Abstract

Nos últimos anos muita atenção tem sido dada ao uso de substâncias naturais como fármacos anticancerígenos. O dipéptido L-carnosina antioxidante natural, pertence a esta classe de moléculas porque se provou ter uma actividade anticancerígena significativa tanto in vitro como in vivo. Estudos anteriores demonstraram que a L-carnosina inibe a proliferação de células de carcinoma colorectal humano por afectar a produção de ATP e de espécies de oxigénio reactivos (ROS). No presente estudo foi identificada a hipoxia-inducible factor 1α (HIF-1α) como um possível alvo de L-carnosina numa linha celular HCT-116. proteína HIF-1α é sobre-expressa em vários tipos de cancro humano e é a principal causa da resistência a drogas e radiações em tumores sólidos. De particular interesse são os dados experimentais que apoiam o conceito de que a geração de ROS fornece um sinal de redox para a indução de HIF-1α, e sabe-se que alguns antioxidantes são capazes de suprimir a tumorigénese através da inibição HIF-1α. No presente estudo verificou-se que a L-carnosina reduz o nível de proteína HIF-1α afectar a sua estabilidade e diminui a actividade de transcrição HIF-1. Além disso, foi demonstrado que a L-carnosina é envolvido em sistema ubiquitina-proteassoma promover a degradação de HIF-1α. Por fim, comparou-se a actividade antioxidante de L-carnosina de com a de dois anti-oxidantes bis-diaminotriazoles sintéticas (isto é, 1 e 2, respectivamente). Apesar destes três compostos têm a mesma capacidade em reduzir intracelular ROS, 1 e 2 são varredores mais potentes e não têm efeito sobre a expressão de HIF-1α e proliferação de células de cancro. Estes resultados sugerem que uma análise da via antioxidante L-carnosina vai esclarecer o mecanismo subjacente os efeitos anti-proliferativos deste dipeptídeo em células cancerígenas do cólon. No entanto, embora o mecanismo molecular pelo qual regula para baixo de L-carnosina ou inibe a actividade de HIF-1α ainda não foi elucidada, esta capacidade pode ser promissora no tratamento de doenças relacionadas com a hipóxia

citação:. Iovine B, Oliviero L, M Garofalo, Orefice H, F Nocella, Bourbon N, et al. (2014) O Anti-proliferativa Efeito da L-carnosina se correlaciona com uma diminuição da expressão de hipóxia inducible factor 1 alfa em células cancerígenas do cólon humano. PLoS ONE 9 (5): e96755. doi: 10.1371 /journal.pone.0096755

editor: Sabato D’Auria, CNR, Itália |

Recebido: 17 Março, 2014; Aceito: 05 de abril de 2014; Publicado em: 07 de maio de 2014

Direitos de autor: © 2014 Iovine et al. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Licença Creative Commons Attribution, que permite uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o autor original ea fonte sejam creditados

Financiamento:. Este trabalho foi apoiado pelo “Finanziamento per l’Avvio di Ricerche Originali”, Università degli Studi di Napoli Federico II, GO. “Progetti di Ricerca di Rilevante Interesse Nazionale” concessão 2009 do italiano Ministero dell’Università e della Ricerca, GO NB GP. Os financiadores não tiveram nenhum papel no desenho do estudo, coleta de dados e análise, decisão de publicar ou preparação do manuscrito

CONFLITO DE INTERESSES:.. Os autores declararam que não existem interesses conflitantes

Introdução

L-carnosina (β-Ala-His) é um dipeptídeo histidina que ocorrem naturalmente, sintetizados endogenamente e amplamente encontrado no cérebro, músculo, rim, estômago, e, em grandes quantidades, no músculo esquelético. Este dipeptídeo está provado para executar um número de funções biológicas, incluindo a actividade anti-oxidante, a capacidade de quelar iões de metais, inibição da glicosilação de proteína, anti-inflamatória e anti-senescência [1]. Outro aspecto do efeito da L-carnosina diz respeito ao seu efeito anti-proliferativo em linhas celulares humanas. Recentemente, demonstrámos que a L-carnosina inibe a proliferação de células HCT-116 de carcinoma humano colorrectal afectando a produção de ATP e de ROS e por induzir a paragem do ciclo celular na fase G1 [2]. Além disso, alguns autores, com uma abordagem proteómica, apoiam a possibilidade de que este dipéptido afecta o crescimento de células de tumor nas células de glioma humano e retarda o crescimento tumoral in vivo num modelo de ratinho NIH3T3-HER2 /neu através de uma interferência com a proteína de dobragem /processamento e sinalização HIF-1α [3] – [4]. Na verdade, consideráveis ​​esforços têm sido dirigidos para a descoberta das moléculas naturais ou química que a proteína alvo de HIF-1α e regular a via de sinalização de HIF-1α através de uma variedade de mecanismos moleculares, incluindo a regulação da transcrição, de estabilização, de degradação e de transactivação. De particular interesse é o papel das ROS e moléculas antioxidantes na regulação HIF-1α. De facto, uma série de compostos, tais como rapamicina e resveratrol, têm sido mostrados como sendo inibidores de HIF-1α [5] – [6]. HIF-1α é um componente do complexo HIF-1 que desempenha um papel central em O

2 homeostase e, de facto, é considerado um regulador central das respostas de adaptação de células cancerosas para hipoxia [7]. HIF-1 complexo é um factor de transcrição heterodimérica que consiste em O

2-regulada HIF-1α e subunidades de HIF-1β expressas constitutivamente. Sob condições de normóxia hidroxilase PhD2 isoforma prolil hidroxila HIF-1α em dois resíduos de prolina funcionalmente independentes, pro

402 e Pro

564, dentro do domínio TDO (degradação dependente de oxigénio) [8] – [9]. Pro resíduos hidroxilados promover o recrutamento de HIF-1α por Von Hippel-Lindau proteína supressora de tumor (VHL), um módulo de reconhecimento de ligase de ubiquitina-E3, responsável pela sua ubiquitinação e subsequente degradação mediada por proteassoma [10]. Sob condições hipóxicas a proteína HIF-1α escapa à proteólise, é sobre-regulada, e forma um heterodímero com o HIF-1β no complexo HIF-1. O complexo HIF-1 reconhece e liga-se ao elemento de resposta a hipoxia (HRE) de genes de hipóxia-indutível, incluindo genes que influenciam a angiogénese, o metabolismo do ferro, a modulação do metabolismo da glicose, a proliferação celular, sobrevivência, e a invasão, activando deste modo a sua transcrição [ ,,,0],11]. Nos últimos anos, o HIF-1 emergiu como um alvo promissor para a terapêutica do cancro. Na verdade, o HIF-1α sobre-expressão é uma característica comum de cancros humanos, onde medeia a adaptação para o microambiente do tumor hipóxico. Em conformidade com estas observações, a finalidade do presente estudo foi investigar a linha celular HCT-116 os efeitos da L-carnosina na expressão de HIF-1α e genes HIF-1α-dependentes. Além disso, nos últimos anos, de particular interesse tem sido o papel de ROS e moléculas antioxidantes na regulação de HIF-1α [12]. Assim, para compreender os mecanismos responsáveis ​​pelo efeito de L-carnosina também examinaram como esta dipeptídeo afeta os níveis intracelulares ROS em comparação com compostos dois novos anti-oxidantes bis-diaminotriazole (ou seja, 1 e 2, respectivamente) disponíveis nos nossos laboratórios e cujos antioxidante atividade é inédito. Apesar destes três compostos têm a mesma capacidade em reduzir intracelular ROS, verificou-se que 1 e 2 não têm nenhum efeito sobre a expressão de HIF-1α e proliferação de células de cancro. Supõe-se que a actividade antioxidante de L-carnosina de opera com um mecanismo diferente do que os compostos 1 e 2. Assim, conclui-se que uma análise da via antioxidante L-carnosina irá clarificar o mecanismo subjacente aos efeitos da presente dipéptido em células cancerígenas do cólon.

Materiais e Métodos

Cultura de células

HCT-116 linha de células de carcinoma colorretal humano foi adquirido da American Type Culture Collection (ATCC) EUA. A linha celular foi cultivada a 37 ° C e 5% de CO

2 em DMEM (Dulbecco Modified Eagle Médium) adquirido a BioWhittaker clássico celular Meios de Cultura, Lonza – VWR SRL Internacional, suplementado com 10% de soro fetal de bovino (FBS) ( Gibco Laboratories, North Andover, Massachusetts) e 1% de penicilina /estreptomicina (Gibco Laboratories).

compostos químicos Síntese de bis-triazole 1 e 2

Os dois compostos foram preparados por uma reacção de o ácido correspondente (ácido trans, trans-mucónico e ácido fumárico, respectivamente) com monocloridrato diaminoguanidina em ácido polifosfórico como o agente de desidratação, seguindo o procedimento já descrito em [13]. Os cloridratos 1 e 2 foram preparadas como se segue. Cada bis-diaminotriazole foi suspenso em água. Ácido clorídrico diluído (10 mL de ácido clorídrico cone. Em 100 mL de água) foi adicionada, aquecida até à ebulição até o sólido se dissolver completamente. Após arrefecimento até à temperatura ambiente, 2 foi obtido na forma de cristais prismáticos castanhos. No caso de um, o cloridrato de (pálido cristais prismáticos castanhos) foi obtido depois da adição de etanol à solução de água e o arrefecimento até à temperatura ambiente. A estrutura dos cloridratos e protonação no N-2 átomo do anel, em vez de nos grupos amino, foi confirmada por análise de cristal único (trabalho em preparação) e é consistente com resultados semelhantes reportados em [13].

Tratamentos

L-carnosina, fornecido pela Sigma-Aldrich Canadá, foi dissolvido em DMEM sem vermelho de fenol (Sigma-Aldrich). As células HCT-116 foram plaqueadas a uma concentração de 3,0 × 10

6 células em placas de 100 mm. Após incubação durante um dia a 37 ° C em 5% de CO

2, L-carnosina foi adicionada a partir de 0,5 a 100 mM; as células foram incubadas a 37 ° C e colhidas 24 h após a. O tratamento com os compostos bis-diaminotriazole (1 e 2) foi efectuada sob as mesmas condições com concentrações de 0,05 a 0,5 mm. Para CoCl

2 tratamento CoCl 100 mM de

2 foi adicionado ao HCT-116 durante 6 h. MG132, fornecido por Calbiochem EUA foi dissolvido em sulfóxido de dimetilo (DMSO) e foi adicionado ao meio de cultura. As células HCT-116 foram incubadas durante 1 h antes do tratamento com L-carnosina [14]. 24 h após o tratamento com L-carnosina as células foram colhidas por imunoprecipitação de proteína.

microscopia de fluorescência

células HCT116 foram cultivadas em lâminas durante 24 h e tratou-se com 100 mM de L-carnosina. Após 24 h, as células foram lavadas com PBS e fixadas com paraformaldeído a 4% frio em PBS à temperatura ambiente durante 10 min e, em seguida, foram permeabilizadas com 0,4% de Triton X100 em PBS 1X. Após 10 min, as células foram lavadas duas vezes com PBS 1X albumina de soro de bovino /0,4% (BSA) durante 1 h à temperatura ambiente. As células foram primeiro tratados com anticorpos de HIF-1a (Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA) em PBS 1X /BSA 0,4% durante 1 h à temperatura ambiente e, subsequentemente, com Alexa 568 (Molecular Probes ‘Alexa Fluor 568) anticorpos secundários em PBS 1X /BSA a 0,4% durante 1 h à temperatura ambiente no escuro. Após lavagem com PBS, as células foram coradas com meio de montagem para a fluorescência com DAPI (Vector Laboratories). Os resultados foram examinados por microscopia de fluorescência em um Zeiss Axiophot no 40X resolução.

Actividade Antioxidante medição pelo método de DPPH

método de têmpera

DPPH (1,1-difenil-2-picrilhidrazil) foi empregue para a avaliação da actividade antioxidante do a 1, 2 e L-carnosina [15]. A capacidade de as amostras para eliminar o radical DPPH foi medida utilizando o método Marca-Williams [16]. Alíquotas (60 ul) de uma solução 1 mM de 1, 2 e L-carnosina foram adicionados a 3 mL de solução de DPPH (6 × 10

~ 4 M) e a absorvância foi determinada a 515 nm (Philips PU 8620 série UV /espectrofotómetro visível) a cada 5 minutos até que o estado de equilíbrio. Para cada ensaio de anti-oxidante, uma alíquota de Trolox foi utilizado para desenvolver uma curva padrão de 50-500 mM. Todos os dados foram posteriormente expressas em Trolox Equivalentes (mmol TE /L).

Análise de Viabilidade Celular

O ensaio de MTT foi realizado de acordo com o protocolo relatado anteriormente [17]. As células HCT-116 foram plaqueadas a uma densidade de 1 x 10

5 as células em placas de 96 poços. Subsequentemente, as bis-diaminotriazole compostos (1 e 2) foram testados utilizando concentrações de 0,05 a 0,5 mm. Após 24 h de incubação, 10 ul de ácido 3- (4,5-dimetiltiazol-2-il) -2,5-difenil (MTT) (Sigma Aldrich) (0,05 mg /ml) foram adicionados ao meio de cultura. Após 4 h a 37 ° C o meio de cultura foi removido e 200 ul de DMSO foram adicionados para dissolver os sais de formazano. A absorvância foi medida com um espectrofotómetro de placa de 96 poços a 570 nm. As experiências foram realizadas três vezes, independentemente, e cada experiência continham repetições triplas. As amostras de controlo contendo um meio de cultura completo desprovido de células ou células de controlo sem L-carnosina também foram incluídos em cada experiência.

Ensaio clonogénico

células HCT116 foram plaqueadas a uma densidade de 500 células /poço em placas de 12 poços em 500 uL de meio de cultura fresco contendo DMEM completo com 20-50-100 mM de L-carnosina ou compostos de bis-diaminotriazole (1 e 2) (de 0,05 a 0,5 mm). Após 7 dias, as células foram lavadas duas vezes com PBS 1X e coradas com uma solução de 0,2% de violeta cristal, 50% de metanol e 10% de ácido acético em H

2O durante 30 min à temperatura ambiente. Subsequentemente, as células foram lavadas com deionizada H

2O e fotografados.

Medição de espécies reativas de oxigênio (ROS)

A formação de ROS foi avaliada por meio do 2,7-diclorofluoresceína sonda diacetato (H2DCF-dA) (adquirido a partir de Sigma-Aldrich). As células HCT-116 foram plaqueadas a uma densidade de 5 x 10

3 células /cavidade em placas de 96 poços em 100 ul de meio de cultura fresco contendo DMEM sem vermelho de fenol. As células foram deixadas crescer durante 24 h a 37 ° C em 5% de CO

2, foram adicionadas ao meio de cultura, em seguida, L-carnosina (de 0,5 a 100 mM) ou os compostos 1 e 2 (de 0,05 a 0,5 mm) . A medida ROS foi realizada de acordo com o protocolo previamente relatada [18]. A fluorescência foi monitorizada usando um Espectrómetro de Fluorescência LS 55 (Perkin-Elmer Co., Ltd., beaconsfield, Inglaterra). Em cada experiência, o aumento de fluorescência foi medida em três culturas em replicado para cada tratamento.

A transfecção e Ensaio da Luciferase Reporter Assay

As células foram transfectadas com o elemento de resposta de hipoxia (HRE) -luciferase repórter plasmídeo ou com um vector contendo o domínio de degradação dependente de oxigénio (TDO) do HIF-1α, utilizando Lipofectamine 2000 (Invitrogen, Darmstadt, Alemanha) em OptiMEM-1 de meio isento de soro (Lonza, Verviers, Bélgica), de acordo com o as especificações do fabricante. As culturas foram mantidas a 37 ° C em 5% de CO

2, durante 24-48 h. A actividade da luciferase foi avaliada pela luciferase Dual-sistema de ensaio Repórter (Promega, Madison, WI, EUA) e com um Promega GloMax Luminómetro 20/20, de acordo com as especificações do fabricante.

Preparação do total, nuclear e citosólica Proteína extractos

Os extractos totais de HCT-116 foram preparados 24 h após o tratamento com L-carnosina de 0,5 a 100 mm, ou com 1 ou 2 a partir de 0,05 a 0,5 mm. As amostras foram lavadas duas vezes com PBS gelado 1X e centrifugado a 240 g durante 10 min a 4 ° C. O sedimento de células foi ressuspenso em tampão de lise frio contendo 1% de Triton X100, 0,1% de SDS, 0,1% de NaN

3, NaCl 100 mM, NaF 50 mM, Na 0,1 mM

3VO

4, 10 mM NAPPI, PMSF 0,5 mM e 10 ug /ml de aprotinina, leupeptina e pepstatina a 4 ° C durante 30 min em gelo. Os lisados ​​celulares foram centrifugados a 20000 g durante 10 min a 4 ° C. Para citosólica e células HCT116 extractos nucleares foram colhidas, lavadas duas vezes com PBS gelado 1X e centrifugado a 240 x g durante 10 min a 4 ° C. O sedimento celular foi ressuspenso em 100 ul de tampão de lise hipotónico gelado (HEPES 10 mM pH 7,9, KCl 10 mM, PMSF 1 mM, EDTA 0,1 mM, EGTA 0,1 mM, DTT 1 mM, Na 1 mM de

3VO

4, 10 ug /mL de cada um de aprotinina, leupeptina, pepstatina e) e incubada com agitação a 4 ° C durante 15 min. Em seguida, as células foram lisadas pela adição de 5% de NP40. O extracto celular foi centrifugado durante 5 min a 500 x g e o sobrenadante contendo a fracção citosólica foi então obtido após nova centrifugação durante 10 min a 20.000 x g.

O sedimento nuclear foi ressuspenso em tampão de extracção de sal elevado ( HEPES 20 mM pH 7,9, NaCl 0,4 M, PMSF 1 mM, EDTA 1 mM, EGTA 1 mM, DTT 1 mM, 10 ug /mL de cada um de aprotinina, leupeptina e pepstatina) e incubada com agitação a 4 ° C durante 15 min . O extracto nuclear foi então centrifugada durante 15 min a 20.000 x g, e o sobrenadante foi dividido em alíquotas e armazenado a -80 ° C. A concentração de proteína foi determinada por um kit de ensaio de proteína Bio-Rad (Bio-Rad Laboratories). Para as análises de transferência de Western, as proteínas obtidas foram desafiados com anticorpos contra HIF-1α (anticorpo policlonal de coelho da Santa Cruz Biotechnology), aldolase A (Abnova), aldolase C (anticorpo policlonal de coelho da Santa Cruz Biotechnology) e β-actina (rato monoclonal a partir de Santa Cruz Biotechnology). Os sinais foram detectadas utilizando o kit ECL (GE Healthcare).

A imunoprecipitação

HCT-116 células foram lisadas em tampão RIPA (Tris-HCl 50 mM pH 8,0, NaCl 250 mM, 0,1 % de SDS, 1% de NP-40, 1% desoxicolato de sódio, EDTA 5 mM e DTT 1 mM) suplementado com inibidores de protease. As amostras (800 ug) foram pré-aclarados com 30 ul de proteína A /G PLUS-Agarose (Santa Cruz Biotechnology) durante 2 h a 4 ° C. Adicionou-se o (anticorpo policlonal de coelho da Santa Cruz Biotechnology) de anticorpo anti-HIF 1α de lisado e incubou-se durante a noite a 4 ° C e, em seguida, 30 ul de proteína A /G PLUS-Agarose foram adicionadas ao lisado. Depois de 1 h a 4 ° C, as proteínas foram recuperados em tampão de Laemmli, resolvida em gel desnaturante de 8% e, em seguida, submetida a imunotransf erência.

-PCR em tempo real Ensaio

O ARN total foi preparado a partir de HCT -116 células, utilizando o kit RNeasy Mini (Qiagen) e foi utilizado para sintetizar o ADNc com iniciadores aleatórios e hexanucleotide MultiScribe transcriptase (Invitrogen) inverter a 48 ° C durante 1 h. O cDNA foi então amplificado num sistema iCycler iQ detecção em tempo real de PCR (Bio-Rad Laboratories) utilizando SYBR Green Supermix iQTM (Bio-Rad Laboratories). O PCR em tempo real reacções e quantificação relativa do gene de expressão foram realizadas como descrito em [19]. As proporções entre 2

-ΔΔ

CT

antes do tratamento com L-carnosina e os calculados para as amostras incubadas com L-carnosina de 5 a 100 mM são expressos como alterações de dobragem.

Análise estatística

os resultados foram expressos como a média ± SDS (desvios padrão) de três experiências independentes. A análise estatística foi realizada por meio de análise de uma via da variância variância e valor P para um teste de comparação múltipla. O nível de significância estatística foi definida como ** P 0,001, *** p 0,0001 [2]. As análises foram realizadas utilizando o software GraphPad PRISM (versão 3.0; GraphPad Software, Inc .: La Jolla, CA, EUA, 2002) em uma plataforma Windows

Resultados

L-carnosina Reduz HIF. Níveis de proteína -1α afectar a sua estabilidade em células HCT-116

a fim de estabelecer o efeito do dipeptídeo L-carnosina na expressão do factor de transcrição HIF-1α, células de carcinoma do cólon humano (HCT-116) foram tratadas com diferentes concentrações de L-carnosina (de 0,5 a 100 mm). Em especial, a análise de RT-PCR, 24 h após a adição de L-carnosina, revelou um estado estacionário níveis de ARNm de HIF-1α, em comparação com células de controlo não tratadas (Figura 1A). Em seguida, foram avaliados os efeitos da L-carnosina na expressão da proteína HIF-1α nas células HCT-116 por análise de Western blot. Os níveis de proteína foram avaliadas tanto em hipoxia e normoxia, bem como na presença (de 0,5 a 100 mm) e ausência de L-carnosina. Nas células normóxicas HCT-116, 50-100 mM de L-carnosina reduz a expressão de HIF-1α em comparação com uma amostra de controlo não tratada com L-carnosina (Figura 1B). Também se observou que o (

2 por CoCl) a expressão induzida por hipoxia de HIF-1α diminuíram após o tratamento com 50 ou 100 mM de L-carnosina (Figura 1C). Os blots foram re-sondados com anticorpos contra β-actina para confirmar a equivalência carga de proteína. Para confirmar a redução do HIF-1α foi realizado um ensaio de imunoprecipitação. Descobrimos que o imunoprecipitado HIF-1α-anticorpo continha níveis significativos de proteína HIF-1α apenas na amostra de controlo (Figura 2A). Além disso, foi investigado o efeito da L-carnosina de síntese de proteínas após a HIF-1α em células tratadas com ciclo-heximida (CHX). A análise de estabilidade da proteína HIF-1α nas células tratadas com CHX mostrou que o nível de HIF-1α diminuição na L-carnosina de células tratadas (50-100 mM), sugerindo que a L-carnosina afecta a estabilidade da proteína HIF-1α (Fig. 2B). Além disso, nós examinamos se esta dipeptídeo pode estar envolvido na degradação de proteassoma de HIF-1α. Portanto, avaliou-se por análise Western Blot o efeito do inibidor de proteassoma MG132 nos níveis de proteína de HIF-1α após o tratamento com 50-100 mM de L-carnosina. Tal como mostrado na Figura 2C, o tratamento com MG132 1 mM e L-carnosina durante 24 h aumentou o nível de proteína HIF-1α em comparação com células de controlo não tratadas ou células tratadas só com MG132. Uma outra indicação para o envolvimento de L-carnosina na degradação de proteassoma HIF-1α foi obtido por transfecção de um vector contendo o domínio ímpar de HIF-1α. Como se mostra na Figura 2D, a actividade de luciferase diminuiu visivelmente 24 h após o tratamento com L-carnosina (100 mM).

(A) ARNm de HIF-1α foram medidos por PCR em tempo real em uma preparação de ARN total a partir de HCT -116 células 24 horas após o tratamento com L-carnosina. As barras brancas indicam mudanças de dobragem de ARNm em relação à quantidade de HIF-1α ARNm em células não tratadas avaliado como o valor 1; (B) Análise de transferência de Western de extractos de proteína total a partir de células HCT-116 24 h após

2 tratamento com L-carnosina e (C) de L-carnosina e CoCl sondadas com HIF-1α e anticorpos de p-actina. histogramas relacionadas reportar os valores densitométricos de relação de HIF-1α /β-actina. Os valores densitométricos representam a média ± SDs de três experiências independentes. As diferenças foram consideradas significativas para ** p 0,001, *** p 0,0001

(A) Análise de Western blot sondado com anticorpo anti-HIF 1α de proteínas imunoprecipitadas em HCT-116.; (B) Análise de transferência de Western de extractos de proteína total de HCT-116 células 24 h após a L-carnosina (100 mM) ou tratamento com L-carnosina (100 mM) mais ciclo-heximida a 10 mM (CHX) sondado com o HIF-1α e β-actina anticorpos. histogramas relacionados relatar os valores densitométricos de relação de HIF-1α /β-actina; (C) análise de transferência de Western de extractos de proteína total a partir de células HCT-116 de 24 h após a L-carnosina (100 mM) ou L-carnosina (100 mM) mais um tratamento MG132 mM sondadas com HIF-1α e anticorpos de p-actina. Os valores densitométricos representam a média ± SDs de três experiências independentes. As diferenças foram consideradas significativas para ** p 0,001, *** p 0,0001; (D) Representação esquemática da ODD-LUC repórter vetor. TDO-LUC vector contém o domínio de degradação dependente de oxigénio (TDO) do HIF-1α clonado a montante do gene da luciferase. A actividade de luciferase foi medida 48 h após a transfecção e representa a média ± SDs de três experiências independentes. Os valores têm sido relatados como percentagens da actividade de luciferase em comparação com 100% de células não tratadas.

L-carnosina Influência HIF-1α Translocação Nuclear reduzir a actividade transcricional do elemento responsivo hipoxia (HRE) ea expressão dos seus genes a jusante

proteína HIF-1α estabilizada transloca desde o citoplasma para o núcleo onde se dimeriza com HIF-1β formando o transcricionalmente activo complexo HIF-1. Portanto, a localização nuclear do HIF-1α é essencial para a actividade de transcrição de HIF-1α. O efeito de L-carnosina na localização intracelular do HIF-1α foi analisada num primeiro passo por ensaio de transferência de Western utilizando fracções de proteína citoplasmática e nuclear, e em seguida por análise de imunofluorescência. Como mostrado nas Figuras 3A e 3B, as influências de L-carnosina a translocação de HIF-1α a partir do citoplasma para o núcleo. Na verdade, quando as células HCT-116 foram tratados com L-carnosina os níveis de proteína nuclear de HIF-1α diminuiu visivelmente, enquanto que os níveis citossólicos não foram afectados. Também as células na análise de imunofluorescência (Figura 3C), o sinal de HIF-1α em L-carnosina tratados foi fracamente detectável em comparação com células de controlo não tratadas ou células CoCl

2-tratados. Em células de cancro, a activação do complexo HIF-1 implica a sua associação com o motivo HRE nas regiões reguladoras dos genes alvo envolvidas no processo glicolítica. Por este motivo, as células HCT-116 foram transientemente transfectadas com o plasmídeo repórter de luciferase de HRE-. Tal como mostrado na Figura 3D, o tratamento com 100 mM de L-carnosina causou uma diminuição apreciável da actividade da luciferase (24 h após o tratamento). Subsequentemente, foram avaliados os mRNAs de alguns genes de HIF-1a-dependente. Nós medido por análise de RT-PCR, os efeitos de diferentes concentrações de L-carnosina (0,5, 5, 50 e 100 mM) em níveis de ARNm de aldolase A e PDK-1. Como mostrado na Figura 4B, aldolase A e níveis de PDK-1 diminuiu ARNm após o tratamento com L-carnosina, especialmente entre 50 e 100 mm. A análise por Western blot da aldolase A demonstrou também uma redução do nível de proteína (Figura 4C). Além disso, observou-se que a expressão da proteína GLUT-1, assim como da proteína aldolase C, diminuiu após tratamento com L-carnosina (Figura 4D e 4E). Aldolase C é uma isoforma específica do cérebro de aldolase, mas, recentemente, tem sido demonstrado que o nível de ARNm de aldolase C é 30 vezes mais elevada em linhas celulares de cancro gástrico humano. As sequências de oligonucleótidos utilizadas nas análises de RT-PCR são apresentados na Figura 4A.

(A) análise de transferência de Western de citosólica e (B) Os extractos de proteína nuclear de células HCT-116 de 24 h após a 20-50-100 mM de tratamento com L-carnosina sondadas com HIF-1α, β-actina e anticorpos Histona H3. histogramas relacionados relatar os valores densitométricos de HIF-1α /β-actina e HIF-1α rácio /H3. Os valores densitométricos representam a média ± SDs de três experiências independentes. As diferenças foram consideradas significativas para *** p 0,0001; (C) HCT-116 tratado com CoCl

2 e 100 mM L-carnosina por 24 h examinados com microscópio de fluorescência a ampliação de 40x usando filtros para anticorpo secundário contra a proteína HIF-1α e para 4′-6′-diaminodino-2 -phenylindole (DAPI); (D) Representação esquemática do HRE-LUC repórter vetor. HRE-LUC vector contém nove sequências de repetição do elemento de resposta hipoxia (HRE) clonado a montante do gene da luciferase. A actividade de luciferase foi medida 48 h após a transfecção e representa a média ± SDs de três experiências independentes. Os valores têm sido relatados como percentagens da actividade de luciferase em comparação com 100% de células não tratadas

(A) O quadro mostra as sequências dos iniciadores utilizados nas experiências Real Time PCR.; (B) aldolase A e PDK-1 mRNA

S foram medidos por PCR em tempo real em uma preparação de ARN total a partir de células HCT-116 24 h após o tratamento com L-carnosina. As barras indicam mudanças de dobrar ARNm

S em relação à quantidade de aldolase A e PDK1 ARNm em células não tratadas avaliado como o valor 1; (C), (D) e (E) transferência de Western de extractos de análises de proteína total a partir de células HCT-116 24 h após o tratamento com L-carnosina sondadas com anticorpos aldolase de p-actina A, Aldolase C, GLUT-1 e. Histogramas reportar os valores densitométricos de aldolase relação A /β-actina, aldolase relação C /rácio β-actina e GLUT-1 /β-actina. Os valores densitométricos representam a média ± SDs de três experiências independentes. As diferenças foram consideradas significativas para ** p 0,001, *** p 0,0001

O antioxidante efeito dos compostos 1 e 2 Comparado com L-carnosina

A geração de. Reactive Oxygen Species (ROS) durante a hipóxia fornece um sinal de redox para a indução HIF-1α. Na verdade, alguns autores definem ROS como reguladores positivos de HIF-1α [20]. A observação de que outras substâncias antioxidantes podem influenciar o nível de proteína HIF-1α levou-nos a avaliar a actividade antioxidante de dois novos compostos bis-diaminotriazole (1 e 2) (Figura 5A), em comparação com a de L-carnosina, por DPPH ensaio. Primeiro, foi medida a percentagem de DPPH inactivação usando uma concentração de 1 mM para todos os compostos, e demonstrou-se que os compostos 1 e 2 possuem uma actividade importante como captadores de ERO em comparação com a L-carnosina (ver a tabela na Figura 5B). Em seguida, foi examinada a produção de ROS intracelular induzida por L-carnosina (100 mM) em HCT-116 células e comparado com a quantidade de ROS gerados por tratamento da mesma linha de células com diferentes concentrações (de 0,05 a 0,5 mM) de compostos 1 e 2. Como mostrado na Figura 5C, o tratamento com, 0,1 e 0,5 mM de 1 e 2 reduziu a geração de ROS intracelular em HCT-116 em cerca de 40-50%, de forma semelhante a 50-100 mM de L-carnosina. Finalmente, também avaliado o efeito de diferentes concentrações de 1 e 2 (de 0,05 a 0,5 mM) na expressão de HIF1-α e a viabilidade celular. Como mostrado nas Figuras 6A e 6B, a adição de 1 e 2 não afectou os níveis de proteína de HIF-1α nem a proliferação de células. Além disso, foi avaliada por ensaio de sobrevivência clonogénica a capacidade das células HCT-116 a proliferar e a formar uma grande colónia ou um clone na presença de L-carnosina ou um ou dois (Figura 6C). 50 mM de L-carnosina reduz significativamente o número de colónias no que diz respeito à amostra de controlo não tratada, enquanto que os compostos 1 e 2 não influenciou a capacidade das células para formar colónias na concentração testada. Um ensaio de citometria de fluxo (FACS) confirmou que 1 e 2 não afectar o ciclo celular e não induzir a apoptose em células HCT-116 (dados não apresentados). A taxa de morte apoptótica precoce no HCT-116 células tratadas com os dois compostos não foi significativamente diferente do da amostra de controlo

(A) As estruturas químicas dos compostos 1 e 2.; (B) actividade antioxidante de L-carnosina, 1 e 2 medido pelo método de DPPH como descrito na secção 1.2.4; (C) ROS produção avaliada 24 h após a adição de L-carnosina, 1 e 2 em células HCT-116 pela sonda de 2 ‘, 7’-diclorofluoresceína-diacetato (H2DCF-DA). Todos os valores representam a média ± SDs de três experiências independentes e estão expressos como um percentagem em comparação com 100% de células de controlo. Foram consideradas as diferenças significativas em ** p 0,001, *** p . 0,0001

(A) Análise de Western blot dos extratos de proteína total de HCT-116 células após o tratamento com os compostos 1 e 2 sondadas com HIF-1α e anticorpos de p-actina. Histogramas reportar os valores densitométricos de relação de HIF-1α /β-actina. Os valores densitométricos representam a média ± SDs de três experiências independentes; (B) A proliferação de células foi medido pelo ensaio de MTT em células HCT-116 em 24 h após tratamento com os compostos 1 e 2. Todos os valores representam a média ± SDs de três experiências independentes e estão expressos como um percentagem em comparação com 100% de células de controlo ; (C) ensaio de sobrevivência clonogénica em HCT-116 após tratamento com L-carnosina (50 mM) ou os compostos 1 e 2 (0,5 mM) em relação às células não tratadas.

Discussão

neste estudo, avaliou-se o efeito do tratamento com L-carnosina na actividade de HIF-1α em células de cancro do cólon humano.