Abstract

Fundo

O problema da progressão do câncer de próstata para a independência de androgénio tem sido extensivamente estudada. Vários estudos analisaram sistematicamente todos os perfis de expressão genética no contexto das redes biológicas e caminhos, descobrindo novos aspectos do câncer de próstata. Apesar dos esforços significativos de investigação, os mecanismos subjacentes a progressão do tumor são mal compreendidos. Nós aplicamos uma nova abordagem para reconstruir eventos moleculares em todo o sistema após a estimulação das células cancerosas da próstata LNCaP com andrógeno sintético e para identificar potenciais mecanismos de progressão independente de andrógeno de câncer de próstata.

Metodologia /Principais Achados

realizamos medições simultâneas de expressão gênica e níveis de proteína após o tratamento utilizando microarrays e proteômica iTRAQ. Conjuntos de genes e proteínas up-regulamentados foram analisados ​​usando o nosso novo conceito de “significado topológica”. Este método combina dados moleculares de alto rendimento com a rede global de interações proteína para identificar os nós que ocupam posições de rede significativos no que diz respeito a genes ou proteínas diferencialmente expressos. Nossa análise identificou a rede de crescimento regulação fator de ciclo celular como a principal módulo de resposta para o tratamento de andrógeno em células LNCaP. Mostra-se que a maioria dos nós de sinalização na rede este ocupam posições significativas no que diz respeito à expressão do gene observada e perfis proteomic induzidas por estímulo de androgénio. Nossos resultados indicam ainda que a sinalização do fator de crescimento provavelmente representa uma resposta “segunda fase”, não diretamente dependente do estímulo andrógeno inicial.

Conclusões /Significado

Concluímos que, em células cancerosas da próstata do proliferativas sinais são susceptíveis de ser transmitida a partir de vários receptores do factor de crescimento por uma multiplicidade de vias de sinalização que convergem em vários reguladores-chave de proliferação celular, tais como c-myc, ciclina D e CREB1. Além disso, estas vias não são isolados, mas constituem um módulo de rede interligada contendo muitas rotas alternativas de entradas e saídas. Se toda a rede está envolvido, uma terapia de combinação precisamente formulado pode ser necessária para combater o crescimento do tumor de forma eficaz

citação:. Vellaichamy A, Dezső Z, G JeBailey, Chinnaiyan AM, Sreekumar A, Nesvizhskii AI, et ai . (2010) “Importância topológica” Análise da expressão gênica e perfis proteômicos de células cancerosas da próstata Revela-chave Mecanismos de andrógeno Response. PLoS ONE 5 (6): e10936. doi: 10.1371 /journal.pone.0010936

editor: Patrick Tan, Duke-NUS Graduate Medical School, Singapura

Recebido: 13 de novembro de 2009; Aceito: 06 de maio de 2010; Publicação: 03 de junho de 2010

Direitos de autor: © 2010 Vellaichamy et al. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Licença Creative Commons Attribution, que permite uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o autor original ea fonte sejam creditados

Financiamento:. Este trabalho foi apoiado em parte pela Michigan proteômica Alliance for Cancer Research pelo National Institutes of Health (NIH) CA134175-01 da concessão, R01CA126239 e por GeneGo, Inc. os financiadores não tiveram nenhum papel no desenho do estudo, coleta de dados e análise, decisão de publicar ou preparação do manuscrito

Conflito de interesses:. Andrej Bugrim, Zoltan Dezső e Lellean JeBailey são funcionários da GeneGo, Inc., que financiou parcialmente este estudo. Os autores confirmam que este facto não altera a sua adesão a todos os PLoS ONE políticas em dados e materiais de compartilhamento.

Introdução

O câncer de próstata é um dos cânceres mais comumente diagnosticado ea segunda principal causa de morte relacionada ao câncer em homens norte-americanos [1]. Embora a terapia de retirada de androgénio é muitas vezes eficaz numa primeira fase, a maioria dos casos evolui para o fenótipo muito mais agressivo independente de androgénios. Apesar dos esforços significativos de investigação, os mecanismos subjacentes a progressão do tumor são mal compreendidos. Papéis para várias vias de sinalização foram estabelecidas, mas não uma imagem sistêmica. Por exemplo, a sinalização de IGF tem sido implicado na progressão de a estados independente de androgénio dependentes de androgénio [2], mas também tem sido demonstrado para suprimir trans-activação de AR através FOXO1 e, portanto, têm efeitos inibitórios sobre o crescimento de células de cancro da próstata [ ,,,0],3], o EGF foi relatado para imitar efeitos de androgénio sobre a expressão do gene e, independentemente, estimular o crescimento de células de cancro da próstata dependentes de androgénio [4]. Outros estudos produziram evidências de interação entre a sinalização de andrógeno e TGF-beta [5], [6], FGF [7], [8] e VEGF [9].

A maior parte da investigação já referido documento foi em vez de data-driven-driven hipótese. formulação de hipóteses é suscetível a viés, devido às preferências dos investigadores e tendências atuais de pesquisa sobre o que é percebido como “interessante”. Uma abordagem orientada a dados complementares usando perfis moleculares de alto rendimento e algoritmos de análise avançada de dados poderia melhorar a compreensão dos muitos processos celulares que fundamentam a progressão do câncer de próstata para a fase independente de androgénios e pode abrir caminho a novas terapias e para alcançar uma maior eficácia a partir de uma melhor utilização dirigida de terapias existentes.

Genome-wide expressão paraíso profiling sido amplamente aplicado para doenças complexas, incluindo cancro da próstata [4], [10], [11], [12], [13], [14]. Vários estudos recentes também analisados ​​sistematicamente todos os perfis de expressão de genes no contexto das redes biológicas e percursos, descobrir novos aspectos de cancro da próstata [15], [16], [17]. Apesar deste progresso, a análise verdadeiramente sistémica que tenha em conta tanto a expressão do gene e os dados de proteômica da mesma amostra continua a ser uma meta distante. Um desafio fundamental é realizar análise integrada robusta dos conjuntos de dados produzidos por tão diferentes plataformas moleculares. Este é um problema difícil, porque informática dados de microarranjos e proteómica não podia, na maioria dos casos, ser diretamente comparados entre si. Por exemplo, estudos em leveduras demonstraram que a correlação entre os níveis de mRNA e proteínas correspondentes foram insuficientes para fazer previsões confiáveis ​​sobre os níveis de proteína a partir de dados de expressão de genes [18]. Um estudo recente de espécimes de cancro da próstata mostraram concordância entre os dados de proteômica e genômica que variam de 46% a 68% com base nas chamadas “ausentes /presentes”; no entanto, as correlações foram baixas quando os níveis reais de expressão foram comparadas [19]. Como se mostra num trabalho recente [20], muito mais extensa caracterização quantitativa de proteína conduz a uma melhoria significativa na correlação entre os níveis de proteína e a expressão do gene. Ainda assim, existem várias fontes intrínsecas da discordância, incluindo a degradação de ARNm, splicing alternativo, a regulação de translação, modificações pós-tradução, e a degradação da proteína [21]. Estes não pode ser superada por melhorias tecnológicas sozinho e ter de ser abordada por novas abordagens analíticas para integração de dados. esforços anteriores nesta área utilizada conjuntos pré-definidos de genes (vias, categorias Gene Ontology) para procurar concordância entre os dados de proteômica e genômica neste nível [22], [23].

Recentemente, desenvolvemos um nova metodologia computacional que pode ajudar a avançar a análise integrada de vários tipos de dados um passo adiante [24]. Nossa abordagem combina high-throughput de dados mesmas a doenças ou de condições específicas, molecular, com a rede global de interações proteína para identificar os nós que ocupam posições de rede significativos no que diz respeito a genes diferencialmente expressos ou proteínas nas bases de dados moleculares apresentados. Mesmo quando há ruído significativo e discordância no próprio dados, previsões do algoritmo são susceptíveis a convergir para um conjunto comum de proteínas de sinalização nas vias responsáveis ​​pelas alterações na expressão de genes-alvo e proteínas. Muitas vezes, a actividade de tais proteínas de sinalização é alterada através de modificações pós-traducionais subtis, a ligação a segundos mensageiros, ou o recrutamento de uma determinada sub-celular local. Esses eventos não são explicitamente refletido nos perfis moleculares correspondente; Assim, eles permanecem “escondido” a partir dos ensaios moleculares padrão. Nossa metodologia é capaz de encontrar muitas dessas proteínas “ocultas” através da identificação de conjuntos de seus alvos a jusante prováveis ​​e avaliar o enriquecimento de tais conjuntos de genes ou proteínas diferencialmente expressos. Chamamos esse procedimento “scoring topológico” (consulte a seção para obter mais detalhes “Métodos”).

Em nosso trabalho no início deste método foi testado em um conjunto de dados de expressão gênica por microarrays de pacientes com psoríase em que era capaz de identificar corretamente muitas proteínas reguladoras chave cuja relação com a doença é confirmada por estudos independentes [24]. No presente estudo, foram aplicados a abordagem de pontuação topológica para investigar a resposta de células de cancro da próstata LNCap ao tratamento com androgénio sintético (R1881), como um sistema modelo bem estudado para a progressão do cancro da próstata. Nós teve uma abordagem orientada a dados, sem ter qualquer hipótese preconcebida sobre processos celulares ativados por andrógeno nestas células. Temos recolhidos e analisados ​​tanto a expressão do gene e os dados de proteômica, a fim de cross-validar previsões com base em diferentes tipos de dados e avaliar a utilidade desta abordagem para análise de dados integrativa.

Resultados

Genes e as proteínas afetadas pelo tratamento de andrógeno identificado por microarray e proteína espectrometria de massa

a fim de interrogar o papel dos andrógenos no câncer de próstata, a linha de células de cancro da próstata andrógeno-responsive LNCaP foi tratado com andrógeno sintético R1881 (consulte ” seção de métodos “para obter detalhes). células LNCaP tratadas com androgénio mostrou aumento da proliferação de células de controlo enquanto que as células pararam de crescer em meio empobrecido androgénio. Usando a análise estatística dos dados a expressão do gene que identificamos 347 e 257 genes que foram para cima e para baixo-regulada, respectivamente, no tratado vs células não tratadas (FDR≤1%) (Tabela S1). Os genes regulados positivamente incluído conhecido genes induzidos por andrógenos tais como calicreína 3 (

KLK3

; aka

PSA

), proteína de ligação FK506 5 (FKBP5), N-myc regulada a jusante 1 (NDRG1 ) e ácido graxo sintase (FASN). Usando baseado em MS-MS iTRAQ 2DLC /perfilamento proteomic de androgénio-tratados versus células LNCaP não tratados, foram identificados 70 e 39 proteínas que foram elevadas ou regulada para baixo, respectivamente, em células tratadas em comparação com células não tratadas (Tabela S1) ( Detalhes da espectrometria de massa e as análises estatísticas estão descritas em [25]). As proteínas conjunto de dados incluiu produtos regulados por andrógenos gene para a conhecidos genes up-regulamentados mencionados acima, bem como várias outras proteínas previamente conhecidas e desconhecidas a ser regulado por andrógeno. Conjuntos de genes e proteínas up-regulamentados tem 13 membros comuns que é ~17% do conjunto menor. Para genes e proteínas reguladas para baixo o nível de concordância é ~ 8%.

nós Topologicamente significativas na rede de sinalização mundial

A fim de investigar os mecanismos de sinalização putativos que ativam genes e expressão da proteína após estimulação androgênica, temos aplicado nossa técnica recentemente desenvolvida de análise da significância topológica [24]. Apresentámos as listas de up-regulada genes e proteínas para a versão on-line da nossa ferramenta de pontuação topológico (https://topology.genego.com/zcgi/topology_scoring.cgi) para identificar proteínas reguladoras chave cuja actividade em células tratadas pode foram responsáveis ​​por mudanças nos níveis de genes e proteínas. expressão gênica e de dados de proteômica foram submetidos ao procedimento de pontuação em separado, resultando em dois conjuntos de proteínas reguladoras topologicamente significativos. Cada nó na rede global de interações proteína foi atribuída pontuação topológicos (valores de p topológicos) com relação a cada conjunto de dados moleculares. Para controlar a taxa de detecção falsa foi aplicado (FDR) o filtro de nível de significância. Usando FDR≤5% foram identificadas 962 proteínas topologicamente significativas a partir de dados de expressão gênica e 577 proteínas topologicamente significativas a partir de dados de proteômica (Tabela S2). Curiosamente, os dois conjuntos de proteínas topologicamente significativas conter 301 elementos comuns (ou 52% do conjunto menor) .Este resultado está em contraste com apenas 17% de sobreposição entre listas de up-regulada genes e-regulada proteínas.

factor de crescimento de sinalização de rede é altamente implicado na resposta androgénio

Para a análise funcional, ambos os conjuntos das proteínas topologicamente significativas foram carregados para o pacote de software MetaCore ™ (GeneGo, Inc.), onde foram calculados no enriquecimento ontologia de processos funcionais definidos por “redes de processo GeneGo”. Usamos todas as proteínas no (configuração “default”) da rede MetaCore como a lista de referência para o cálculo p-valores de enriquecimento. Como seria de esperar, o processo com maior pontuação é “sinalização nuclear do receptor de andrógeno” (Figura 1a). Surpreendentemente, no entanto, este processo é altamente enriquecido apenas em proteínas cujas pontuações topológica são derivados de o perfil de expressão do gene; 82 de 126 nós nesta rede processo são consideradas significativas em relação a genes sobre-expressos. Em contraste, apenas 19 nodos são consideradas significativas em relação a proteínas regulado para cima a partir do conjunto de dados iTRAQ. A próxima rede de processos altamente enriquecido é “regulação fator de crescimento do ciclo celular”. Ao contrário de sinalização de andrógeno, esta rede é altamente enriquecido em proteínas que são topologicamente significativa tanto para a expressão do gene e os dados de proteômica. De 186 nodos nesta rede, 95 são altamente marcado com respeito a genes sobre-expressos, enquanto 63 são altamente marcado no que diz respeito às proteínas identificadas iTRAQ-sobre-reguladas após o tratamento de androgénio. Em combinação, 49 nós são confirmados como topologicamente significativa de ambos os conjuntos de dados moleculares. Um exame mais aprofundado do presente processo revela que as proteínas topologicamente significativas estão presentes em todos os níveis de sinalização hierarquia, incluindo vários factores de crescimento (EGF, FGF, VEGF-A), receptores (IGFR, EGFR, ActRIIB, VEGFR-2), quinases de sinalização (AKT , GSK3, PI3K, JNK, ERK1 /2, PKC), factores de transcrição (c-myc, IRF1, Tcf (ABL), Smad3, SMAD4, STAT1, STAT3) e, finalmente, as quinases ciclina (ciclina D, ciclina e) que regular directamente do ciclo celular (Figura 2). Importante, significado topológica de muitas destas proteínas foi confirmada para ambas as categorias de dados. Para efeito de comparação, temos também realizada uma análise de enriquecimento via dos conjuntos originais de genes e proteínas up-regulamentados. Curiosamente, a maioria dos mapas de vias identificadas tanto para expressão dos genes e proteómica conjuntos estão relacionados a processos metabólicos, a maioria deles para o metabolismo de ácidos graxos (Tabela S3). Além disso, várias vias de sinalização são revelados por esta análise, nomeadamente fator de crescimento sinalização via MAPK e PIK3, regulação do metabolismo lipídico e um mapa via relacionadas ao ciclo celular. No entanto, nenhuma das vias de sinalização é muito altamente classificados e a significância geral do enriquecimento é baixo quando comparado com os resultados obtidos para as proteínas identificadas por pontuação topológico. Enriquecimento de redes GeneGo por proteínas sobre-regulada se revelar andrógeno rede de sinalização, mas também é na parte inferior da lista (p = 0,007). Exceto para a sinalização da insulina parece haver nenhuma consistência entre as redes enriquecidas em genes regulados positivamente e proteínas up-regulamentados. No geral, parece que a análise funcional de genes e proteínas diferencialmente expressos tende a identificar caminhos-alvo fundamentais, tais como o metabolismo, enquanto o anaylysis de proteínas topologicamente significativas revela sinalização chave processados ​​ativados nas células estimuladas por andrógenos.

(A) enriquecimento de redes de processo GeneGo por proteínas topologicamente significativos identificados utilizando todos os genes e proteínas sobre-regulada. (B) O enriquecimento de redes de processo GeneGo por proteínas topologicamente significativos identificados usando conjuntos truncadas de dados (excluindo genes e proteínas diretamente regulados pelo receptor de andrógeno). Laranja bares-enriquecimento de proteínas significativos identificados usando conjunto de dados de proteômica. Azul barras-enriquecimento de proteínas significativos identificados utilizando dados de expressão de genes.

Os pontos vermelhos indicam as proteínas identificadas como topologicamente significativo com base no perfil de expressão gênica. Os pontos azuis indicam as proteínas identificadas como topologicamente significativo com base no perfil de proteómica. Red caixas-proteínas identificadas como topologicamente significativa de ambos os conjuntos de dados.

A fim de investigar se as diferenças significativas nos tamanhos dos conjuntos usados ​​em nossa análise poderia ter afetado os resultados foram amostrados aleatoriamente o conjunto de genes e proteínas e acrescentou-los para os conjuntos diferencialmente expressos. Este passo foi seguido por análise de enriquecimento dos conjuntos prolongados. No entanto, os resultados mostram que não há mapas novas redes ou tornar-se significativo para conjuntos maiores e, além disso, o significado de mapas previamente identificados e redes diminui progressivamente à medida que os genes mais aleatórios são adicionados. (Ver Tabela S4).

delinear-androgénio dependente e actividade

Os resultados apresentados acima independente de androgénios sugerem que a maioria das proteínas na rede de sinalização a ligação de vários factores de crescimento à regulação do ciclo celular pode tornar-se ativa após a estimulação do andrógeno. A ativação resultante da proliferação celular pode se tornar um mecanismo de contribuição chave para a transição para a independência de andrógeno no cancro da próstata. Para comprovar esta conjectura precisamos investigar ou não esse resultado depende da atividade direta do receptor de andrógeno. Assim, o nosso próximo passo foi delinear efeitos que são independentes da ativação direta do receptor de andrógeno sinalização.

Em primeiro lugar, nós usamos MetaCore ™ para identificar qual dos genes sobre-expressos e up-regulada proteínas são alvos diretos de a regulação da transcrição por receptor de androgénio. Para este fim, construiu a rede “vizinhos mais próximos” em torno do receptor de andrógeno com o filtro de interação no conjunto MetaCore para permitir que apenas digite “regulação da transcrição” de links. Listas de genes e proteínas up-regulamentados foram mapeados para a rede resultante. Usando esta rede que seleccionado mais os nós que são: “a jusante” do receptor de androgénio e têm dados experimentais que lhes estão associados. Encontrámos 45 alvos directos do receptor de andrógeno entre sobre-expressos genes e 9 alvos entre o conjunto de proteínas up-regulamentados. Estas moléculas foram excluídos das listas originais e conjuntos truncadas foram re-analisados ​​com a ferramenta significado topológico com análise funcional posterior de nós topologicamente marcados em MetaCore ™. Foram identificados 565 proteínas significativas sobre a base de dados iTRAQ 668 e proteínas significativas com base na expressão do gene (conjunto de dados FDR com 5%, Tabela S5). Uma observação imediatamente perceptível a partir do exame do diagrama de enriquecimento é a ausência da rede de sinalização de androgénio (Figura 1b). Esta ausência confirma que muitas proteínas na via de androgénio elevados receberam pontuação topológicos sobre a força de sobre-expressão de um grande número de alvos directos do receptor de androgénio. Uma vez que estes objectivos são eliminados da consideração, a pontuação para proteínas na via regulada por androgénio caiu abaixo do nível de significância. Em contraste, alta enriquecimento para a rede de crescimento factor de regulação do ciclo celular manteve-se praticamente intacta. Enquanto o número de nós nesta rede marcou sobre a base de dados de microarray diminuiu 95-78, o número de nodos marcados com base em dados iTRAQ aumentou de 63 para 71. A sobreposição entre os dois conjuntos de proteínas significativas também aumentou para 54 (ou 76% do conjunto menor). Esta descoberta apoia a sugestão de que a atividade desta via é independente da ação dos androgênios direta e podem representar mecanismos importantes para a transição para a proliferação independente de andrógeno no cancro da próstata.

proteínas reguladoras topo do ranking e suas vias

em seguida, examinou as moléculas topo do ranking nos conjuntos de proteínas topologicamente marcados. Nosso objetivo foi determinar fatores de transcrição específicos que impulsionam resposta a expressão do gene após o tratamento de andrógeno e identificar cascatas reguladoras que os ativam. Há diversos factores de transcrição que regulam a expressão pode de um número significativo de “alvos” entre sobre-expressa os genes ou proteínas sobre-regulada ou ambos (quadro 1). Por exemplo, c-Myc tem 25 alvos entre 70 proteínas sobre-regulada identificados por iTRAQ e 63 alvos de 347 genes sobre-expressos identificados por análise de microarray. c-Myc é classificado # 1 na pontuação topológico com base em dados iTRAQ e # 11 na pontuação com base na expressão de genes (ainda no top 2%). Outros factores de transcrição que receberam pontuações altas topológicos no que diz respeito a ambos os conjuntos de dados são SREBP1 e YY1, que são reguladores importantes de enzimas envolvidas no metabolismo de lípidos e ácidos gordos. Em contraste, CREB1 e ATF-4 são os reguladores de transcrição com maior pontuação em relação a dados de microarranjos mas eles não recebem qualquer pontuação com base nos dados iTRAQ. A razão para esta discrepância é a falta de número significativo de alvos CREB1 e ATF-4 entre as proteínas sobre-regulada identificadas por espectrometria de massa (Tabela 1). Isto pode indicar actividade de alguns processos pós-transcricional bloqueio da síntese ou induzir a degradação destas proteínas no momento da amostragem. Enquanto fatores de transcrição muitas vezes recebem pontuação alta topológico devido ao número significativo de seus alvos diretos nos conjuntos de dados experimentais, as moléculas de sinalização a montante são marcados com base no enriquecimento dos conjuntos de seus “alvos remotos” -genes e proteínas alguns passos a jusante na sinalização vias.

Exame de cascatas de sinalização individuais que levam ao topo reguladores de transcrição revela que a sinalização PI3K é suportado por consistentemente altas pontuações topológicos derivadas de ambas proteômica e conjuntos de dados de microarranjos. A Figura 3 mostra esta cascata no contexto de sinalização IGF. A cascata PI3K é realçado pela linha vermelha, enquanto todos os seus elementos que permitam atingir altas pontuações topológicas no que diz respeito a ambos os conjuntos são marcados por caixas vermelhas. Tal consistente pontuação sugere o papel central de regulação desta via em eventos que se seguem o tratamento de androgénio. Muito provavelmente, o seu papel neste sistema é a inibição da GSK3 cinase e sua capacidade para fosforilar c-Myc e ciclina D (Fig. 3). Normalmente, tais fosforilação teria como alvo estas moléculas para proteólise, limitando assim a proliferação celular. Nesta situação, no entanto, c-Myc parece ser persistentemente activados a julgar pelo elevado número de seus alvos directos presente em ambos os conjuntos. Uma razão provável para a actividade persistente de sinalização de PI3K é mutação homozigótica de PTEN em células LNCaP que conduzem à falta da sua expressão neste sistema [26]. Este efeito pode ser exacerbado pela combinação de elevado nível de calicreína 3, a sobre-expressão do receptor de IGF, e sub-expressão de proteínas de ligação a IGF (IBPs). A calicreína 3 (também conhecido como PSA) é altamente sobre-regulada no cancro da próstata e é consistentemente sobre-expresso em ambos os níveis de mRNA e proteína nos nossos dados experimentais. foi anteriormente demonstrado que a PSA tem potencial proteolítica com respeito às proteínas de ligação a IGF [27], [28]. Além disso, sugere-se que este pode ser um mecanismo pelo qual a biodisponibilidade de IGF aumenta, contribuindo para o crescimento de células de cancro da próstata [29], [30].

Nível Vermelho “termómetros nos” representa relativa rank (percentual) de uma proteína na lista correspondente de proteínas topologicamente significativos. O número identifica o conjunto de dados a partir da qual foi calculada significado: 1-iTRAQ, 2-Affymetrix. Caixas vermelhas e trajeto de destaque ilustram cascata de sinalização com o apoio mais forte de ambos os conjuntos.

Em nossa análise obtivemos várias peças adicionais de provas para apoiar esta hipótese. Em primeiro lugar, proteínas de ligação IGF recebeu altas pontuações topológicas baseadas em ambos os dados iTRAQ microarray e. Este resultado confirma que eles são altamente relevantes para mudanças observadas na expressão do gene e da proteína após o tratamento de andrógeno de células LNCaP. Em segundo lugar, quando do tratamento de androgénio descobrimos que os níveis de, pelo menos, uma das proteínas de ligação a IGF (IBP3) e de mudança de receptor de IGF de expressão em sentidos opostos. IBP3 é de 30% sob-expresso em células tratadas, enquanto que o IGF-receptor é 46% sobre-expresso. A sub-regulação de IBP3 no nível genómico para além da actividade proteolítica de PSA deverá contribuir para menor concentração de proteína IBP3 e o aumento da disponibilidade de IGF. O maior nível de IGF resultante é acompanhada por sobre-expressão de seu receptor, levando a alta atividade de vias a jusante.

Discussão

rede de fator de crescimento como o principal módulo de resposta à estimulação do andrógeno em LNCap células

Nossa análise topológica identificadas da rede de crescimento regulação fator de ciclo celular como a principal módulo de resposta para o tratamento de andrógeno em células LNCaP. Como descrito na introdução, diferentes aspectos de sinalização de factor de crescimento têm sido extensivamente estudado no contexto do cancro da próstata interruptor para o modo independente de androgénios. Os nossos resultados apoiam estas observações anteriores de um nível de sistemas complementares, perspectiva orientada por dados. Em vez de focar sobre a actividade das proteínas individuais, que mostram que a maioria de sinalização nós na rede a ligação de vários factores de crescimento para os reguladores-chave do ciclo celular ocupam posições significativas no que diz respeito à expressão do gene observada e perfis proteomic induzidas por estímulo de androgénio. Esta rede contém vários “caminhos” convencionais transmitir sinais de receptores do fator de crescimento. Estes incluem a sinalização através de MAP quinases, PI3K via e sinalização via SMADs e cross-talk entre esses sistemas. Assim, é razoável concluir que em células de cancro da próstata os sinais proliferativos são transmitidos a partir de receptores de factores de crescimento por uma multiplicidade de vias de sinalização que convergem em vários reguladores-chave de proliferação celular, tais como c-myc, ciclina D e CREB1. Além disso, estas vias não são isolados, mas constituem um módulo de rede interligada contendo muitas rotas alternativas de entradas e saídas.

Nossos resultados indicam ainda que a sinalização do fator de crescimento provavelmente representa uma resposta das células “segunda fase” ao estímulo andrógeno. Quando todos os alvos directos do receptor de androgénio são removidos a partir da consideração, a maioria das proteínas na rede de factor de crescimento estão ainda altamente marcado no que diz respeito aos restantes conjuntos de sobre-expressa os genes e proteínas. Esta resposta pode ser mediada por efeitos combinados de altos níveis de PSA e receptores de factores de crescimento e níveis baixos de inibidores do factor de crescimento, tais como proteínas de ligação a IGF (IBPs) (Fig. 3). ação proteolítica de PSA pode ainda contribuir para a redução dos níveis de IBPS. Ao mesmo tempo, a expressão do PSA pode ser sustentada de forma independente de receptor de androgénio por CREB1 e alguns outros factores de transcrição [31]. Quando estes factores são activados através de vias de sinalização de factor de crescimento, um ciclo de feedback positivo que resulta pode manter elevados níveis de PSA e a proliferação celular, mesmo na ausência do receptor de androgénio activado. Temos notado que CREB1 é classificado # 1 na pontuação topológica de dados de expressão de genes, o que implica que é altamente ativo neste sistema.

Embora o trabalho mais experimental, tais como estudos de siRNA é necessária para confirmar essas inferências, se se mostrou correta eles podem levar-nos a repensar a nossa abordagem para encontrar terapias direcionadas para o câncer de próstata. Redes biológicas são robustas no sentido de que existem muitas maneiras alternativas para transmitir um sinal molecular a partir de um ponto para outro. Dado altas taxas de mutação de genes em células de cancro, é provável que, mesmo se bloquear uma certa cascata com uma droga direccionada, haverá, pelo menos, uma sub-população de células de um tumor que pode contornar um tal bloco usando um rota alternativa sinalização. Se toda a rede está envolvido, uma terapia de combinação precisamente formulado será necessária para combater o crescimento do tumor de forma eficaz. Além disso, tais terapias de combinação pode ter que ser específico para uma pequena subpopulação de pacientes ou mesmo pacientes individuais dada propriedades específicas do paciente de redes oncogênicos.

natureza dinâmica das respostas celulares e integração de dados gerados por diferentes tecnologias

neste estudo, as medições simultâneas de expressão gênica e níveis de proteína após o tratamento com andrógenos sintéticos foram realizados, e centenas de genes e dezenas de proteínas cujos níveis aumentaram após o estímulo foram identificados. No entanto, só há sobreposição modesto (cerca de 17%) observados entre os conjuntos de sobre-regulada genes e proteínas. Embora inicialmente isso soa surpreendente, este resultado deve ser esperado. As células são sistemas dinâmicos complexos em que os processos ocorrem em várias escalas de tempo. Quando ensaiar uma amostra biológica que estamos tomando um instantâneo estático deste comportamento dinâmico. Por exemplo, os níveis de mRNA pode aumentar após 20-60 min após o tratamento, mas a síntese de proteína poderia ser adiada, e alteração estatisticamente significativa nas concentrações de proteína levará muito mais tempo para desenvolver e têm proporções menores. No momento em que as proteínas são sintetizadas algumas ARNm pode ser degradada, sem deixar vestígios dos genes sobre-expressão. Assim, quando se estuda microarray ou proteômica de dados, estamos a lidar com vestígios fragmentadas de atividade que são deixados para trás por processos dinâmicos transitórios em diferentes níveis de maquinaria celular. Mesmo nas experiências onde as amostras são testadas a vários pontos de tempo nós ainda estamos olhando para uma pequena coleção de instantâneos individuais em vez de um quadro completo da dinâmica celular.

Aqui usamos o conceito de significado topológico para reconstruir caminhos a montante que pode ter provocado estes vestígios de atividade dinâmica que se detectou perfis moleculares como observável. Os resultados indicam que esta abordagem teve êxito na predição de proteínas reguladoras chave e vias de sinalização, tais como androgénio, a sinalização do factor de crescimento e regulação do ciclo celular que medeiam as respostas de células LNCaP de tratamento com androgénio sintético (R1881). Mais importante, descobriu-se que o grau de sobreposição entre os conjuntos de proteínas reguladoras da expressão do gene preditos e os dados proteomic é muito mais elevada do que a sobreposição entre o experimental define-se (52% vs 17%). Além disso, para a regulação do factor de crescimento do ciclo celular que parece ser um processo fundamental neste sistema, a sobreposição atinge 76%.