até 3 dias, usando o ensaio de XTT, 4×10 ~
3 células foram plaqueadas por cavidade em placas de 96 poços. Número de células na presença de monastrol foi normalizada para o número de células na presença de apenas DMSO. Para experiências utilizando 12 e 24 horas de tratamento monastrol, 1,5×10 ~
5 células por poço foram plaqueadas em placas de 24 poços. O tratamento com monastrol foi realizado 24h chapeamento seguinte, altura em que 70-80% de confluência foi alcançado. Os plasmídeos que expressam survivina GFP e GFP vector apenas foram uma oferta do Dr. Dario C. Altieri [45]. transfecção de células foi feita utilizando o reagente de transfecção JetPEI (Polyplus transfecção, Tal Ron, Israel). Transfecção estável foi alcançado por células em crescimento em meio contendo G418 3 mg /ml (Sigma, Israel) durante várias semanas até que 80% das células continha GFP sinal de fluorescência. Monastrol (Tocris, Reino Unido), as concentrações são indicadas para cada experimento. Para comparação entre AGS-sensível monastrol e células HT29 monastrol-resistentes, diferentes concentrações de monastrol foram usadas para alcançar fenótipos comparáveis: 100 um e 150 um de monastrol para células AGS e HT29, respectivamente. Com base na figura 1, de baixa concentração de monastrol teria resultado na ausência de efeito sobre as células HT29, durante a elevada concentração de monastrol teria resultou na morte das células AGS, qualquer um dos casos não permitindo a análise do fenótipo. As experiências de controlo foram realizadas na presença de DMSO.
Células de AGS, HepG2, Lovo39, DU145, e linhas de células HT29, indicada no canto inferior esquerdo de cada painel, foram incubadas durante até três dias com várias concentrações de monastrol, indicada no lado direito (0, 20, 50, 100, e 150 um). O número de células viáveis (% do controlo) foi determinada por ensaio de XTT para a actividade mitocondrial. Pontos e barras representam a média e SEM de 3-4 experiências independentes. * P 0,05: o número de células viáveis a seguir ao tratamento DU145 dois dias com 20 ou 50 uM monastrol, em comparação com as células HT29 viáveis identicamente tratados (círculos vermelho e azul). Os resultados indicam que as diferentes linhas de células são de forma diferente sensível a monastrol, com ranking da sensibilidade: AGS HepG2 Lovo Du145≥HT29
imunocoloração
Para visualizar o citoesqueleto de microtúbulos. e o ADN, as células foram cultivadas em lamelas, fixadas com 4% de paraformaldeído durante 30 min, e permeabilizadas durante 2 min com 0,3% de Triton-X-100 em 4% de paraformaldeído. As amostras foram lavadas com PBS contendo 0,1% de BSA (Sigma, Israel). As lamelas foram incubadas com rato YOL1 /34 anti-tubulina e, em seguida, com Alexa 488 de anticorpo secundário anti-rato conjugado. O ADN foi corado por DAPI (0,07 ug /ml). As células foram observadas com um microscópio Olympus BX51.
análise do ciclo celular
de flutuação e as células aderentes foram fixadas com etanol a 70% e armazenados em -20 ° C durante pelo menos 7 dias. As células foram recolhidas por centrifugação e ressuspensas em 0,1% de Triton-X-100 e 30 ug /ml de RNase A tipo I-A (Sigma, Israel) à temperatura ambiente durante 40 min. ADN nuclear foi corado com iodeto de propídio 15 ug em PBS e conteúdo solução de ADN foi medida por citometria de fluxo (BD Biosciences, Reino Unido). proporções de células em sub-G0 /G1, G0 /G1, S e G2 /M fases foram analisados usando o software apropriado. Para cada amostra, 10.000 células foram pontuadas.
análise de ARNm
Os níveis de ciclina B, survivina, e actina como um gene de referência foram determinados por PCR em tempo real (RT-PCR) de ARN total extraiu-se a partir de células tratadas com monastrol. extracção de RNA total foi realizada com o RNeasy Mini Kit (Qiagen, Alemanha), com o tratamento com DNAse (Qiagen, Alemanha) para assegurar a remoção de ADN genómico. O molde de ADNc foi preparado com 1 ug amostras de RNA, usando o kit de síntese de ADNc Verso como descrito pelo fabricante (Thermo Scientific). Para quantitativa PCR em tempo real, os modelos foram diluídas 1:16 e submetido a procedimento de PCR Taqman em tempo real usando o kit absoluta azul QPCR (Thermo Scientific). Os iniciadores e sondas (Solaris) para amplificação por PCR e tamanho do produto eram como se segue: survivina (95 pb) iniciador de sentido directo 5′-TTTCTCAAGGACCACCGCAT-3 ‘, iniciador inverso 5′-ATGAAGCCAGCCTCGGCCAT-3′, 5’-sonda CACCCCGGAGCGGATGG-3 ‘; Ciclina B (86 pb) iniciador de sentido directo 5’-ATCTGAGACAACTTGAGGAAG-3 ‘, iniciador inverso 5′-GATGGCTCTCATGTTTCCAG-3′, 5’-sonda GGTCGGGAAGTCACTGG-3 ‘; Actina (134 pb) iniciador directo 5’-TGGAGAAAATCTGGCACCAC-3 ‘, 5′-GGTCTCAAACATGATCTGG-3 reversa’, a sonda 5′-ACCGCGAGAAGATGACC-3 ‘. As reacções foram realizadas no detector de sequências ABI PRISM7500-(Applied Biosystems, Darmstadt, Alemanha). Foram utilizadas condições de ciclismo padrão para este instrumento. temperatura de recozimento foi 60 ° C durante todos os genes. Para cada amostra, os níveis de ciclina B e survivina foram normalizados para o gene de referência (actina) níveis. Real-time resultados de PCR representam uma média de três experiências diferentes
nível Proteína A análise foi realizada utilizando um procedimento de Western Blot (WB), como descrito anteriormente [30], utilizando o anticorpo survivina humana anti (R D Systems)., ciclina B1 (Santa Cruz Biotechnology Inc.), ou β-actina (Cell Signaling Technology, Inc., Massachusetts, EUA). A análise densitométrica do nível de expressão da proteína foi realizada utilizando processamento de imagem EZQuant-Gel e software de análise (EZQuant, Rehovot, Israel). Os níveis de proteína foram normalizados para níveis de actina
Si ARN de silenciamento
As células foram semeadas a 1,5×10 ~
5 células por poço em placas de 24 poços.; monastrol foi aplicado 24h seguinte chapeamento. As células foram transfectadas com uma ou siSurvivin mexidos (SC) construto siRNA (40 nM, Sigma-Aldrich), siARN transfecção foi realizada utilizando o reagente de lipofectamina 2000 de acordo com o protocolo do fabricante. A sequência alvo do survivina para siARN foi: 5 ‘GGACCACCGCAUCUCUACA 3’ ou mexidos 5 ‘GCCCAGAUCCCUGUACGU 3’. células de transfecção 12h e pós 24h foram contadas utilizando Trypan azul.
A análise estatística
Colunas e bares em todos os números representam média ± SEM. A significância das diferenças entre os valores médios foi determinada utilizando Student
t
-test. * P 0,05; ** P 0,01
Resultados
Para examinar os fatores que influenciam a sensibilidade das células diferentes para monastrol, primeiro caracterizou essa sensibilidade em cinco linhas de células diferentes:. AGS de adenocarcinoma do estômago [46 ], HepG2 do hepatocarcinoma [47], a partir de adenocarcinoma do cólon LoVo [48], a partir de carcinoma da próstata Du154 [49], e HT29 adenocarcinoma de cólon [50]. As células foram sujeitas a um tratamento prolongado com monastrol de até três dias. Em cada intervalo de tempo, o número de células viáveis foi examinado por ensaio de actividade mitocondrial utilizando-se 2,3-Bis- (2-metoxi-4-nitro-5-sulfofenil) -2H-tetrazólio-5-carboxanilida sal (XTT) [44 ]. Os nossos resultados indicam que, como esperado, o número de células viáveis diminuiu após tratamento prolongado com monastrol em todas as linhas celulares. No entanto, a percentagem de células viáveis nas diferentes linhas de células após o tratamento com monastrol variada. Por exemplo, o tratamento com 100 uM de monastrol durante dois dias, resultou em ~ 80% de redução no número de células AGS e HepG2, ~ 60% de redução no número de células Lovo, e apenas ~ 30% de diminuição na DU145 e células HT29 (Fig 1, círculos verdes). Encontramos também uma pequena, mas reprodutível diferença entre a viabilidade do DU145 e células HT29 tratado com monastrol. Por exemplo: a percentagem de células DU145 viáveis tratadas com 20 ou 50 uM monastrol durante 2 dias é significativamente menor do que a das células HT29 identicamente tratados. Com base nos dados de viabilidade (Fig 1), foi estabelecido o grau de sensibilidade à monastrol, do mais sensível ao menos sensíveis, como:. AGS HepG2 Lovo Du145≥HT29
derrapagem mitótico é um fenômeno por que na presença de danos mitótico, as células prosseguir para a fase G1 do ciclo seguinte sem dividir o seu ADN [31, 33, 34, 51]. A seguir, examinar se a resistência de uma linha celular particular a monastrol está relacionada com a sua tendência para sofrer resvalamento mitótico na presença do fármaco. Para caracterizar o deslizamento mitótico, que trataram células com monastrol durante 48 horas a concentrações que resultaram em menos sobrevivência celular, e examinaram a morfologia do citoesqueleto de microtúbulos por imunomarcação (Fig 2A e 2B) e a distribuição do ciclo celular por citometria de fluxo (Figura 2C). As células detidas na mitose por monastrol ter sido previamente demonstrado que apresentam fusos monoastral [24, 30]. Descobrimos que, após 48h de tratamento monastrol dois principais morfologias das células eram evidentes: células mitóticas monoastral (Fig 2A) G1-like ou. O número de células normais e em células mitóticas com morfologias não identificadas foi insignificante. Os nossos resultados mostram que, após tratamento com monastrol 48h, as diferentes linhas celulares exibiram diferentes percentagens de células com monoasters. Por exemplo, a maioria das células sobreviventes AGS apareceu como grandes células G1-LIKE com núcleos individuais (Fig 2A). A percentagem de monoasters nestas células era muito pequena, ~ 7% (Figura 2B). Verificou-se que ambos os AGS e linhas de células HepG2, que são sensíveis a monastrol, exibiu uma pequena percentagem de monoasters ( 10%) e uma grande percentagem de células G1 semelhante, a seguir ao tratamento monastrol 48h (Figura 2B). Por outro lado, LoVo, DU145, e HT29 linhas celulares, as quais são mais resistentes a monastrol, apresentam percentagens consideravelmente maiores, de 20-30%, de fusos monoastral (Figura 2B), indicando que um grande número destas células são presos em mitose. Análise da distribuição de fases do ciclo celular revelaram que, após tratamento 48h com monastrol, apesar da diferença na percentagem de células mitóticas com monoasters, todas as linhas celulares examinadas continham uma grande percentagem de células com teor de DNA de dupla (Figura 2C, seta dupla ). Isto indica que, embora algumas das células apareceram com o citoesqueleto de microtúbulos típico G1 semelhante, as células tinha dobrado teor de ADN, isto é, eles foram submetidos a derrapagem mitótica sem divisão de ADN. Nossos resultados sugerem, portanto, que há uma ligação entre a sensibilidade para monastrol ea tendência a sofrer derrapagem mitótico:. Células monastrol resistente segurar paragem da mitose por períodos mais longos, enquanto as células sensíveis à monastrol submeter a derrapagem mitótico
(A AGS) e células HT29 foram tratadas durante 48 h com 100 uM e 150 um de monastrol, respectivamente. citoesqueleto Tubulin foi visualizado seguinte fixação por imunocoloração, o DNA foi corado com DAPI. Seguindo 48h do tratamento monastrol, a maioria das células AGS apareceu como células grandes, G1-like com um núcleo (setas amarelas), enquanto que uma elevada percentagem de células HT29 foram presas na mitose como monoasters (setas verdes). (B) Efeito de um tratamento prolongado com monastrol em percentagem de monoasters nas diferentes linhas celulares, indicado na parte inferior. As células foram tratadas com monastrol, processado para imunocoloração, e a percentagem de monoasters foi determinada marcando 200-300 células para cada linha de células. Colunas e barras representam a média e SEM de 3 experiências independentes, * P 0,05, comparado com as células da AGS. (C) Distribuição de fases do ciclo celular foi determinada por citometria de fluxo, na ausência (controlo) ou na presença de monastrol. Linhas de células são indicados em cima. setas simples e duplas representam picos com 2N e conteúdo de DNA 4N, respectivamente.
A regulação negativa da survivina proteína anti-apoptótica foi mostrado anteriormente para aumentar o deslizamento mitótico na presença de danos do fuso [52] . Nós, assim, a hipótese de que, durante a exposição ao monastrol, a expressão de survivina será diferente entre células monastrol-sensíveis e resistentes ao. Para testar esta hipótese, foram comparados os níveis de proteína e ARNm de survivina nas células HT29 monastrol-resistentes e células sensíveis AGS-monastrol (Fig 3). Para permitir a medição das mudanças no nível de proteína antes da apoptose [30], que trataram células com monastrol para mais curto vezes, 12h e 24h. Para avaliar o estado mitótico das células examinadas, seguimos ARNm (Figura 3A) e de proteína (Fig 3B e 3C) níveis da ciclina mitótica proteína B. Descobrimos que a seguir ao tratamento de 24 horas com as células HT29 monastrol apresentam níveis de ciclina B aumentada em comparação a 12h de tratamento, indicando que eles são presos em mitose (Figura 3). Por outro lado, em células de AGS, os níveis de ciclina B foram já aumentou em 12 horas de tratamento com monastrol níveis e ciclina B exibiu uma tendência para diminuir a 24h, de 0,05 P 0,1 (Figura 3). Isto sugere que o tratamento com monastrol durante 24 h já provoca o deslizamento parcial mitótica em células AGS, enquanto as células HT29 manter a paragem da mitose. Exame de ARNm de survivina (Fig 3A) e de proteína (Fig 3B e 3C) que revelou níveis em HT29 níveis de survivina das células aumentou no tratamento com monastrol 24h, o que sugere que a survivina está envolvido na manutenção da paragem da mitose. Por outro lado, nas células AGS níveis de ARNm de survivina permaneceu inalterada em 24 horas em comparação com o tratamento com monastrol 12h. Além disso, as células em AGS, os níveis de proteína média de survivina foram menores em comparação 24h às 12h de tratamento monastrol, embora esta diferença não foi estatisticamente significativa (Fig 3B e 3C, painel da direita). Estes resultados sugerem que os níveis elevados de survivina de uma determinada linha celular estão correlacionadas com a resistência desta linha de células para monastrol tratamento.
HT29 e células AGS foram tratados com monastrol para 12h e 24h e processados para ARNm A análise por RT PCR (A) e a análise do nível de proteína por WB (B e C). 150 um e 100 uM monastrol foram usadas para as células HT29 e AGS, respectivamente. Em A e C, colunas e barras representam valores médios e SEM para 3-4 experimentos independentes. Em cada experiência, os níveis de ciclina B (esquerda) e survivina (à direita), indicado na parte superior, na presença de monastrol foram normalizados para os valores de controlo obtidos com apenas DMSO. * P 0,05; ** P 0,01; A-0,05 P 0,1 em comparação com 12 h de tratamento monastrol. (B) análise WB representativas da ciclina B e a expressão da proteína survivina em AGS (esquerda) e HT29 (direita) as células tratadas com monastrol para 12h e 24h, indicado na parte inferior. Carga igual de proteína foi segue pela expressão de actina (painéis inferiores). (+) Monastrol; (-) DMSO
Para examinar se os níveis de expressão elevados de survivina manter diretamente paragem da mitose sustentado, nós transfectadas células AGS sensível ao monastrol com um plasmídeo que codifica para a proteína survivina de tipo selvagem fundido a GFP (. pSurvivin, [45]), e criado um transfectadas estavelmente linha celular de poli-clonal AGS (ver Materiais e Métodos). vector expressando GFP foi utilizada como um controlo. AGS células que expressam o plasmídeo pSurvivin apresentaram 5,2 ± 0,9 (SEM, n = 4) vezes aumento na expressão de survivina (Fig 4A, parte inferior). Após a geração de linhas celulares estavelmente transfectadas, as células foram tratadas com 100 uM monastrol e processado para imunocoloração tubulina, viabilidade, e a análise da distribuição do ciclo celular (Figura 4A-4D). Verificou-se que após o tratamento com monastrol 24 h, a percentagem de células mitóticas presos com monoasters aumentou significativamente em células que expressam survivina em comparação com células que expressam AGS apenas com vector (figura 4A e 4B). Estes dados indicam que a superexpressão da survivina aumenta a capacidade de as células AGS para manter a paragem da mitose na presen de dano induzido por fuso monastrol. Análise da distribuição de fases do ciclo celular indica que a seguir ao tratamento 12h com monastrol, a percentagem de células AGS-expressam survivina com dupla (4n) teor de ADN é significativamente aumentada em comparação com células expressando apenas vector (Figura 4C, 12H), indicando que a survivina induz a paragem da mitose sustentada. É importante ressaltar que após o tratamento 24 horas com monastrol encontramos nenhuma diferença na percentagem de população de células com conteúdo de DNA 4n entre as células que expressam survivina e aqueles que expressam vector somente (Fig 4C, 24h). No entanto, a seguir ao tratamento de 24 horas com monastrol, houve um aumento significativo no número de células com monoasters em células que expressam survivina, indicando que as células estão em suspensão da mitose, em comparação com células expressando apenas vector, que foram submetidos a derrapagem mitótico e foram destinados para a célula morte (Figura 4A e 4B). Assim, os nossos dados indicam que, na ausência de sobre-expressão de survivina, células AGS sofrer resvalamento mitótico e morte celular após tratamento com monastrol, enquanto que a sobre-expressão de survivina induz a paragem da mitose, as células susceptíveis emergência. Além disso, de acordo com a função anti-apoptótica de survivina sugerido [45, 53], verificou-se que a sobre-expressão de survivina em células AGS aumentou a viabilidade destas células após 24 h e 48 h de tratamento com monastrol (Figura 4C).
(a-D), as células AGS foram transfectadas de forma estável com um plasmídeo que expressa GFP (vector) ou um plasmídeo que codifica para a sobre-expressão de survivina-GFP (pSurvivin). As células foram tratadas com 100 uM monastrol e processado para imunocoloração dos microtúbulos (A e B), a análise da distribuição do ciclo celular (C), e o teste de viabilidade (D). (A) Imagens representativas de citoesqueleto de microtúbulos em células AGS transportando um vector vazio ou pSurvivin, indicado na parte inferior. As células foram tratadas com 100 uM monastrol durante 24 h. células G1-like (setas amarelas) e células mitóticas (seta verde) são observados. Uma vez que as células mitóticas são redondos, o seu plano focal é diferente da das células-G1 como planas. Imagens em (A) estão focados nas células G1 e, portanto, os monoasters na mitose não são vistos nestas imagens. Consequentemente, as células mitóticas aparecem como esferas brilhantes (setas verdes). Parte inferior: análise WB survivina de proliferação de células AGS na presença (+) ou ausência (-) do plasmídeo pSurvivin superexpressão. (B) Quantificação da% de células mitóticas com base em imagens, tais como mostrado em (A). única Gray-vector; blue-pSurvivin. Colunas e barras representam a média e SEM de três experiências independentes em que um total de 200-300 células foram contadas. ** P 0,01, em comparação com apenas vector. (C) As células AGS estavelmente transfectadas foram tratadas com monastrol para 12h e 24h (indicado no topo) e processados para análise de distribuição de fases do ciclo celular por citometria de fluxo. setas simples e duplas representam picos com conteúdo de DNA 2N e 4n, respectivamente. Os números entre parênteses representam a porcentagem de células com o dobro (4n) conteúdo de DNA. (D) a viabilidade das células transfectadas de forma estável na presença de 100 uM monastrol para 24h e 48h. única Gray-vector; Azul-pSurvivin. O número de células viáveis foi determinado por ensaio de XTT para a actividade mitocondrial. Percentagem de células viáveis foi calculada relativamente ao controlo experiências apenas com DMSO. Colunas e barras representam média e SEM de 3 experiências independentes. * P 0,05, em comparação com apenas vector. (E) AGS e células HT29 foram transitoriamente transfectadas com survivina (verde escuro) ou mexidos (SC, verde claro) sequência Si RNA. 12h seguinte AGS transfecção e células HT29 foram tratados com 100 e 150 um monastrol, respectivamente, durante 12 horas e 24 horas (indicado na parte inferior). A viabilidade das células foi determinada por azul de tripano. Percentagem de células viáveis foi calculada relativamente ao controlo experiências apenas com DMSO. Colunas e barras representam média e SEM de 2-4 experiências independentes pré-formadas em triplicado. * P 0,05; ** P 0,01; a-0,05 P . 0,1, comparado a sequência Si RNA mexidos
Para examinar ainda mais a ligação entre a viabilidade celular em tratamento monastrol e expressão de survivina, nós parcialmente silenciado expressão survivin por Si RNA ( Figura 4E). sequência de ARN mexidos serviu como um controlo. O exame de níveis de ARNm de survivina por RT PCR confirmou que, embora a transfecção transiente de sequência de ARN mexidos causou qualquer alteração nos níveis de ARNm de survivina, transfecção com survivina Si ARN causou ~ 70% e 50-60% de diminuição nos níveis de ARNm de survivina em AGS e células HT29, respectivamente (não mostrado). Descobrimos que, após 12 h de exposição a monastrol, o silenciamento parcial de expressão survivina causou uma diminuição na viabilidade da AGS e células HT29 por 50-60%, em comparação com células transfectadas com a sequência de ARN codificado (Figura 4E). Enquanto as células AGS sensível ao monastrol mostrou apenas uma tendência (0,05 P 0,1), as células HT29 monastrol resistente mostrou um decréscimo claramente significativo na viabilidade seguinte silenciamento sobrevivente parcial (P 0,05), indicando que a survivina é necessária para a viabilidade e resistência à monastrol. Após 24 horas de tratamento com monastrol, a viabilidade das células sensíveis AGS-monastrol foi ainda mais reduzida em células transfectadas com ARN de survivina Si ou mexidos (Figura 4E). Nas células HT29 monastrol-resistentes, o silenciamento parcial de expressão survivina induziu um aumento da viabilidade em relação à sequência de ARN codificada, indicando a existência de mecanismos de adaptação nestas células para os níveis de survivina parcialmente reduzida. Tomados em conjunto, os nossos dados indicam que os níveis de survivina durante a paragem da mitose crescente estão ligados a viabilidade celular, a qual é, pelo menos parcialmente relacionada com a sua capacidade para induzir a paragem da mitose prolongada sob o tratamento com monastrol.
Discussão
Estudos da última década têm indicado que, quando as células são tratadas com drogas anti-mitóticas tais como inibidores específicos cinesina-5, dois cenários principais pode ocorrer: as células podem manter a paragem da mitose e morrer por apoptose mitótico [30, 31], ou prosseguir para a próxima fase G1 pelo deslizamento mitótico e passam por apoptose [33, 34]. Neste último caso, as células morrem rapidamente da apoptose causada pela “checkpoint tetraploidia” [33, 35]. Por este cenário, as células que sofrem mitose deslizamento mais facilmente na presença de monastrol vai ser submetido a apoptose induzida pelo ponto de verificação tetraploidia e, assim, ser mais sensível a monastrol. No entanto, o ponto de verificação tetraploidia verificou-se ser dependente da proteína p53 supressora de tumores [51, 54]. Assim, as células são esperados para ser mais sensível a monastrol se forem submetidos a derrapagem mitótico e expressam um p53 de tipo selvagem. Com efeito, as linhas celulares examinadas neste estudo expressam ambas as versões da proteína p53: p53 é de tipo selvagem em AGS [55], HepG2 [56], e LoVo [57] linhas de células, ao mesmo tempo que é mutado na HT29 [58] e DU145 [49] células. Nossa descoberta de que o grau de sensibilidade à monastrol é AGS HepG2 Lovo Du145≥HT29 apoia a ideia de que as células serão mais sensíveis aos cinesina-5 inibidores se eles tendem a sofrer derrapagem mitótico e levar alelo p53 do tipo selvagem. A tendência para sofrer resvalamento mitótico per si não é directamente dependente do estado de p53 uma vez que as células LoVo que transportam WT p53 [57] submetido a derrapagem mitótico no mesmo grau como o HT29 e células Du125, que transportam uma p53 mutada [49, 58 ] (Figura 2B e 2C). No entanto, o aumento da morte celular ocorre nas células LoVo quando WT p53 permite a activação do “ponto de verificação tetraploidia”.
Quando o deslizamento mitótico ocorre em células p53 mutada, células prosseguir com a proliferação sem dividir adequadamente ADN.
In vivo
, isso pode resultar em acúmulo de mutações que reduzem a atividade citotóxica /anti-câncer do kinesin-5 inibidores [22, 27, 39]. Assim, uma das estratégias para aumentar a eficiência de drogas anti-cancro anti-mitóticos podem ser para induzir a paragem da mitose prolongada em cancros que expressam versões mutadas da p53.