Abstract

Fundo

caixa de forkhead L1 (FOXL1), considerado como um novo candidato supressor de tumores, suprime a proliferação e invasão em certos cancros. No entanto, a regulação e função de FOXL1 em ​​câncer de vesícula biliar (GBC) permanece obscuro.

Métodos

expressão FOXL1 no mRNA e os níveis de proteína em tecidos e linhas celulares GBC foram examinadas por RT-PCR, imuno-histoquímica e ensaio western blot. FOXL1 expressão em linhas celulares GBC foi regulada para cima por transfecção com pcDNA-FOXL1. Os efeitos da sobre-expressão FOXL1 sobre a proliferação celular, apoptose, migração e invasão foram avaliadas in vitro ou in vivo. Além disso, o estatuto dos mediadores envolvidos na migração, invasão e a apoptose foi analisada utilizando Western blot após transfecção com pcDNA-FOXL1.

Resultados

FOXL1 foi frequentemente regulados negativamente em tecidos e linhas celulares GBC. Sua expressão mais elevada está associada com melhor prognóstico, enquanto que a sua menor expressão está correlacionada com o estádio TNM avançada e pobre diferenciação. FOXL1 sobreexpressão em células NOZ suprime significativamente a proliferação celular, migração e invasão in vitro e a tumorigenicidade em ratinhos nus. FOXL1 superexpressão interrompido transmembrana mitocondrial potencial e desencadeou a apoptose mediada por mitocôndrias nas células NOZ. Além disso, FOXL1 superexpressão suprimida ZEB1 expressão e induzida expressão de E-caderina nas células NOZ.

Conclusão

Nossas descobertas sugerem que FOXL1 desregulado está envolvido na tumorigênese e progressão da GBC e pode servir como um preditor de desfecho clínico ou mesmo um alvo terapêutico para pacientes com GBC

Citation:. Qin Y, W Gong, Zhang M, Wang J, Tang Z, Quan Z (2014) forkhead Box L1 é regulada negativamente frequentes na vesícula biliar câncer e inibe celular Crescimento através da apoptose indução por Disfunção mitocondrial. PLoS ONE 9 (7): e102084. doi: 10.1371 /journal.pone.0102084

editor: Alejandro H. Corvalan, Pontificia Universidad Catolica de Chile, Faculdade de Medicina, Chile

Recebido: 10 Janeiro, 2014; Aceito: 14 de junho de 2014; Publicação: 10 de julho de 2014

Direitos de autor: © 2014 Qin et al. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Licença Creative Commons Attribution, que permite uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o autor original ea fonte sejam creditados

Financiamento:. Este estudo foi apoiada pela National Science Foundation Natural da China (No. 81272747 e No. 81.372.642). Os financiadores não tiveram nenhum papel no desenho do estudo, coleta de dados e análise, decisão de publicar ou preparação do manuscrito

CONFLITO DE INTERESSES:.. Os autores declararam que não existem interesses conflitantes

Introdução

câncer de vesícula biliar (GBC), que representa o tipo mais comum e agressivo entre neoplasias do trato biliar é caracterizada pela apresentação não-específico, o diagnóstico tardio ea falta de um tratamento eficaz. Apesar de avanços recentes foram feitas no diagnóstico e tratamento, os resultados das terapias atuais, tais como cirurgia, quimioterapia e radioterapia (sozinho ou combinado) têm provado ser sombrio. Ela está associada a um prognóstico ruim, com duração média de sobrevivência de 4 meses [1] e taxa de sobrevida de 5 anos menos de 10% [2]. Por conseguinte, existe uma necessidade urgente de desenvolver novos regimes de terapia e eficazes para pacientes GBC. No entanto, o conhecimento limitado sobre tumorigênese do câncer de vesícula biliar impede o desenvolvimento de diagnóstico e tratamento para GBC. Uma melhor compreensão da biologia molecular e mecanismos subjacentes cancerígenas desenvolvimento e progressão de GBC pode ajudar a estabelecer tratamentos mais eficazes.

caixa de forkhead (Fox) de proteínas são uma super família de factores de transcrição que partilham um altamente conservado de ligação a DNA- domínio (caixa forkhead ou domínio de hélice alado) controlar uma variedade de processos biológicos, incluindo o metabolismo, diferenciação, proliferação e apoptose [3]. Desde que as proteínas FOX regular esses processos vitais no crescimento e desenvolvimento, um ganho ou perda de função FOX sem surpresa provoca doenças genéticas humanas, incluindo câncer. A desregulação de várias subfamílias FOX como FOXO, FOXM, FOXP, FOXC e FOXA está implicado na tumorigênese e progressão de certos tipos de câncer [4]. Embora proteínas FOX compartilhar o domínio de ligação de DNA altamente conservado, a sua regulação e função variam significativamente entre as famílias. proteínas FOX têm diversas funções e atuar como supressores tumorais ou oncogenes durante tumorigênese e progressão de vários cancros. Por exemplo, FOXO1 actua como um supressor de tumores que pode induzir a paragem do ciclo celular e a apoptose em células cancerosas [5]. Em contraste com FOXO1, FOXM1 mostra actividades oncogénicos e segmentação FOXM1 induz a apoptose em células [6] cancerosas. Um crescente corpo de evidências tem demonstrado convincentemente que as proteínas FOX podem representar alvos atraentes para intervenção terapêutica contra muitos tipos de câncer.

proteína FOXL1 é um membro da FOX superfamília que foi inicialmente descoberto no mesênquima do trato gastrointestinal. Até agora, a relação entre FOXL1 e cancro gastrointestinal incluindo o estômago, cólon e pâncreas foi investigado em vários estudos [7] – [8]. No entanto, a função biológica da FOXL1 em ​​GBC continua a ser elucidado. No presente estudo, investigamos o significado da expressão FOXL1 em ​​pacientes com GBC em relação às características clínicas e prognóstico. Também conduzimos estudos funcionais para avaliar os efeitos da sobre-expressão FOXL1 sobre a proliferação, a apoptose, a migração e a invasão de células GBC in vitro ou in vivo. Além disso, nós preliminar investigaram a expressão da caderina-E e Zinco-dedo E-box vinculativo homeobox 1 (ZEB1), o que pode contribuir para os efeitos inibitórios de FOXL1 superexpressão em GBC.

Materiais e Métodos

Ética declaração

os experimentos envolvendo animais humanos e foram aprovados pelo hospital Comitê de Ética da Xinhua, Shanghai Jiaotong University School of Medicine. consentimentos informados por escrito foram obtidas de todos os pacientes.

Pacientes e tecido coleção

35 de pacientes com GBC (13 homens e 22 mulheres, com idades de 51-71 anos, com idade média de 61,9 ± 5,4 anos ) tratados com colecistectomia radical (sem radioterapia prévia ou quimioterapia) entre 2008 e 2013 no Departamento de cirurgia geral do Hospital Xinhua, Shanghai Jiaotong University School of Medicine, foram incluídos neste estudo. Amostras do tumor (n = 35) e amostras não tumorais adjacentes (n = 12) foram recolhidos imediatamente após a cirurgia e imerso em azoto líquido. De acordo com o sistema TNM (AJCC, 7

th, 2010), os tumores foram encenadas (4 estágio I, 12 estágio II, 14 estágio III e 5 estágio IV). O grau de diferenciação de acordo com critérios da OMS foi a seguinte: 13 casos foram bem diferenciados (WD), 15 moderadamente diferenciado (MD) e 7 pouco diferenciado (PD). O diagnóstico histológico de todos GBC foi confirmada por dois patologistas.

Imunohistoquímica

amostras de tecidos congelados foram incorporados na temperatura de corte ideal composto (OCT). 5 mícrons de espessura secções de tecido de tumores e tecidos não tumorais foram cortados a partir de blocos de tecido, e em seguida fixadas em acetona fria a 4 ° C durante 20 minutos. As secções de tecido foram incubadas com 3% (v /v) H

2O

2 em metanol para eliminar a actividade da peroxidase endógena e depois bloquearam-se com soro de cabra normal. Depois disso, as secções foram processadas para imuno-histoquímica utilizando anticorpos contra FOXL1 (diluição 1: 100; Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA) e o anticorpo secundário (diluição 1: 500; Santa Cruz Bio). Finalmente, as secções foram incubadas com o complexo de peroxidase e visualizados por tetracloreto de 3,3′-diaminobenzidina (DAB). Todas as secções foram analisados ​​por dois patologistas independentes. A intensidade foi avaliada utilizando um sistema 3-escala (0, negativa; 1, fraco, 2, moderada; 3, forte). A positividade cento também foi avaliada usando um sistema de 3-escala (0, 5%; 1, 5% -25%; 2, 25% -50%; 3, 50%). A quantificação geral de pontuação imunohistoquímica foi calculado multiplicando a pontuação de intensidade de coloração e pontuação da percentagem de células positivas. Os níveis de expressão FOXL1 foram classificados da seguinte forma: – (escore 0-1), + (escore 2-3), ++ (escore 4-6) e +++ (score 6). De acordo com a pontuação dos FOXL1 imunocoloração, os pacientes GBC foram classificados em dois grupos: baixa expressão (- ou +) e de expressão alta (++ ou +++)

linhas de células e condições de cultura

quatro linhas de células humanas GBC GBC-SD, a SGC-996, e NOZ OCUG-1 foram usados ​​neste estudo. linha de células GBC-SD foi comprado de Cell Bank da Academia Chinesa de Ciências, Xangai, China; linha de células SGC-996 [9] foi fornecida por Tumor Cell Biology Research Institute da Universidade de Tongji, Shanghai, China; NOZ e OCUG-1 linhas celulares foram adquiridos a partir da ciência da saúde Investigação Recursos Bank, Osaka, Japão. As células foram cultivadas quer em DMEM ou RPMI1640 (Invitrogen, Carlsbad, CA, EUA) suplementado com 1% de penicilina /estreptomicina (Invitrogen) e 10% (v /v) de soro fetal bovino (Hyclone, Logan, UT, EUA) a 37 ° C C em um umidificado CO 5%

2 incubadora.

transfec�es

Para upregulate a expressão de FOXL1, pcDNA-FOXL1 (codifica cDNA FOXL1) foram construídos e transfectado em células do GBC. O vector pcDNA3.1 vazio (Invitrogen) foi utilizado como controlo. A clonagem mapas estratégicos e de restrição de plasmídeos recombinantes foram mostrado na Figura S1. O reagente de transfecção Lipofectamine 2000 foi utilizado durante a transfecção de acordo com as instruções do fabricante (Invitrogen). Para obter transfectantes estáveis, o meio foi substituído por meio completo fresco suplementado com 300 ug /mL de geneticina (G418), após 48 horas de transfecção. O meio selectivo foi actualizada a cada 3-4 dias até os clones resistentes a G418 podem ser identificados. Os níveis de expressão FOXL1 em ​​linhas de células foram examinados através de RT-PCR e ensaio Western blot.

Isolamento de ARN e análise de RT-PCR

O ARN total foi extraído de amostras de tecido congelado e linhas celulares GBC usando Trizol reagentes do kit (Gibco BRL, Gaithersburg, MD, EUA). Os ARN foram convertidos em ADNc utilizando um kit de PCR de ARN Takara (Takara Bio Inc., Dalian, China). O ADNc obtido foi amplificado utilizando os seguintes procedimentos: 94 ° C (5 min), depois 30 ciclos a 94 ° C (30 s), 59 ° C (45 s), 72 ° C (45 s). As sequências dos iniciadores para FOXL1 foram as seguintes: Sentido: cacggtactccacttccagt; Anti-sentido:. Aacacttccctgaacccaca

A viabilidade celular e ensaios de formação de colónias

Água tetrazólio solúvel (WST) -1 ensaio foi realizado para medir a viabilidade das células após a transfecção. 5 × 10

3 de células transfectadas por poço foram semeadas em placas de 96 poços e cultivadas durante 24, 48, 72, ou 96 h. Depois, as células foram então incubadas com o reagente WST-1 durante 2 horas a 37 ° C. A absorvância a 450 nm foi medida com o uso de um leitor de microplacas automático (Bio-Rad 5 Modelo 550, Bio-Rad, Hercules, CA, EUA) e a curva de crescimento foi calculada.

Para o ensaio de formação de colónias , 1 × 10

3 de células transfectadas por poço foram semeadas em placas de 6 poços e cultivado em meio completo a 37 ° C. Após 14 dias de cultura, as colónias foram coradas com violeta de cristal e o número de colónias foi contado por automatizado contador de colónias (Alpha Innotech, San Leandro, CA, EUA).

xenoenxertos experimentos tumorais

xenoenxertos subcutâneos em ratinhos nus foram realizados para avaliar os efeitos da sobre-expressão FOXL1 sobre o crescimento celular e a tumorigenicidade in vivo. (Nu /nu) ratos nus masculinos e femininos at�icos 6-8 semanas de idade foram obtidos a partir de Xangai Laboratório Central de animal de Ciências da Academia Chinesa e alojados sob condição específica livre de patógenos (SPF). NOZ células foram estavelmente transfectadas com pcDNA-FOXL1 ou pcDNA3.1. Cerca de 1 × 10

7 de células que sobre-expressam FOXL1 ou células de controlo foram suspensas num volume total de 200 uL de 1/1 (v /v) de PBS /Matrigel (BD Biosciences, San Diego, CA, EUA) e, em seguida injectados subcutaneamente nos flancos dos ratos. Cerca de 4 semanas após a injecção das células tumorais, os volumes dos tumores subcutâneos visíveis foram medidos semanalmente com pinças e os volumes dos tumores em cada grupo foram calculadas utilizando a fórmula: volume = comprimento x largura

2/2. Todos os ratinhos foram sacrificados após 6 semanas de observação. tumores de xenoenxerto foram fixados em formalina e embebidos em parafina. O peso do tumor foi medido e registado.

análise citométrica de fluxo da apoptose

A apoptose de células in vitro foi determinada por citometria de fluxo utilizando anexina V-FITC Apoptosis Detection Kit (BD Bioscience) de acordo com o fabricante do protocolo. Resumidamente, 24, 48 e 72 h após transfecção com pcDNA-FOXL1 ou pcDNA3.1, as células foram colhidas, lavadas com PBS e ressuspensas em 1 × tampão de ligação. Depois, as células foram coradas com FITC-anexina V e PI, durante 15 min e analisada por citometria de fluxo.

TUNEL ensaio

Apoptose em secções de tecido a partir de tumores de xenoenxerto foi avaliada pelo terminal desoxinucleotidilo transferase dUTP nick marcação terminal (TÚNEL) coloração utilizando Em kit de detecção da morte celular in situ, de fluoresceína (Roche Diagnostics, Mannheim, Alemanha) seguindo o protocolo do fabricante. Resumidamente, as amostras de tumor xenoenxerto foram desparafinadas com xileno e etanol. As secções de tecido foram incubadas com uma solução de proteinase K, durante 15 min, seguido por incubação com mistura de reacção de TÚNEL. Em seguida as secções de tecido foram incubadas com conversor-POD e contrastadas com 4 ‘, 6-diamidino-2-fenilindole (DAPI). A fluorescência foi visualizada por microscopia de fluorescência usando filtros de excitação e emissão adequados.

análise citométrica de fluxo da membrana mitocondrial potencial

A alteração em potencial transmembranar mitocondrial foi determinada por cytomery fluxo utilizando o potencial de membrana mitocondrial sensível corante fluorocromo JC-1. Resumidamente, as células foram colhidas NOZ 24, 48 e 72 h após a transfecção com pcDNA-FOXL1 ou pcDNA3.1 e lavadas com PBS. As células foram incubadas com JC-1 (10 ug /ml em PBS) a 37 ° C durante 10 min. As células coradas foram lavadas duas vezes com PBS e analisadas por citometria de fluxo.

mitocondrial e preparação de extracto citosólico

Os valores de citocromo c mitocondrial e citosólica citocromo c foram determinados utilizando o extracto mitocondrial e extracto citosólico respectivamente. Mitocondrial e fracções citosólicas foram extraídas a partir de células cultivadas por mitocôndrias /Citosol Fraccionamento Kit (Abcam, Cambridge, Reino Unido) de acordo com o protocolo do fabricante. Resumidamente, depois lavadas com PBS arrefecido em gelo, as células transfectadas foram incubadas com tampão de extracção citosol mistura contendo ditiotreitol (DTT) e inibidores de protease em gelo durante 10 min. As células foram homogeneizadas suavemente, utilizando um homogeneizador de vidro arrefecida com gelo. A suspensão de células foi centrifugada a 3000 rpm a 4 ° C durante 10 min. Os sobrenadantes foram novamente centrifugadas a 13.000 rpm durante 30 minutos para separar as mitocôndrias intactas (pellets) e fracção citosólica (sobrenadantes). Os peletes foram ressuspender com 100 ul de tampão de extracção mitocondrial mistura contendo inibidores de protease e DTT e agitada em vórtice durante 10 segundos. A mistura foi guardada como fração mitocondrial.

ensaio Western blot

As proteínas totais foram extraídas de células NOZ 48 h após transfecção com pcDNA-FOXL1 ou pcDNA3.1. O teor de proteína foi quantificado por ensaio de proteína de Bradford. 40 ug de proteína foi separada por 10-12% de SDS-PAGE e electrotransferidas para membranas de PVDF (Millipore, Billerica, MA, EUA). A membrana foi bloqueada com leite em pó magro a 5%, e sondados com os anticorpos primários (Santa Cruz bio) durante a noite a 4 ° C, seguido por incubação com anticorpos secundários acoplados com peroxidase de rábano (Bio Santa Cruz) correspondente. actividade de peroxidase de rábano foi visualizado usando quimioluminescência aumentada (ECL) Kit (Pierce, Rockford, IL, EUA) e expostos a X-OMAT-Azul filme (Kodak, Rochester, NY, EUA).

A migração celular e invasão ensaio

a migração celular e ensaio de invasão foram realizadas utilizando um Transwell de 24 cavidades câmara (Corning Inc., Corning, NY, EUA) com poros de 8 um de acordo com o protocolo do fabricante. As células transfectadas foram semeadas na (ensaio de migração) ou não revestido (ensaio de invasão) revestidas com matrigel compartement câmara superior com RPMI 1640 isento de soro. RPMI1640 suplementado com soro fetal bovino a 10% foram colocados em câmaras inferiores como quimioatractor. 24 h após a incubação, as células no lado superior da membrana de filtro foram removidas com um cotonete. As células que aderem à superfície inferior da membrana foram fixadas com paraformaldeído a 4% durante 30 minutos e, em seguida, coradas com violeta de cristal durante 20 minutos.

A análise estatística

Os dados foram apresentados como a média ± SD . A análise estatística foi realizada com SPSS 11.0 (SPSS Inc, Chicago, IL, EUA). As diferenças entre os grupos foram avaliadas por meio do teste t de Student ou ANOVA unidirecional ou Kaplan-Meier log-rank ou o teste do qui-sqaured. A significância estatística foi definida como P . 0,05

Resultados

expressão FOXL1 em ​​GBC e sua relação com variáveis ​​clínico-patológicas

FOXL1 mRNA e proteína foram examinadas em tecidos tumorais e não tumorais tecidos por RT-PCR, a análise de western blot e imuno-histoquímica, respectivamente. Como mostrado na Figura 1A e B, o ARNm FOXL1 e os níveis de proteína foram reduzidas em tecidos de cancro, em comparação com os tecidos não tumorais correspondentes. Além disso, 2 de amostras tumorais não têm expressão de mRNA FOXL1 e 3 de amostras de tumores não têm expressão da proteína.

(A) a expressão do mRNA FOXL1 em ​​tecidos GBC e combinados não tumorais tecidos. T: tecidos GBC; N, combinado tecidos não tumorais. a expressão da proteína FOXL1 (B) em tecidos e tecidos não tumorais GBC correspondentes. Análise (C) imunohistoquímica do FOXL1 em ​​tecidos GBC e combinados não tumorais tecidos. A ampliação é de 200 × e a barra de escala é de 50 mm. A: A coloração positiva de FOXL1 em ​​tecidos não tumorais; b: A coloração positiva de FOXL1 em ​​tumores bem diferenciados (WD); C: coloração positiva de FOXL1 em ​​tumores moderadamente diferenciadas (MD); d: coloração positiva de FOXL1 em ​​tumores (PD) pobres diferenciados; (D) Resultado do IHC de tecidos e tecidos não tumorais GBC (p 0,05). pontuação (E) IHC da fase inicial TNM (I e II) tumores e fase tardia TNM (III e IV) tumores (P 0,05). pontuação (F) IHC de tumores WD e tumores MD + Pd (P 0,05). curvas (L) de Kaplan-Meier com base nos níveis de expressão por imuno-histoquímica em FOXL1 GBC. Os pacientes com elevada expressão de FOXL1 ter um melhor resultado em comparação com aqueles com baixa expressão de FOXL1 (P 0,05). (H) A expressão de mRNA e proteína de FOXL1 em ​​GBC-SD, SGC996, NOZ e linhas celulares OCUG-1. (I) A transfecção com pcDNA-FOXL1 restaurado expressão de células FOXL1 em ​​NOZ. * Indica diferença significativa.

A análise imunohistoquímica mostrou que a proteína FOXL1 foi localizada principalmente em nuclear de células cancerígenas e as células epiteliais normais (Figura 1C). FOXL1 proteína foi expressa abundantemente nos tecidos normais, mas foi relativamente menos expresso em tecidos de cancro. A pontuação de imunocoloração FOXL1-positiva em tecidos GBC foi muito menor do que em tecidos normais (p 0,05, Figura 1D). FOXL1 expressão foi significativamente mais elevada em tumores com fase anterior (I e II), em comparação com aqueles com fase tardia (III e IV) (P 0,05, Figura 1E). Diferença na pontuação da imunocoloração FOXL1-positivo também foi medido entre os graus de tumor (WD vs PD + MD) e foi encontrado para ser significativa (P 0,05, Figura 1F), com pontuações FOXL1 maior nos grupos WD. Além disso, um maior nível de expressão do gene FOXL1 foi associada a um melhor prognóstico. (P 0,05, Figura 1G)

linhas celulares

O endógena FOXL1 ARNm e proteína foram detectáveis ​​em GBC-SD, SGC996 e OCUG-1 , mas não na linha celular de NOZ, que é, portanto, escolhido para experiências posteriores (Figura 1H). Transfecção com pcDNA-FOXL1 restaurou os níveis de mRNA e de proteína de FOXL1 em ​​linha celular NOZ (Figura 1-I).

FOXL1 superexpressão suprime a proliferação da linha de células NOZ in vitro e in vivo

O in vitro efeito da sobreexpressão FOXL1 sobre a proliferação e crescimento de células NOZ foi avaliada por ensaio de WST-1. A sobre-expressão da proliferação celular significativamente inibida em células FOXL1 NOZ (P 0,05; Figura 2A). E esta inibição do crescimento era dependente do tempo

(A) o crescimento de células NOZ foi significativamente inibida, após transfecção com pcDNA-FOXL1 (P 0,05).. (B) A formação de colónias por células NOZ. Os resultados apresentados são representativos de três experiências. (C) A transfecção com pcDNA-FOXL1 reduziu significativamente o número de colónias em células NOZ (P 0,05). (D e E) FOXL1 superexpressão reduziu o volume e o peso do tumor de xenoenxerto (P 0,05). * Indica diferença significativa.

Os efeitos inibidores mais longo prazo de FOXL1 superexpressão sobre a proliferação celular foi avaliada pelo ensaio de formação de colónias. Uma diminuição significativa no número de colónias foi observada em células que sobre-expressam FOXL1 em ​​comparação com células de controlo (p 0,05, Figura 2B e C).

Para investigar ainda mais o papel da FOXL1 carcinogénese e o crescimento do GBC in vivo, xenoenxertos em ratinhos nus foram estabelecidos por implantação subcutânea de FOXL1 superexpressando e células de controlo. Os xenoenxertos formados por células que sobre-expressam FOXL1 cresceram a uma taxa muito mais lenta do que os que são formados por células de controlo. FOXL1 sobreexpressão in vivo induziu uma redução significativa tanto o volume do tumor (P 0,05, Figura 2D) e o peso do tumor (P 0,05, Figura 2E). Estas descobertas sugerem que FOXL1 suprime o crescimento de células GBC tanto in vitro como in vivo.

FOXL1 superexpressão apoptose promovida na linha celular NOZ in vitro e in vivo

A indução de apoptose por sobre-expressão em FOXL1 vitro e in vivo foi examinada utilizando anexina V /PI e ensaio TUNEL, respectivamente. Como mostrado na Figura 3A e B, um aumento significativo na percentagem de células apoptóticas (NOZ apoptose precoce além de apoptose tardia) foi observada após transfecção com pcDNA-FOXL1 (P 0,05). E a proporção de apoptose tardia ou células necróticas aumentou de uma forma dependente do tempo (iniciado a partir de 24 horas e atingiu o pico a 72 h).

(A), a apoptose de células NOZ in vitro foi examinada por Anexina V /PI coloração dupla. As células que coram negativo tanto para anexina V e PI são células viáveis ​​(canto inferior esquerdo). As células que coram positivo para anexina V e negativo para PI são submetidos a apoptose precoce (inferior direito). As células que coram positivo para ambos Anexina V e PI são quer na fase final da apoptose, ou a sofrer necrose (canto superior direito). Os resultados apresentados são representativos de três experiências. (B) O número de células apoptóticas (NOZ, incluindo a apoptose precoce, tardia de apoptose e necrose) foi significativamente aumentada após transfecção com pcDNA-FOXL1 (P 0,05). (C) A apoptose de NOZ células in vivo foi determinada utilizando o ensaio TUNEL. As células apoptóticas são visualizados como células fluorescentes verdes intensamente. O número de células em apoptose foram contabilizados em campos de alta potência (400 ×). Localização em núcleos foi visualizada por contracoloração com DAPI (azul). (D) FOXL1 superexpressão promoveu significativamente a apoptose de células in vivo NOZ (P 0,05). * Indica diferença significativa.

TUNEL mostrou que FOXL1 superexpressão promoveu a apoptose de células noz em tumores de xenoenxerto. Havia menos células TUNEL positivo em tumores de xenoenxerto formados por células de controlo. Em contraste, o número médio de células de TUNEL-positivas aumentou significativamente em tumores de xenoenxerto formados por células que sobre-expressam FOXL1 (P 0,05, Figura 3C e D)

FOXL1 sobre-expressão induzida por despolarização transmembranar mitocondrial e apoptose citocromo c mediada por

perda de potencial de membrana mitocondrial (ΔΨm) indica o início e a activação de cascatas de alguns apoptóticas. No presente estudo, foi examinada por ΔΨm JC-1 coloração. Perda de ΔΨm foi determinada pela alteração na fluorescência de JC-1 a partir de vermelho para verde. Como mostrado na Figura 4A e B, a percentagem de células de fluorescência positiva vermelhos diminuiu enquanto a proporção de células de fluorescência positiva verdes aumentou após transfecção com pcDNA-FOXL1 (P 0,05), sugerindo FOXL1 sobre-expressão induzida por uma aparente diminuição do potencial de membrana mitocondrial .

(a) a perda de potencial de membrana mitocondrial (ΔΨm) é indicada por uma diminuição no rácio de intensidade de fluorescência vermelho /verde. eixo X indica a intensidade de fluorescência verde; eixo Y indica a intensidade de fluorescência vermelha. Os resultados apresentados são representativos de três experiências. (B) A proporção de células positivo de fluorescência-vermelhos diminuiu enquanto a proporção de células de fluorescência verde-positivas aumentou após transfecção com pcDNA-FOXL1 (P 0,05). (C) análise de transferência de Western mostrou que o nível de citocromo c citossólico marcadamente aumentada, enquanto que o nível de citocromo c mitocondrial diminui acentuadamente. (D) Os níveis de caspase-9 clivada, 3 e PARP e Bax foram elevados, enquanto que o nível de Bcl-2 foi diminuído. * Indica diferença significativa.

mitocondrial e citosólica citocromo c foi examinado pelo ensaio de western blot. O nível de citosólica citocromo c foi marcadamente elevada, enquanto que o nível de citocromo c mitocondrial foi marcadamente diminuída 48 h após transfecção com pcDNA-FOXL1, o que sugere que a sobre-expressão FOXL1 promoveu a libertação do citocromo c das mitocôndrias para o citosol (Figura 4C). Citocromo c oxidase subunidade IV (Cox IV) e β-actina foram utilizados como controlo para a proteína mitocondrial e proteína citosólica, respectivamente. Além disso, verificou-se pcDNA-FOXL1 induziu um aumento do rácio da Bax /Bcl-2, o que pode provocar a libertação de citocromo c das mitocôndrias para o citosol.

Os efeitos da sobre-expressão FOXL1 sobre a activação de caspases em células foi NOZ ainda analisada por Western blot. Descobrimos que a clivagem de caspase-9 e foi -3 aumentou significativamente 48 h após transfecção com pcDNA-FOXL1. Além disso, a clivagem de poli (ADP) polimerase -ribose (PARP) que é a marca de apoptose também foi aumentada notavelmente após transfecção com pcDNA-FOXL1 (Figura 4D). Estes achados sugerem que FOXL1 superexpressão activado cascatas caspase em células NOZ.

FOXL1 suprimida a migração e invasão das células NOZ e induziu a expressão da caderina-E

Uma vez que a associação de expressão FOXL1 com o estágio clínico e Linfonodo metástase do GBC tinha sido demonstrado acima, é expectedly que FOXL1 pode desempenhar um papel na migração e invasão do GBC. Portanto, o próximo avaliado o papel da FOXL1 na migração e invasão de GBC. Como mostrado na Figura 5A-C, transfecção com pcDNA-FOXL1 induziu um decréscimo significativo no número de células NOZ migratórias e invasivas, em comparação com os grupos de controlo (P 0,05), sugerindo FOXL1 superexpressão prejudicou as capacidades migratórias e invasivos de células NOZ . Além disso, encontramos o nível de proteína E-caderina foi elevada significativamente 48 h após a transfecção com pcDNA-FOXL1, enquanto o nível de proteína ZEB1 foi significativamente reduzida (Figura 5D).

(A) O número de migratória e invasiva células coradas com violeta de cristal refletia sua capacidade migratória e invasiva. Os números de células NOZ migratórias ou invasivas por campo visual foram contados sob microscópio após a coloração violeta cristal (× 100). A transfecção (C e B) com pcDNA-FOXL1 migração significativamente inibida e invasão de células NOZ (P 0,05). (D) Expressão ZEB1 foi suprimida e expressão de E-caderina foi induzida pela sobre-expressão FOXL1. * Indica diferença significativa.

Discussão

Os papéis dos membros da família forkhead como Foxos, FOXMs e FOXPs em cancros têm sido amplamente investigadas. No entanto, existem poucas pesquisas sobre a regulação e função dos FOXL1 em ​​cancros. No presente estudo, o papel de FOXL1 no crescimento, apoptose, migração e invasão da célula GBC foi preliminarmente estudada. Achamos que os níveis de mRNA e proteína FOXL1 foram significativamente menores nos tecidos do GBC, em comparação com os tecidos não tumorais correspondentes. Além GBC, um declínio na expressão de FOXL1 também foi observada por outros pesquisadores em tumores pancreáticos [10], [11]. Além disso, a expressão FOXL1 foi negativamente correlacionada com o estádio TNM avançada e pobre diferenciação de GBC. Além disso, uma expressão FOXL1 maior foi associado com melhor prognóstico em pacientes submetidos à cirurgia para GBC. Estas descobertas sugerem que downexpression de FOXL1 pode estar envolvido na tumorigénese e na progressão da GBC e FOXL1 pode servir como um bom preditor de prognóstico para os doentes submetidos a cirurgia. Resultados similares também foram observadas no mieloma e cancro pancreático [8], [12]. No entanto, os mecanismos para downexpression de expressão FOXL1 nestes cancros ainda não foram elucidados. Vários mecanismos tais como a deleção cromossómica [13], as translocações cromossómicas [14], [15], metilação do promotor [16], a alteração em reguladores a montante [17], [18] e as modificações pós-traducionais [4] Demonstrou-se que contribuem a desregulamentação dos fatores Fox. Com base nos nossos resultados, é difícil dizer qual o mecanismo foi responsável pela regulação negativa da FOXL1 em ​​GBC. Outras investigações sobre os mecanismos genéticos e epigenéticos para a expressão do gene FOXL1 desregulamentado devem ser realizados para esclarecer a questão.

A correlação de maior expressão FOXL1 com estágio inicial e melhor prognóstico sugeriu seu papel supressiva potencial no crescimento celular GBC e progressão. Portanto realizou-se uma série de estudos funcionais para avaliar o efeito de FOXL1 sobre o crescimento, a apoptose, migração e invasão da linha celular GBC.

A sobre-expressão de FOXL1 crescimento significativamente inibida de noz em células in vitro e in vivo, e esta inibição de crescimento pode ser atribuída à indução de apoptose por sobre-expressão FOXL1. A apoptose é um processo biológico envolvendo uma série geneticamente programada de eventos que conduzem à morte da célula. Durante este processo, vários eventos chave ocorrem na mitocôndria, incluindo a libertação de citocromo c das mitocôndrias para o citoplasma e a perda de potencial mitocondrial transmembranar (ΔΨm) [19], [20]. ΔΨm é um parâmetro importante da função mitocondrial e tem sido utilizado como um indicador de células viáveis. família Bcl-2 que consiste em membros apoptóticos e anti-apoptóticos pró-regula a via de apoptose mitocondrial, controlando a permeabilização da membrana mitocondrial externa e a abertura de canal dependente da voltagem anião (VDAC). proteína pro-apoptótica, tal como Bax acelera a abertura de VDAC, enquanto que a proteína anti-apoptótica de Bcl-X (L) fecha VDAC ligando-se a ele directamente. Aumento na proporção de Bax /Bcl-2 podem levar a perturbações de ΔΨm e abertura de VDAC. Subsequentemente, citocromo c mitocondrial pode translocar para o citosol através VDAC e iniciar o processo de apoptose [21].