Abstract

O objetivo do estudo é identificar mudanças de perfil de N-glicanos associados com câncer gástrico e explorar o impacto do core-fucosila�o on biológica comportamentos de células cancerosas gástricas humanas. Um total de 244 indivíduos, incluindo câncer gástrico, úlcera gástrica e controle saudáveis ​​foram recrutados. perfil de N-glicanos de proteínas de soro e nos tecidos gástricos totais foi analisada por electroforese capilar assistida por fluoróforo assistida-sequenciador de ADN. A abundância de resíduos totais fucosilado-core e a expressão de enzimas envolvidas no núcleo-fucosilação foram analisados ​​com mancha de lectina, reacção inversa quantitativa em cadeia de polimerase, western blot, coloração imuno-histoquímica e coloração com lectina-histoquímica. Os plasmídeos recombinantes de transportador de GDP-fucose e α-1,6-fucosiltransferase (FUT8) foram construídos e transfectados em linhas celulares de cancro gástrico BGC-823 e SGC-7901. CCK-8 e o ensaio de cicatrização de feridas foram utilizados para avaliar o impacto da modulação funcional núcleo-fucosilação sobre a proliferação e migração celular. perfis de soro característica de N-glicanos foram encontrados em câncer gástrico. Comparado com o controle saudável, uma estrutura abundância trianntenary, pico 9 (NA3Fb), foi significativamente aumentada no cancro gástrico, enquanto a abundância total de resíduos fucosilado-core (sumfuc) foi diminuída. estruturas fucosilado-core, peak6 (NA2F) e peak7 (NA2FB) foram falecido em tecidos tumorais gástricas quando comparada com a de tecidos não tumorais adjacentes. Consistentemente, aglutinina de Lens culinaris (LCA) liga�o ao proteínas foram diminuiu significativamente em soros de cancro gástrico, e o nível de proteína de FUT8 diminuiu significativamente em tecidos de tumor gástrico em comparação com o que em tecidos não tumorais adjacentes. Regulação positiva do PIB-Tr e FUT8 poderia inibir a proliferação, mas não teve influência significativa sobre a migração de BGC-823 e as células SGC-7901. Core-fucosila�o é regulada negativamente no câncer gástrico. A sobre-regulação de núcleo-fucosilação poderia inibir a proliferação das células de cancro gástrico humano

citação:. Zhao Y-P, Xu X-Y, Fang M, Wang H, Q Você, Yi C-H, et al. (2014) Diminuição do Núcleo-fucosila�o Contribui para malignidade em câncer gástrico. PLoS ONE 9 (4): e94536. doi: 10.1371 /journal.pone.0094536

editor: Salvatore V. Pizzo, Duke University Medical Center, Estados Unidos da América

Recebido: 19 Agosto, 2013; Aceito: 17 de março de 2014; Publicação: 14 de abril de 2014

Direitos de autor: © 2014 Zhao et al. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Licença Creative Commons Attribution, que permite uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o autor original ea fonte sejam creditados

Financiamento:. O estudo foi apoiada pela National Science Foundation Natural da China (No. 81201697, 81101639 e No. 81271925); Ciência e Tecnologia da Comissão, de Xangai Município (No. 10ZR1439100 e No. 11JC1416400) .Os financiadores não tiveram nenhum papel no desenho do estudo, coleta de dados e análise, decisão de publicar ou preparação do manuscrito

Competir interesses.: os autores declararam que não existem interesses conflitantes

o câncer gástrico Introdução

(GC) é o quarto câncer mais comum ea segunda causa mais comum de morte relacionada com câncer em todo o mundo [1]. – [3], particularmente prevalente em muitos países asiáticos, especialmente a China [4]. a glicosilação de proteínas é uma das modificações pós-tradução mais comuns feitas às proteínas [5]. Glicanos podem ser ligados a proteínas, quer através de um grupo amida (glicosilação N-ligada) ou um grupo hidroxilo (glicosilação ligada), que ocorrer por meio de vias biossintéticas diferentes e potencialmente têm funções independentes [6]. glicosilação ligada a N desempenha papéis fundamentais em muitos processos biológicos, tais como a adesão celular, a migração celular, e a transdução de sinal [7]. A expressão anormal de glicoproteínas ligados a N, tem sido observada em várias doenças [8] – [10]. Após a caracterização em profundidade de glicoproteínas N-ligados e as alterações de glicosilação associado à doença, vários métodos têm sido desenvolvidos. Em nosso estudo anterior, nós identificamos alguns marcadores N-glicano em carcinoma heptatocellular (HCC) e cancro do cólon usando um eletroforese capilar baseada chamado DNA eletroforese capilar assistida por fluoróforo assistida-sequenciador (DSA-FACE) [11]. Além disso, tem sido relatado que α-1, 6-fucosiltransferase actividade e expressão (FUT8) é aumentada em vários cancros humanos, o que sugere um papel para esta enzima no desenvolvimento e progressão do tumor, tais como o HCC [12], o cancro colo-rectal [ ,,,0],13], o cancro do pulmão de células nonsmall [14] e adenocarcinoma seroso do ovário [15]. Altered núcleo-fucosilação é um dos mais importantes modificação glicosilada anormal identificada em malignidades. FUT8 catalisa a transferência de fucose a partir de guanosina-difosfato (GDP) -fucose ao GlcNAc mais interna de híbridos e complexos oligossacáridos ligados a N, através de uma α-1,6-ligação, resultando em glicoproteínas fucosilado de núcleo [16] – [17] e alterar a função biológica das glicoproteínas resultantes [18]. Embora muitos estudos têm relatado a associação entre o core-fucosila�o alterada e outros tumores agressivos, a nosso conhecimento, a influência do core-fucosila�o em câncer gástrico permanece desconhecida. Neste estudo, analisou-se perfis de N-glicanos com DSA face em ambas as amostras de soro de cancro gástrico, úlcera gástrica, controlos saudáveis ​​e proteínas do tecido a partir de tumores e tumores não-adjacentes. Em seguida, estender a pesquisa funcional sobre os glicosila�es específicas identificadas.

Materiais e Métodos

Ética Declaração

O protocolo de estudo foi aprovado pelo Comitê de Ética em chinês dos Recursos Humanos na Segunda Universidade médica militar. Todos os participantes do estudo desde consentimento informado por escrito.

População do estudo

No total, 105 pacientes com câncer gástrico (n = 80) e úlcera gástrica (n = 25) foram recrutados entre Dezembro de 2007 e Outubro 2010 at Changzheng Hospital da segunda Universidade médica Militar (Xangai, China). Todos os casos com câncer gástrico inscritos foram histologicamente confirmados por 2 patologistas e casos com úlcera gástrica recrutados foram confirmados por gastroscópio. Pacientes com câncer gástrico que receberam quimioterapia pré-operatória, e que tinham outras doenças, incluindo infecções foram excluídos do estudo. As amostras de soro foram obtidas antes ressecções cirúrgicas. Para um grupo de controle, 139 idade correspondida, voluntários saudáveis ​​foram recrutados a partir de um conjunto de indivíduos sem câncer que visitou o mesmo hospital para um exame físico regular e que se voluntariaram para participar da pesquisa durante o mesmo período. Nós definimos um indivíduo saudável como alguém que foi considerado livre de doenças (incluindo sem histórico de câncer) na saúde check-up. As seguintes características clínicas dos pacientes foram obtidas no momento da recolha de sangue total. Um resumo dos dados desses temas é apresentado na Tabela 1. A progressão de todos os pacientes com câncer gástrico foi classificada de acordo com a União para o Controle Internacional de Câncer (UICC) critérios de estadiamento TNM para câncer gástrico, 13 pacientes (16,25%) apresentaram estágio I, 24 pacientes (30,00%) apresentavam estágio II, 30 pacientes (37,5%) teve a fase III, e 13 pacientes (16,25%) apresentaram estágio IV. A idade média dos pacientes foi de 54,35 ± 6,69 incluindo 60 homens e 20 mulheres. O soro foi recolhido usando um protocolo padrão de sangue total, tratados por centrifugação a 10.000 g durante 20 minutos, e armazenados a -80 ° C.

perfil de N-glicanos de proteínas de soro

análises de proteína do soro de N-glicanos foram realizados como descrito anteriormente [11]. Resumidamente, os N-glicanos presentes nas proteínas em 2 ul de soro foram libertadas com o péptido N-glicosidase-F (PNGaseF) (New England Biolabs, Boston, Massachusetts) e em seguida rotuladas com 8-aminonaphtalene-1, 3, 6- ácido trissulfónico (APTS) (Invitrogen, Carlsbad, Califórnia) de ácido .Sialic foi removido com Arthrobacter ureafaciens sialidase (Roche Bioscience, Palo Alto, Califórnia), e as amostras processadas foram analisados ​​com a tecnologia DSA-FACE usando um ABI3500 genética baseada em eletroforese capilar Analyzer (Applied Biosystems, Foster City, Califórnia). Os 9 picos mais intensos que foram detectadas em todas as amostras (em conjunto, estes picos representaram 90% do total de N-glicanos do soro) foram analisados ​​usando o software GeneMapper (Applied Biosystems). Cada estrutura de N-glicano foi descrita numericamente normalizando sua altura à soma das alturas de todos os picos.

As amostras de tecido

Todos os tecidos foram utilizados de acordo com as regulamentações do Conselho de Revisão Institucional de segunda Universidade médica Militar. As amostras de tecido foram obtidos from10 de 80 pacientes com câncer gástrico. As amostras de tecido incluídas 2 fatias, num tecido tumoral e um tecido não-tumoral adjacente. amostras de tecidos emparelhados (aproximadamente 0,5 × 0,5 × 0,5 cm

3, duplicado para cada amostra) foram seleccionados, quer imediatamente congeladas a -80 ° C durante a extracção de ARN e proteína ou fixado em formalina tamponada a 10% durante até 24 horas e, em seguida transformado em um bloco de parafina incorporado e armazenado à temperatura ambiente durante a coloração histoquímica.

perfil de N-glicanos de proteínas de tecidos e análise estrutural utilizando digestão exoglycosidase

As proteínas foram extraídas a partir de cerca de 25 mg de amostras de tecido congeladas . As amostras de tecido foram suspensas e pestled em tampão de lise contendo inibidores de protease (Roche Diagnostics, Meylan, França). partes não lisados ​​foram removidos por centrifugação (12000 g durante 10 minutos a 4 ° C) duas vezes. A concentração de proteínas solubilizadas foi determinada usando o kit BCA (Pierce Biotechnology /Thermo Fisher Scientific, Rockford, IL), e as amostras de proteína foram armazenadas a -80 ° C até à sua utilização. Um total de 40 ug de proteínas de tecido foram utilizadas para determinar os perfis dos N-glicanos utilizando o método de perfil de N-glicanos regular, a mesma que a realizada no soro acima descrito. Para identificar núcleo-α-1, as estruturas de N-glicanos 6-fucosilados, um número apropriado de APTS-rotulados N-glicanos foram digeridos com ambos Arthrobacter ureafaciens sialidase e rim de bovino α-1, 6-fucosidase (Prozyme, San Leandro, CA , EUA). tecnologia DSA-FACE foi utilizado para analisar os produtos de digestão e de software GeneMapper foi usada para analisar a altura dos picos.

extracção de ARN e quantitativa PCR em tempo real

Os ARNs totais foram extraídos a partir de congelado tecidos e células, utilizando o kit de extracção total de ARN de acordo com as instruções do fabricante (Axygen Biosciences, Hangzhou, China). A pureza e a concentração de ARN foi determinada por espectrofotometria (Eppendorf, Hamburgo, Alemanha), e, em seguida, armazenada a -80 ° C até à sua utilização. O ADNc foi sintetizado utilizando o kit de ReverTra Ace-α-RT-PCR (Toyobo Co., Osaka, Japão) de acordo com as instruções do fabricante. Os iniciadores foram concebidos utilizando o programa Primer Express (Applied Biosystems, as sequências são mostradas na Tabela S1). Quantitative PCR em tempo real foi realizado utilizando o SYBR® verde Real-time PCR Master Mix Kit (Toyobo Co., Osaka, Japão) e foi analisado no Applied Biosystems 7300 Real-Time PCR sistema (ABI, Foster City, CA, EUA) . Todos os ensaios foram realizados de forma independente em triplicado. dos ciclos de PCR consistiu de uma desnaturação a 95 ° C durante 5 minutos, seguido de 40 ciclos a 95 ° C durante 15 segundos e a 59 ° C ou 55 ° C durante 15 segundos, e a detecção por 45 segundos a 72 ° C. A quantidade relativa de transcritos de guanosina difosfato (GDP) -fucose transportador (PIB-Tr) FUT8 ou em cada amostra foi normalizada para o gene doméstico β-actina e da desidrogenase do gliceraldeído-3-fosfato (GAPDH), subtraindo o ciclo. Os níveis de expressão de genes foram determinadas usando o método de delta-delta Ct. valores de expressão de transcritos absolutos além de 40 ciclos foram consideradas abaixo dos níveis detectáveis. Derretem curvas foram verificadas para cada reacção de garantir que um único produto foi amplificado.

Western blot e Lectina blot

As proteínas foram extraídas de tecidos congelados com o procedimento descrito acima, e um total de 50 proteínas ug foram separados por electroforese em 10% de dodecil sulfato de sódio-poliacrilamida gel (SDS-PAGE). Os géis foram corados com azul de Coomassie G250 ou as proteínas no gel foram transferidas para uma membrana de nitrocelulose () para a detecção de FUT8 ou a percentagem de proteínas de núcleo fucosilado. Para as amostras de soro, com um total de 85 casos de cancro gástrico (n = 80), úlcera gástrica (n = 25) e de controlo saudáveis ​​(n = 30) foram usadas para SDS-PAGE e lectina-blot. As membranas foram bloqueadas durante a noite a 4 ° C com proteína de leite magro a 5% ou 5% de albumina de soro bovino em tampão tris salina [140 mM de NaCl, 10 mM de Tris-HCl (TBS)] e, em seguida, incubadas durante 2 horas à temperatura ambiente com 1:100 diluída FUT8 anticorpo anti-humano (15C6, FUT8 anti-humano, Fujirebio Corp., Japão) ou 5 ug /ml de lente biotinilado culinaris aglutinina a (ACE) (Vector Laboratories, Burlingame, CA) em TBS contendo 0,05% Tween-20 (tampão de TBST), e depois incubadas com uma diluição de anticorpos secundários marcados com fluorescência (LI-COR Biosciences, Lincoln, NE) ou IRDye 800CW-estreptavidina (LI-COR Biosciences) 1:10,000 durante 1 hora à temperatura ambiente . As membranas foram desenvolvidos com o IR Imaging System Odyssey. Anti-beta actina (1:2000) foi utilizado para o anticorpo de referência interna para western-blot. albumina purificada foi utilizada como controlo negativo para a mancha de lectina e de proteínas totais coradas com azul Coomassie foi usada para calcular a percentagem de proteína fucosilado-núcleo.

imuno-histoquímica (IHC) coloração e lectina-histoquímica coloração

As amostras de tecido fixadas em parafina foram cortados em fatias de 4 mm de doentes para coloração imuno-histoquímica para FUT8 e coloração lectina-histoquímica para LCA. Depois de ser submetido desparafinização, de re-hidratação, o bloqueio da peroxidase endógena, e recuperação de antigénios (Tris 10 mM /EDTA a 1 mM, pH 9,0, tratados em autoclave), as amostras foram incubadas com um anticorpo monoclonal de ratinho contra FUT8 humana (1:100) ou ACV biotinilado (1 :500) durante a noite a 4 ° C, e depois com anticorpo secundário conjugado com peroxidase de rábano ou estreptavidina marcada com fluoresceína a 37 ° C durante 30 min. Os núcleos foram contra-coradas com hematoxilina ou DRAQ5. controle negativo foi composta de cortes histológicos identicamente tratados com IgG de rato para substituir o mouse FUT8.

As linhas celulares e cultura

As linhas celulares de cancro gástrico humano, BGC-823 e SGC-7901, foram adquiridos da Shanghai Institute of Cell Biology, Academia chinesa de Ciências e cultivadas a 37 ° C sob 5% de CO

2 em meio RPMI 1640 e meio DMEM (Invitrogen Life Technologies, Carlsbad, CA), respectivamente, com 10% de FBS, 1% de glutamina e solução de antibiótico a 1%.

Construção do PIB-Tr e FUT8 recombinante Plasmids e transfecção de células cancerosas gástricas

o pEGFP-N1-PIB-Tr eo pEGFP-N1 -Fut8, o plasmídeo vector que codifica humano PIB-Tr ou FUT8, foi gerado por inserção de PIB-Tr ou ADNc FUT8 num vector pEGFP-N1 (Clontech Laboratories, Inc., mountain View, CA, EUA), contendo um promotor de CMV e promotor precoce SV40, bem como o gene de resistência à neomicina /canamicina de Tn5. O esqueleto do vector contém também uma origem de replicação de SV40 em células de mamífero. O local de clonagem múltipla (MCS) fica ao lado do promotor precoce imediato de CMV. O gene PIB-Tr ou FUT8 humana foi clonado a partir de ARNm extraído com TRIzol reagente (Invitrogen, Carlsbad, EUA) a partir de tecido de fígado humano através da realização de RT-PCR utilizando os iniciadores (Tabela S2), na qual Xho I e Kpn I sítios de restrição foram incluídos, digerindo com Xho I e Kpn I e ligando para o pEGFP-N1. O pEGFP-N1-PIB-Tr ou pEGFP-N1-FUT8 foi transfectado em Escherichia coli DH5a para a amplificação e sequenciação de ADN foi utilizado para assegurar a fidelidade. O ADN plasmídico foi preparado utilizando o Qiagen DNA Mini Kit (Qiagen, Hilden, Alemanha) de acordo com as instruções do fabricante. Os plasmídeos foram transf ectados para as linhas humanas gástricas celulares de cancro, BGC-823 e SGC-7901 a 80% de confluência e 5 × 10

5 células por poço numa placa de seis poços usando o Lipofectamine ™ 2000 (Invitrogen, Carlsbad, EUA ) de acordo com as instruções do fabricante. As células transfectadas que expressam gene alvo foram confirmadas por RT-PCR quantitativo.

proliferação celular ensaio

ensaios de proliferação celular foram realizadas com o kit-8 de contagem celular (CCK-8, Dojin, Japão) de acordo com as instruções do fabricante. O crescimento celular foi monitorizado a cada 24 horas durante 5 dias, e para cada ponto de tempo foi levada a cabo em duplicado. A absorvância foi medida para cada poço a um comprimento de onda de 450 nm.

cicatrização de feridas ensaio

Para o ensaio de cicatrização de feridas, as linhas celulares de cancro gástrico humano, BGC-823 e SGC-7901 ( 1 × 10

5 células /35 × 11 mm pratos) foram semeadas e incubadas durante 24 horas a 37 ° C e, em seguida, transfectadas com os plasmídeos recombinantes. Depois de atingir a confluência, a camada celular em cada placa foi riscado utilizando uma ponta de pipeta de plástico. A migração das células na borda do zero foi analisada aos 0, 24 e 48 horas, as imagens foram capturadas e analisadas pela Leica microscópio de fluorescência e combinados software de análise de imagem (Comet Ensaio IV sistema de análise de imagem, PI, Reino Unido).

rotina tumor fabricante Detecção

os dados clínicos e bioquímicos de pacientes estão resumidas na Tabela 1. os testes bioquímicos de rotina foram medidos utilizando métodos padrão e reagentes emparelhados (Hitachi 7600 Analyzer (Hitachi, Tóquio, Japão) . níveis de marcadores tumorais, incluindo antígeno de carboidrato 19-9 (CA19-9), antígeno carcino-embrionário (CEA), citoqueratina 19 (CK19), CA125 e CA724, foram determinados em um modular Roche E170 com reagentes combinados.

Análise estatística

Todas as variáveis ​​quantitativas foram expressas em média ± desvio padrão, salvo indicação contrária. As variáveis ​​quantitativas foram comparadas com os testes t de Student, análise de variância (ANOVA), ou testes não paramétricos. coeficientes de correlação de Pearson (Spearman coeficientes de correlação foram calculados para variáveis ​​categóricas ordinais) e suas probabilidades associadas (

p

) foram usadas para avaliar a correlação entre parâmetros. Todos os

P valores

relatados foram 2 de cauda, ​​e

p

valores 0,05 foram considerados estatisticamente significativos. As análises estatísticas foram realizadas com SPSS 16.0 para software estatístico Windows (SPSS Inc.).

Resultados

Diferentes de N-glicanos padrões de perfis séricos em câncer gástrico, úlcera gástrica e controles saudáveis ​​

Usando DSA-FACE, examinamos os perfis de N-glicanos em soros dessializada de pacientes com câncer gástrico (n = 80), úlcera gástrica (n = 25), e idade correspondida indivíduos saudáveis ​​(n = 139). Foram quantificados e comparados estatisticamente esses picos entre 3 grupos diferentes. Pelo menos 9 estruturas de N-glicanos (picos) foram identificados em todas as amostras (Figura 1A). A análise estrutural desses N-glicanos foi publicado anteriormente por Callewaert [11]. A abundância relativa média destas estruturas de N-glicanos foi descrito na Tabela 2. A abundância de estruturas em picos 2, 3, 5, 6, 7, 8 e 9 revelaram diferenças estatisticamente significativas entre o câncer gástrico, úlcera gástrica e controle saudável grupos, indicando que diferentes padrões de N-glicanos apareceu em diferentes condições fisiopatológicas. Comparado com o grupo controle saudável, peak5 (bigalacto glicano biantenária, AN2) e peak9 (ramificação α-1,3-fucosilado glicano triantenária, NA3Fb) foram elevados (P 0,001) (Figura 1B); Considerando picos fucosilados Core-, como peak2 (agalacto core-α-1,6-fucosilado bisecting glicano biantenária, NGA2FB), peak3 (single agalacto glicano biantenais núcleo-α-1,6-fucosilado, NG1A2F), peak6 (bigalacto núcleo glicano -α-1,6-fucosilados biantenais, NA2F) e peak7 (bigalacto núcleo-α-1,6-fucosilado bissector glicano biantenal, NA2FB) foram reduzidos no grupo do cancro gástrico (P 0,001). Da mesma forma, a abundância de glicanos de estrutura fucosilado-core nomeados sumfuc (indica estruturas totais fucosilado-core, incluindo o pico 1, 2, 3, 4, 6, e 7) foi reduzida significativamente no cancro gástrico (P 0,001) (Figura 1C ). O grupo com câncer gástrico foi classificada em 4 subgrupos de acordo com o estadiamento TNM da UICC para o câncer gástrico. A abundância estrutura e sumfuc não se alterou de forma significativa entre os 4 subgrupos diferentes; no entanto, sumfuc foi diminuída gradualmente com fases de progressão do câncer gástrico (Tabela 3).

(A) Os três painéis (de cima para baixo) são perfis de N-glicanos típica de soro de controle saudável, úlcera gástrica e gástrica cancros. Nove principais picos podem ser identificados. As estruturas dos picos de N-glicanos são mostrados abaixo do gráfico. Níveis em picos 5 e 9 são elevados (acima das setas), e os níveis de picos 2, 3, 4, 6, 7 e 8 são diminuídos (setas) no câncer gástrico em comparação com os controles saudáveis ​​e doentes. Picos 1, 2, 3, 4, 6 e 7 são glicanos fucosilado-core. (B) O valor da peak9 (ramificação triantenária α-1,3-fucosilado N-glicanos, NA3FB) é elevada em seqüência de controle saudável, úlcera gástrica para câncer gástrico (P 0,001), barras de erro representam os intervalos de confiança de 95% (95 CI%) para os meios. (C) O valor de sumfuc é diminuída em cancro gástrico (P 0,001). Sumfuc indica a abundância total de glicanos de estrutura fucosilado-core (picos 1, 2, 3, 4, 6 e 7). As barras de erro representam IC 95% para meios.

Correlação entre N-glicanos e marcadores tumorais rotina

Até o momento, o CEA é ainda amplamente utilizado para a triagem e monitoramento do câncer gástrico. Foram analisadas as correlações entre marcador N-glicanos indivíduo com CA19-9, CEA, CK19, CA125 e CA724. A análise de correlação de Pearson indicou que o CEA foi positivamente associado com peak1 (r = 0,19; P 0,01), e peak9 (r = 0,28; P 0,01), ao passo que se negativamente com peak6 (r = -0,18, P 0,01) e peak8 (r = -0,23; P 0,01) (Tabela 4)

Comparação de sumfuc entre câncer gástrico e outros cânceres do sistema digestivo

Anteriormente temos estudado o perfil de N-glicanos. de carcinoma hepatocelular (HCC) [19] e cancro colorectal (CRC) [20]. A abundância de sumfuc revelou diferenças estatisticamente significativas entre o câncer gástrico (41,32 ± 6,39), HCC (50,99 ± 8,39), CRC (45,33 ± 5,96) e controle saudável (47,67 ± 5,08) grupos (P 0,001, Tabela 5), ​​indicando esse nível diferente de core-fucosila�o apareceu em cancros com origens diferentes de tecidos. Entre os 4 grupos, o nível de núcleo-fucosilação em HCC foi o mais elevado, enquanto que o nível fucosilação no cancro gástrico foi a mais baixa, e era ainda menor do que no controlo saudável.

N-glicano profiling padrões em tecidos de tumor gástrico e não tumorais

perfis de N-glicanos foram analisados ​​em proteínas dessialilados de tecidos de tumor gástrico e não tumorais. Os três mais abundante bigalacto glicanos biantenais mostrou no soro, peak5 (NA2), peak6 (NA2F) e preak7 (NA2FB) também foram identificados nas proteínas dos tecidos (Figura 2A). Peak6 Peak7 e foram confirmadas como sendo estruturas nucleares fucosilados dervied de peak5 depois tratados com núcleo-α-1, 6-fucosidase digestão (Figura 2A). As alturas destes três picos foram analisados ​​usando o software GeneMapper. A proporção de peak6 para peak5 foi menor em tecidos tumorais do que em tecidos adjacentes não tumorais (0,83 ± 0,18 vs 1,05 ± 0,42, Figura 2b), bem como a razão entre a peak7 peak5 (0,13 ± 0,06 vs 0,16 ± 0,04, Figura 2C). No entanto, não houve diferenças estatisticamente significativas (P 0,05). Entre os tecidos tumorais e não tumorais

(A) Os cinco painéis (de cima para baixo) são dessialilados perfis N-glicanos de soro como referência, perfis dessialilados de N-glicanos a partir de tecidos tumorais, dessializada perfis de N-glicanos a partir de tecidos de tumor tratados com a digestão α-1,6-fucosidase, dessializada perfis de N-glicanos a partir de tecidos não tumorais adjacentes, e dessializado perfis de N-glicanos a partir de não-adjacentes tecidos de tumor tratados com a digestão α-1,6-fucosidase. As linhas de setas indicam as alterações de picos de N-glicanos tratados com digestão α-1,6-fucosidase. Peak6 e peak7 remover a frente após a digestão α-1,6-fucosidase, que reveale que peak5, 6 e 7 têm as mesmas estruturas como no soro, e peak6 e peak7 são α-1,6-fucosilados N-glicanos. (B) O valor da peak6 /peak5 é diminuída em tecidos tumorais, mas a diferença não é estatisticamente significativa. As barras de erro representam IC 95% para meios. (C) O valor da peak7 /peak5 é também diminuiu em tecidos tumorais, mas a diferença não é estatisticamente significativa.

Diminuição dos níveis de fucosila�o total do núcleo identificado em ambos os soros e tecidos de câncer gástrico

desde ACV pode reconhecer especificamente as glicoproteínas com α-1,6-fucosilado-ligada N-acetil-D-glucosamina-asparagina (Asp-GlcNAc) no núcleo de trimanosilo, investigaram-se as proteínas totais do núcleo a partir de soros e fucosilados tecidos em câncer gástrico utilizando LCA para validar a descoberta em DSA-FACE. No soro, o nível de resíduos de fucose núcleo de ligação ACV foi menor no cancro gástrico do que o da úlcera gástrica e controlos saudáveis ​​(Figura 3A). Abundância total do núcleo fucose também tendeu a ser inferior nos tumores gástricos comparada com a de tecidos adjacentes emparelhados (Figura 3B). Para determinar se a alteração da fucosilação total do núcleo em tecido de tumor gástrico é relevante para a alteração da via de biossíntese de glicosilação, RT-PCR quantitativo foi usado para analisar a abundância de mamíferos FUT8 e PIB-TR em tumores gástricos e os tecidos adjacentes. Os resultados revelaram que não se observaram diferenças significativas de FUT8 e expressão PIB-Tr mRNA entre tumores e tecidos adjacentes (Figura 3C e 3D). A abundância relativa de proteína FUT8 foi ilustrado utilizando Western blot (dados em bruto foi mostrado na Figura S1). O FUT8 em tecidos adjacentes era significativamente mais elevada do que em tecidos de tumor (P 0,05) (Figura 3E). A imuno-histoquímica revelou que o FUT8 foi fortemente expresso positivamente nas fronteiras luminais de células gástricas não tumorais (Figura 4B), no entanto, fracamente expresso positivamente em células de tumor (Figura 4A). A expressão de glicoproteínas fucosilado-core de ligação ACV foi maior em células gástricas não tumorais do que em células de tumor (Figura 4C, 4D). Assim, o nível de fucosilação total do núcleo foi identificado diminuiu em ambos soro e tecidos de cancro gástrico.

(A) manchas de lectina da proteínas do soro foram sondadas com ACV. O eixo horizontal representa os grupos experimentais: controlo saudável (n = 30), úlcera gástrica (n = 25), e cancro gástrico (GC) (n = 30); o eixo vertical indica a proporção de proteínas de proteínas totais fucosilados. O nível de proteínas fucosilados no câncer gástrico é a mais baixa entre os 3 grupos (P 0,001). borrões (B) Lectina de proteínas teciduais foram sondadas com ACV. O eixo horizontal representa os grupos experimentais: tecidos de tumor (n = 10) e tecidos adjacentes (n = 10). O eixo vertical indica a proporção de proteínas de proteínas totais fucosilados. O nível fucosilado-core foi menor no tumor gástrico, mas a diferença não apresentou significância estatística (P 0,05). (C) e (D) ARN mensageiro Relativa (ARNm) os níveis de expressão de FUT8 ou PIB-TR em tecidos foram medidos por RT-PCR quantitativo. O eixo horizontal representa os grupos experimentais: tecidos de tumor (n = 10) e tecidos adjacentes (n = 10). O eixo vertical indica os níveis de expressão relativos de FUT8 ou PIB-Tr. A diferença entre os dois grupos não era estatisticamente significativa (P 0,05). (E) A abundância relativa de proteína FUT8 foi ilustrado utilizando Western blot. O eixo horizontal representa os grupos experimentais: tecidos de tumor (n = 9) e tecidos adjacentes (n = 9). O eixo vertical indica os níveis relativos de proteína FUT8. A abundância relativa de proteína FUT8 em tecidos adjacentes era significativamente mais elevada do que em tecidos de tumor (P 0,05).

(A) Coloração imuno-histoquímica com FUT8 em células de tumor (200 ×), a expressão de FUT8 é fracamente positivo. (B) coloração imuno-histoquímica com FUT8 em células gástricas não tumorais (200 ×), a expressão de FUT8 é fortemente positiva. coloração (C) A lectina-histoquímica com LCA nas células tumorais, bar 75 mm, a expressão de proteínas fucosilado-core de ligação LCA é fracamente positivo. (D) coloração lectina-histoquímica com LCA em células gástricas não tumorais, bar 75 mm, a expressão de proteínas fucosilado-core é fortemente positiva.

Efeito da FUT8 e do PIB-Tr na proliferação e migração em linhas celulares de cancro gástrico humano

As linhas celulares de cancro gástrico humano, BGC-823 e SGC-7901 foram utilizadas em estudos in vitro. Desde BGC-823 expressou menor nível de PIB-Tr enquanto SGC-7901 expressas menor nível de FUT8 em nossa pesquisa piloto, pEGFP-N1-PIB-Tr foi transfectado em BGC-823 para superexpressão PIB-Tr e pEGFP-N1 FUT8 foi transfectado para SGC-7901 para que sobre-expressam FUT8. expressões recombinantes foram alcançado com êxito, demonstrado por expressão repórter gene GFP (Figura S2). Para examinar o possível envolvimento do PIB-Tr e FUT8 na proliferação do tumor e migração, as células SGC-7901 BGC-823 e foram investigados após transfecção utilizando CCK-8 e cicatrização de feridas ensaio de migração respectivamente. Os resultados mostraram que a regulação positiva de PIB-Tr diminuiu BGC-823 na proliferação de 2-5 dias após a transfecção e sobre-regulação de diminuição da proliferação FUT8 SGC-7901 em 2 dias após a transfecção (Figura 5A e 5B). Estes resultados indicaram que a elevada expressão de PIB-Tr e FUT8 poderia suprimir a proliferação de células de cancro gástrico humano. Ferida ensaio cura demonstrado que o PIB-Tr e FUT8 não têm influência significativa sobre as migrações em BGC-823 e SGC-7901 às 48 h após o tratamento (Figura 5C e 5D).

(A) e (B) O proliferação de células BGC-823 e células SGC-7901 após a transfecção com pEGFP-N1-PIB-Tr e pEGFP-N1-FUT8 respectivamente foi analisada por contagem celular Kit-8 ensaios (CCK-8). Os resultados representativos de quatro experiências independentes são apresentados. * P 0,05 comparado com o grupo de controlo. (C) e (D) O ensaio de migração de células de cicatrização da ferida BGC-823 após a transfecção com pEGFP-N1-PIB-Tr, bem como células SGC-7901 após a transfecção com pEGFP-N1-FUT8. A distância do fosso (uM) no ensaio de migração podem ser avaliados quantitativamente utilizando programas. Resultados representativos de 3 experiências independentes são apresentados. P . 0,05 em comparação com o grupo controle

Discussão

A glicosilação é uma das modificações pós-traducionais mais comuns apareceram em cerca de 70% de todas as proteínas conhecidas. As alterações na glicosilação desempenhar um papel num conjunto diversificado de fenómenos biológicos, tais como a metástase tumoral celular, a comunicação intracelular e inflamação [21] – [23]. Mais e mais estudos indicam que as alterações de glicosilação e os níveis de actividades glicosiltransferases derivados a partir da transformação maligna são relevantes para tumores malignos humanos [24] – [25].