Abstract
O câncer de ovário é o mais mortal de todos os cânceres ginecológicos. Evidências recentes demonstram uma associação entre atividade enzimática alterando polimorfismos de nucleotídeo único (SNP) com susceptibilidade ao câncer humano. Buscou-se avaliar a associação de SNPs em oxidante chave e enzimas antioxidantes com maior risco e sobrevivência em câncer epitelial de ovário. Indivíduos (n = 143) recrutados foram divididos em controles, (n = 94): voluntários saudáveis (n = 18), de alto risco
BRCA1 /2
negativo (n = 53), alto risco
BRCA1 /2 casos
positivos (n = 23) e do cancro do ovário (n = 49). O ADN foi submetido a análise do genótipo TaqMan SNP para oxidante seleccionado e enzimas antioxidantes. Dos sete selecionados SNP estudado, nenhuma associação com o risco de câncer de ovário (Pearson Chi-quadrado) foi encontrado. No entanto, uma catalase SNP foi identificada como um preditor de sobrevivência de câncer de ovário pelo modelo de regressão de Cox. A presença deste SNP foi associada a uma maior probabilidade de morte (hazard ratio (HR) de 3,68 (intervalo de confiança de 95% (CI): 1,149-11,836)) para pacientes com câncer de ovário. Kaplan-Meier análise de sobrevivência demonstrou uma diferença significativa mediana de sobrevida global (108 versus 60 meses, a p 0,05) para aqueles sem a catalase SNP, em comparação com aqueles com o SNP. Além disso, a idade no momento do diagnóstico maior que a mediana foi encontrado para ser um preditor significativo de morte (HR de CI 2,78 (95%: 1,022-7,578)). Este estudo indica uma forte associação com a catalase SNP e sobrevivência de pacientes com câncer ovariano e, portanto, pode servir como um prognosticador
Citation:. Belotte J, Fletcher NM, Saed MG, Abusamaan MS, Dyson G, Diamante MP , et ai. (2015) A Single Nucleotide Polymorphism em catalase é fortemente associada com cancro do ovário Survival. PLoS ONE 10 (8): e0135739. doi: 10.1371 /journal.pone.0135739
editor: Alvaro Galli, CNR, ITALY
Recebido: 18 de maio de 2015; Aceito: 25 de julho de 2015; Publicação: 24 de agosto de 2015
Direitos de autor: © 2015 Belotte et al. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Licença Creative Commons Attribution, que permite uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o autor original ea fonte sejam creditados
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financiamento:.. os autores não têm apoio ou financiamento para relatar
Conflito de interesses:. os autores declararam que não existem interesses conflitantes
Introdução
cancro do ovário
epitelial (EOC) é responsável por 85 a 90% de todos os cancros dos ovários, trompas e peritônio primário; e exibe várias histologia como serosa, mucinoso ou endometrioid [1]. O câncer de ovário é o mais mortal de todos os cânceres ginecológicos com um número estimado de 22,980 novos casos e 14.270 mortes esperadas em 2014 [1,2] os EUA sozinhos. Normalmente, o tratamento de câncer de ovário é realizada com cirurgia cytoreductive (CRS), seguido de platina /taxano quimioterapia combinada ou quimioterapia neoadjuvante com SRC intervalo [3,4]. De um modo geral, uma resposta clínica completa 50-80% pode ser conseguida em pacientes com doença avançada. Infelizmente, a maioria dos pacientes tratados recaída no prazo de 18 meses com doença resistente à quimioterapia [5]. Embora as chances de sobrevivência do paciente a longo prazo são aumentadas significativamente quando o câncer é detectado em sua fase inicial, até à data, não existe um método confiável disponível para a detecção precoce desta doença [5].
Os estudos epidemiológicos têm claramente estabelecido o papel da história familiar como um importante fator de risco para câncer de mama e de ovário [6]. Mutações no
BRCA Quais são utilizadas atualmente para avaliar o risco de câncer de mama e ovário, no entanto, este método não é o ideal, porque as mutações são tão raros (1 em cada 500 indivíduos), levando a um pequeno impacto global sobre a mortalidade taxa de [7]. variações genômicas entre os indivíduos têm sido cada vez mais utilizado na prática da medicina [8-12]. Um polimorfismo de um único nucleótido (SNP) ocorre devido a mutações pontuais que são selectivamente mantidas em populações e são distribuídos ao longo do genoma humano, com uma frequência estimada em geral de pelo menos um em cada 1000 pares de base [13]. Não sinónimo substituto SNP codificado aminoácidos em proteínas, e são mais susceptíveis de alterar a estrutura, a função, e a interacção da proteína [14]. Evidências recentes demonstram uma associação entre atividade enzimática alterando SNPs nos genes de reparo de DNA oxidativo e genes antioxidantes com suscetibilidade ao câncer humano [15]. Além disso, um estado pró-oxidante tem sido implicada na patogénese de várias doenças malignas, incluindo o cancro do ovário [16,17]. O presente estudo é baseado no facto de que certas SNPs presentes em oxidantes e antioxidantes importantes enzimas resultar na actividade enzimática alterada, bem como o nosso trabalho previamente publicado delinear o papel do stress oxidativo no cancro do ovário. O objetivo deste estudo foi determinar se o SNP específico em enzimas chave oxidantes e antioxidantes estão associados com o aumento do risco, bem como a sobrevivência global dos doentes com cancro do ovário.
Materiais e Métodos
Desenho do estudo
Foi realizado um estudo de caso-controle comparando indivíduos do sexo feminino com e sem EOC e determinar se existe uma associação com vários SNPs seleccionados em genes redox estabelecidos. mulheres elegíveis foram de 19 a 80 anos de idade e foram previamente recrutados através do Registro do Karmanos Cancer Institute Genético (KCIGR), Detroit, MI. As actividades de investigação e método de consentimento foram realizadas com a aprovação da Wayne State University Institutional Review Board (IRB # 024199MP2F (5R)). formulários de consentimento informado por escrito foram utilizados e a permissão foi concedida para a recolha de amostras de sangue e de acesso a registros médicos para todas as disciplinas.
população de pacientes.
indivíduos recrutados (n = 143) foram divididos em controles (94), voluntários saudáveis (n = 18), de alto risco
BRCA1 /2
negativo (n = 53), alto risco
BRCA1 /2
positivo (n = 23 ) e os casos de cancro do ovário (n = 49). Os controles foram selecionados principalmente de sujeitos de pesquisa, considerados de alto risco para câncer de mama e de ovário, câncer de ovário, sem que sofreu rastreio genético para
estado de portador BRCA1 /2
. De nota, os critérios utilizados para a seleção incluíram história pessoal de câncer de mama e cancro do ovário, história familiar de cancro da mama e cancro do ovário e
BRCA1 /2
mutações. Além disso, voluntários saudáveis também foram recrutados como controles da área metropolitana de Detroit com nenhuma dessas histórias. Os casos foram selecionados com base em diagnóstico primário confirmou-histopatologia do EOC. Todos os participantes, exceto voluntários saudáveis, foram previamente submetidos à
BRCA1 /2
testes e os resultados foram disponibilizados para nós.
As amostras usadas para este estudo foram coletados de participantes recrutados entre 1999 e 2012. as amostras de ADN foram utilizados para determinar a presença de polimorfismos nos genes descritos na Tabela 1. os SNPs foram escolhidos com base em associações relatadas com vários cancros [18-26]. Dos 143 pacientes, 49 (34,3%) tinham um diagnóstico primário de câncer de ovário enquanto 94 (65,7%) sem câncer serviram como controle. Para o grupo de cancro do ovário: 13 (26,5%) eram
BRCA1 /2
positiva, em comparação com 34 (69,4%)
BRCA1 /2
negativo; 2 (4,1%) casos foram faltando. Os dados são distribuídos normalmente com a idade de matrícula variou de 18 a 90 com uma média de 52 ± 15 e uma idade média de 52. A idade ao diagnóstico variou de 23 a 77, com média de 52 ± 11 e uma idade média de 52. A distribuição racial foi de 88,8% (caucasiana), 8,4% (Africano-americano) e 2,8% (Outros). história pessoal e familiar de câncer de mama, câncer de ovário, outros tipos de câncer, e
BRCA1 /2
foram quantificados. As frequências da presença do SNP (heterozigoto mais mutante homozigoto) em relação ao tipo selvagem homozigoto foram determinadas para cada gene estudado.
Purificação de DNA ea TaqMan SNP Genotyping Assay para SNPs
ADN, a partir de amostras de sangue, foi isolado pela Genomics Technology Center Aplicada (AGTC, Detroit, MI). O DNA foi extraído com QIAamp DNA Mini Kit acordo com o protocolo do fabricante (Qiagen, Valencia, CA) [27]. A TaqMan SNP Genotyping Assay Define (Applied Biosystems, Carlsbad, CA) (NCBI dbSNP genoma de construção 37, a fonte de MAF 1000 genomas) foram utilizados para genotipar SNPs seleccionados descritos na Tabela 1. A AGTC realizados neste ensaio e análise foi feita utilizando o QuantStudio 12K Flex real-Time PCR System (Applied Biosystems).
a análise estatística
Os dados foram analisados usando SPSS (IBM, Armonk, Nova York) para Mac V.22. As variáveis selecionadas para as análises incluem genótipos, idade ao diagnóstico e idade no histórias de inscrição, pessoal e familiar de mama, ovário e
/2
mutações BRCA1, além de outras doenças malignas. Usando a média de idade no momento do diagnóstico /inscrição como ponto de corte, nós dicotomizada a “idade no momento do diagnóstico” variável. A variável “raça” foi categorizado como: Caucasiano, Africano-Americano ou Outro. Consolidamos a seguinte tumor e variáveis clínicas em regimes categóricas binárias: Federação Internacional de Ginecologia e Obstetrícia (FIGO) estágios em início (IIA-IIIB) e avançado (IIIC-IV); notas Figo (G1 /2) e (G3); histologia (serosa e outros). Para todos os genes estudados, o “genótipo” variável foi dicotomizados usando o esquema seguinte: tipo selvagem homozigótico mutante homozigótica contra mais mutante heterozigótica. Para comparar os casos aos controles sobre as características demográficas, clínicas e genotípicas selecionados, foi realizada Pearson análise Qui-quadrado. A taxa de recorrência foi determinada como a percentagem de doentes que entraram em remissão, mas a doença voltou meses ou anos mais tarde, com base no exame físico, exames radiológicos e os níveis de CA-125 soro.
Cox regressão e Kaplan -Meier análise de variáveis como um preditor de sobrevida global.
Para estudar o impacto da SNPs na sobrevida global, análises de regressão de Cox foram realizadas utilizando as variáveis acima listados e esquemas de classificação, usando a taxa de probabilidade passo a passo para a frente Método. Diversas simulações do método foram realizados, tais como: entrada forçada (ENTER), LR para a frente (razão de probabilidade), etc. A LR frente foi escolhido para a análise final. Este método é um modelo rigoroso que seleciona os mais fortes preditores do resultado a ser incluídas no modelo final. A Tabela 2 inclui os preditores mais fortes mantidos pelo modelo, bem como variáveis rejeitadas pelo modelo. Todos os pacientes receberam o tratamento padrão após discussão bordo tumor. Detalhes sobre as características de tratamento não estavam disponíveis. Além disso, as curvas de sobrevivência de Kaplan-Meier foram gerados para as variáveis seleccionadas pelo modelo. Realizamos todas as análises no valor de p 0,05 para significância estatística.
Resultados
Foi realizada comparação lado a lado entre os casos de câncer de ovário e controles usando Pearson análise qui-quadrado. distribuição racial foi estatisticamente semelhante entre os grupos (p 0,05). Como esperado, a “história pessoal ou familiar de câncer de ovário”, “história pessoal ou familiar de outros tipos de câncer” e “idade avançada” foi significativamente diferente entre os grupos e são conhecidos fatores de risco de câncer de ovário (p 0,05, Tabela 3). Análises comparativas de manganês superóxido dismutase (
MnSOD
, rs4880), NAD (P) H oxidase (
CYBA
, rs4673), glutationa peroxidase (
GPX1
, rs3448), induzível da óxido nítrico sintase (
NOS2
, rs2297518), mieloperoxidase (
MPO
, rs2243828), glutationa redutase (
GSR
, rs1002149) e catalase (
CAT
, rs1001179) não encontraram uma diferença significativa entre os casos e controles (Tabela 3). Dos 49 casos de cancro do ovário, 38 (77,5%) foram analisados pelo método de regressão de Cox, e 11 (22,5%) foram retiradas por falta de dados. A maioria dos casos foram histologia serosa, fase avançada, e tumores de alto grau (Tabela 4). A taxa de recorrência foi encontrado para ser 60,5%.
O
CAT
SNP é um preditor de sobrevida mais curta
Na altura destas análises, houve 26 óbitos (18,2%) e 117 (81,8%) indivíduos vivos. Entre os SNPs apreço só
CAT
(rs1001179) foi identificado como preditor de menor sobrevida pelo modelo de regressão de Cox com uma taxa de risco (HR) da CI 3,68 (95%: 1,149-11,836, p = 0,028 ) (4A Tabela). Como esperado, “idade de diagnóstico” maior do que a mediana (52) foi encontrado para ser um preditor significativo de morte com uma HR de 2,78 (IC 95%: 1,022-7,578, p = 0,045) (Tabela 4). As variáveis selecionadas para as análises, mas rejeitadas pelo modelo estão listadas na Tabela 4. Kaplan-Meier (KM) a sobrevivência consignado pelo
CAT
genótipo, que utilizou 84,6% dos óbitos, demonstrou uma média estatisticamente significativa diferença na sobrevida global ([95% CI: 79-137] 108 versus 60 [IC 95%: 40-80] meses, p 0,05) e uma diferença média de sobrevida global ([IC 95%: 75,5-288] 182 contra 47 meses [IC 95%: 31-60]., p 0,05) para indivíduos com o genótipo normal em comparação com o
CAT
SNP genótipo (Fig 1)
a curva contínua representa casos com (CC) homozigoto de tipo selvagem genótipo, em comparação com a curva tracejada, o que representa casos com mutante homozigótica mais mutante heterozigótica (CT + TT) genótipos. O eixo dos X representa a sobrevivência do paciente em meses; o eixo dos Y representa a percentagem de sobrevivência cumulativa. p-valor do qui-quadrado 0 0,05 é considerado estatisticamente significativo
Discussão
Um grande corpo de evidências sugere que os doentes com cancro do ovário têm diminuição dos níveis circulantes de antioxidantes e níveis mais elevados de. estresse oxidativo [16,17,28-32]. Nós relataram a existência de um estado pró-oxidante persistente em EOC que incluiu um aumento da expressão de enzimas-chave pró-oxidantes, tais como induzível da óxido nítrico sintase (iNOS), NAD (P) H-oxidase, e MPO [16,32,33] . Curiosamente, a expressão de MPO nas células e tecidos EOC foi uma surpresa, pois é uma enzima oxidante de geração tipicamente encontrado em células de origem mielóide [34]. Nós também determinaram que MPO pode produzir o cátion nitrosónio (NO
+), utilizando NO produzido pela iNOS. Isto é importante porque nenhuma
+ causas s-nitrosilação de caspase-3, e a inibição da sua actividade, resultando numa diminuição da apoptose [32]. Este mecanismo explica ainda a observação de que as células EOC manifestos diminuiu significativamente a apoptose e aumento da sobrevida [32,33,35,36]. Curiosamente, a avaliação das mutações nas várias enzimas redox na forma de SNPs é uma área activa de investigação científica [37-45]. Os polimorfismos genéticos são conhecidos por estarem associados com a susceptibilidade ao cancro e pode ser determinada estudando polimorfismos funcionais em genes que controlam os níveis de espécies de oxigénio reactivas e dano celular oxidativo, incluindo SNPs para genes envolvidos no metabolismo cancerígena (desintoxicação e /ou activação), antioxidantes , e as vias de reparo de DNA [46]. Por exemplo, mutações germinativas em
BRCA1
ou
BRCA2
estão associados com câncer de ovário em uma taxa de apenas 20-40%, sugerindo a presença de outras mutações não identificadas em outros genes, como uma etiologia [ ,,,0],14,47,48]. variações genéticas adicionais, muitos dos quais foram identificados nos últimos estudos de associação do genoma (GWAS), têm sido propostos para atuar como baixa a moderada alelos penetrantes, que contribuem para o risco de câncer de ovário, assim como outras doenças [14,49] . Em apoio a esta, estudos recentes também associaram polimorfismos genéticos nos genes envolvidos na supressão da tumorigenicidade, bem como aqueles envolvidos no ciclo celular com cancro do ovário [50,51].
Para este estudo, buscamos avaliar a associação de SNPs específicas em oxidante chave e enzimas antioxidantes com maior risco e sobrevida global de câncer de ovário. A análise da população de pacientes revelou que a média de idade no momento do diagnóstico e distribuição racial das pessoas diagnosticadas com câncer de ovário foram consistentes com fatores de risco conhecidos para o câncer de ovário, especificamente, as mulheres do norte-americano decente e aqueles com mais de 50 anos de idade. Atualmente nós demonstramos que não há associação entre os SNPs e risco de desenvolver câncer de ovário (Tabela 2) selecionados. É importante ressaltar o fato de que, embora os SNPs seleccionados para este estudo não foram encontrados para ser associado com o risco de cancro do ovário, mudança adicional de SNPs função para estas enzimas existem e devem ser mais explorada. Do SNPs estudados na análise de sobrevivência, encontramos o
CAT
SNP (rs1001179) para ser um preditor significativo de morte, quando presentes em pacientes com câncer ovariano como ilustrado pela regressão de Cox e análises de sobrevivência KM (Tabela 3 e Fig 1). Especificamente, os pacientes com cancro do ovário com o
CAT
SNP morreram significativamente mais cedo do que aqueles sem ele (Fig 1). O
CAT
SNP (rs1001179) é encontrado na região promotora da
gene CAT
, substituindo o alelo C com T na posição -262 na região 5 ‘do cromossoma 11 e está correlacionado com diminuição do nível de atividade da enzima [52]. A catalase é uma enzima muito importante e ubíqua envolvidos na degradação de duas moléculas de peróxido de hidrogénio (H
2O
2) para a água e oxigénio. Os resultados atuais são consistentes com vários outros estudos, que ligavam esta SNP específico com o risco, a resposta ao tratamento adjuvante e sobrevivência de pacientes com câncer [18,19,24,53]. Especificamente, os níveis de CAT séricos baixos foram associados com prognóstico adverso para câncer de ovário [21]. Nossos dados fornece uma possível explicação para os níveis de CAT séricos baixos, o que pode ser resultado de um
CAT
SNP que reduz a atividade enzimática. Além disso, estudos sobre os mecanismos identificaram H
2O
2, resultado do estresse oxidativo, aumentar a angiogénese e invasão do tumor através de várias vias incluindo: hipóxia fator inducible 1-alfa, p38 MAPK e caracol [54,55]. Afigura-se que a via final comum culmina para o factor de crescimento epidérmico (EGF) induzida por sub-regulação da expressão de caderina epitelial que pode ser inibida por CAT exógeno [54]. Epitelial-caderina é uma glicoproteína de adesão célula-célula codificada pelo
CDH1
genes em seres humanos, o qual foi caracterizado como um supressor de tumor [56,57]. Sua perda de função está relacionada com vários tumores sólidos, incluindo ovário e pensado para contribuir para a progressão do tumor ea metástase [58].
É importante enfatizar que a falta de associação entre os SNPs selecionados neste estudo, com ovário o risco de câncer não responder definitivamente esta questão importante, porque existem adicionais SNPs mudança de função para estas enzimas e deve ser mais explorada. estudos genéticos recentes têm ligado MPO para pulmão e cancro do ovário, demonstrando uma correlação surpreendente entre o risco relativo para o desenvolvimento da doença e a incidência de
MPO
polimorfismos funcionalmente distintas [59]. Além disso, um SNP em NAD (P) H-oxidase (rs4673) tem sido associada a um risco aumentado de cancro do ovário [60]. No cancro da mama, a presença do
CAT
SNP (rs1001179), foi mostrado para conferir maior risco [24]. Nós selecionamos vários SNPs adicionais com base no seu efeito sobre a atividade das enzimas ou associação com o câncer. Vários SNPs em
NOS2
têm sido associados com gástrico, do esófago, da pele e cancros urogenitais [20,22]. Além disso, SNPs em
MnSOD
,
GPX1
,
GPx4
,
CAT
foram encontrados para ser associado com câncer de próstata [24].
Outros estudos descobriram um SNP em
MnSOD
(rs4880) e um SNP em
MPO
(rs2333227) para ser associado com um risco aumentado de câncer de ovário [34]. O
MPO
SNP temos analisado neste estudo está em 100% de concordância com rs2333227 SNP [61]. Assim, além de examinar outras alterações funcionais de SNPs, aumentando o tamanho do nosso coorte pode ser suficiente para alcançar significância estatística em vários dos SNPs escolhidos para este estudo. A força do nosso estudo inclui a natureza abrangente de genes redox estudados e o aspecto translacional da nossa abordagem, avaliando características simultaneamente clínicas e genotípicas da população. Acreditamos que o fato de que nosso grupo de controlo é heterogênea representa a força, porque inclui pacientes considerados de alto risco para o
BRCA1 /2
mutação e aqueles sem quaisquer fatores de risco estabelecidos para o câncer de ovário, refletindo o grupo de risco da linha de base (geral população). Curiosamente, os pacientes que testaram negativo para
BRCA1 /2
mutações, bem como, aqueles com história familiar de
BRCA1 /2
mutações, mas também resultados negativos para
BRCA1 /2
deve ser considerado em um perfil de risco mais elevado do que a população em geral. Mais importante, a nosso conhecimento, nós somos os primeiros a relatar uma associação entre a presença desta específica
CAT
SNP e de sobrevivência de câncer de ovário. O estudo tem várias limitações, como o tamanho reduzido da amostra, a natureza retrospectiva inerente aos estudos de caso-controle, ea restrição geográfica da população. Na nossa população doente, a taxa de recorrência verificou-se ser de 60,5%; no entanto, a data exata da recorrência não foi estabelecida fazendo o cálculo de sobrevida livre de progressão (PFS) impossível. Nós reconhecemos que a determinação da PFS teria reforçado os nossos resultados como PFS tem sido frequentemente utilizado como um endpoint primário ou um substituto para a sobrevivência global nos ensaios clínicos [62-67].
É agora evidente que o estresse oxidativo desempenha um papel importante na patogénese de cancro, incluindo cancro do ovário, no entanto os mecanismos exactos ainda não foram esclarecidas. Neste estudo preliminar, fomos capazes de mostrar que um determinado
CAT
SNP está associado com pior sobrevida em pacientes com câncer de ovário. Novos estudos que examinam outros SNPs em oxidantes chave e enzimas antioxidantes com maior número de pacientes serão necessários para estabelecer esta ligação. SNPs nessas enzimas podem servir como potenciais marcadores para cancro do ovário, que são urgentemente necessários. Nosso estudo indica uma forte associação com o
CAT
SNP e sobrevivência de pacientes com câncer ovariano e, portanto, pode servir como um prognosticador.
Informações de Apoio
S1 Arquivo. Os dados do paciente e informações
doi: 10.1371. /journal.pone.0135739.s001
(PDF)
Reconhecimentos
Nós gostaríamos de agradecer ao Dr. Michael S. Simon, Instituto Karmanos Cancer, Detroit, MI por seus esforços inestimáveis e os conselheiros genéticos em Genética Clínica. Os pacientes são selecionados para a elegibilidade em uma conferência clínica semanal e Dr. Simon ou os conselheiros genéticos introduzir /explicar o estudo para os pacientes elegíveis, o consentimento deles, e providenciar a coleta de sangue. Também gostaríamos de agradecer ao Dr. Michael A. Tainsky e Nancy Levin, Karmanos Cancer Institute, Detroit, MI, por seu apoio e por fornecer as amostras de DNA para este estudo.