Abstract

Fundo

Apesar de sua resposta inicial positiva à terapia de ablação hormonal, cancros da próstata, invariavelmente, se repetem em formas mais agressivas, resistentes ao tratamento. A falta de nossa compreensão de alterações genéticas subjacentes para a transição de andrógeno-dependentes (AD) para o crescimento do câncer de próstata ADI dificulta nossa capacidade de desenvolver estratégias terapêuticas impulsionado-alvo para o tratamento eficaz do câncer de próstata ADI.

Metodologia /As principais conclusões

por rastreio de uma biblioteca de quinases humanas activadas, identificamos

TPL2

, que codifica uma serina /treonina quinase, como o motor do crescimento do câncer de próstata ADI. TPL2 activação por sobre-expressão quer de tipo selvagem ou uma forma constitutivamente activada do crescimento induzida TPL2 DDA, enquanto a supressão de

TPL2

expressão e a sua actividade de cinase em células de cancro da próstata ADI inibiu a proliferação de células sob condições de depleção de andrógeno . Mais importante ainda,

TPL2

é regulada na ADI cancros da próstata, tanto do

Pten

modelo de exclusão do mouse e os espécimes de cancro da próstata clínicos.

Conclusões /Significado

em conjunto, estes dados sugerem que o

TPL2

quinase desempenha um papel fundamental na promoção da ADI progressão do câncer de próstata. Além disso, a supressão de TPL2 diminui o crescimento do câncer de próstata ADI e uma elevada frequência de TPL2 superexpressão em amostras de câncer de próstata ADI humanos valida TPL2 como um alvo para o tratamento desta doença mortal

Citation:. Jeong JH, Bhatia A , Toth Z, Oh S, Inn KS, Liao CP, et al. (2011)

TPL2 /COT /MAP3K8 (TPL2)

Activation Promove andrógeno Esgotamento-Independente (ADI) Crescimento do cancro da próstata. PLoS ONE 6 (1): e16205. doi: 10.1371 /journal.pone.0016205

editor: Jean-Marc Vanacker, Institut de Génomique fonctionnelle de Lyon, França |

Recebido: 07 de setembro de 2010; Aceito: 08 de dezembro de 2010; Publicação: 18 de janeiro de 2011

Direitos de autor: © 2011 Jeong et al. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Licença Creative Commons Attribution, que permite uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o autor original ea fonte sejam creditados

Financiamento:. Este trabalho foi financiado e apoiado pelo Departamento de Defesa 060.868 e ACS concessão IRG-58-007-48 para JHJ, NIH concede CA 109147 e R01 CA 136924 para GAC, NIH concede CA 59705 e CA 113392 a PRB, e CA082057, CA31363, CA115284, AI083025, DE019085, CA148616, Fundação Hastings, e Fletcher Jones Foundation para JUJ. (https://cdmrp.army.mil/, https://www.cancer.org/, https://www.nih.gov/, https://www.fletcherjonesfdn.org/). Os financiadores não tiveram nenhum papel no desenho do estudo, coleta de dados e análise, decisão de publicar ou preparação do manuscrito

CONFLITO DE INTERESSES:.. Os autores declararam que não existem interesses conflitantes

Introdução

o câncer de próstata afeta 1 em cada 6 homens americanos, com mais de 2 milhões vivem atualmente com a doença. A cirurgia é eficaz, com quase 100% dos pacientes restantes livre de cancro há vários anos, se a doença é detectada precocemente e as células cancerosas estão confinados à próstata [1]. No entanto, uma vez que o câncer se espalha além da próstata, o resultado é quase sempre fatal. Dado que as células de cancro da próstata requerem testosterona para alimentar o seu crescimento e sobrevivência, a terapia de privação de androgênio foi concebido para deter o crescimento do cancro por qualquer paragem da produção de testosterona ou prevenir a hormona de agir em células de cancro da próstata [2]. Apesar da resposta inicial positiva à terapia hormonal, células cancerosas da próstata, invariavelmente recorrem de uma forma agressiva, andrógeno independente de esgotamento (ADI). Enquanto as alterações genéticas relacionadas com a iniciação e progressão do cancro da próstata têm sido intensamente estudadas [3], [4], [5], [6], [7], que estão subjacentes a transição de androgénio-dependente (AD) para ADI próstata o crescimento do cancro são relativamente menos bem compreendido. Esta falta de entendimento dificulta nossa capacidade de desenvolver estratégias terapêuticas impulsionado-alvo para o tratamento eficaz do câncer de próstata ADI.

Na presença de andrógeno, o receptor de andrógeno (AR) sofre fosforilação, dimerização e translocação para o núcleo, em que se liga a elementos de resposta de androgénio (ARE) locais, resultando na activação da transcrição de genes alvo [8]. No entanto, dados convincentes, incluindo ARNi knockdown e a introdução de antagonistas do receptor de androgénio (AR), indicam que a RA é ainda necessário para o crescimento do cancro da próstata ADI [9], [10], [11]. Portanto, sob condições de depleção de androgênio, ADI células cancerosas da próstata parecem desenvolver estratégias intracelulares que ativam a via de sinalização AR. Muitos mecanismos subjacentes têm sido propostas: aumento

expressão AR

através de

AR

amplificação do gene, o aumento da

AR

sensibilidade através da estabilidade AR reforçada e localização nuclear, ampliou AR ligando de especificidade por meio de mutações no seu domínio de ligação a ligando, e o aumento da actividade de AR através de modificações pós-traducionais [12], [13], [14], [15], [16], [17], [18]. Por outro lado, a activação de outras vias de transdução de sinal, tais como a activação de BCL-2, pode também ultrapassar o requisito de activação de AR para a proliferação e sobrevivência de células de cancro da próstata [19]. Finalmente, uma subpopulação preexistente de células de câncer de próstata ADI com progenitor /células-tronco traços podem tornar-se dominante em condições de depleção de androgênio [20].

Muitos estudos revelam que a ativação da via RAS /RAF /MEK /ERK podem ser correlacionados com o crescimento do cancro da próstata ADI [5], [13], [21], [22]. Recentemente, um modelo de rato geneticamente modificadas (GEM), em que a expressão de um activador potente de sinalização RAS-MAPK, B-RAF

E600, é voltado para o epitélio da próstata utilizando um sistema tet-induzível, desenvolvido adenocarcinoma invasivo e isso ainda mais evoluíram para lesões ADI indolentes após a castração [23]. No entanto, contra-intuitivamente, mutações ativadoras da via RAS /RAF /MEK /ERK são pouco frequentes em cancros da próstata humanos, embora loops de fator de crescimento autócrinos e parácrinos parece activar a via [24], [25]. Importante, um estudo recente propôs que rearranjos cromossômicos da via RAF quinase é uma fonte adicional de MEK /ERK sinalização de ativação, contribuindo para o desenvolvimento e progressão [26] câncer de próstata.

A fim de identificar novos genes quinase relacionada para o crescimento do câncer de próstata ADI, nós analisamos uma biblioteca de quinases humanas activadas. Aqui, relatamos a identificação de uma cinase de serina /treonina,

TPL2

, como dirigindo o crescimento do cancro da próstata ADI através da activação da via de sinalização de MEK /ERK e NF-kB. Isto fornece uma pista para encontrar fontes adicionais de MEK /ERK ativação da via em cancros da próstata ADI. Além disso, a supressão de TPL2 diminui o crescimento do câncer de próstata ADI e uma elevada frequência de TPL2 superexpressão em amostras de câncer de próstata ADI humanos valida TPL2 como um alvo para o tratamento desta doença mortal.

Resultados

a identificação de TPL2, por rastreio de uma biblioteca de quinases humanos activados

para identificar novos genes quinase relacionadas com o crescimento do câncer de próstata ADI, nós analisamos uma biblioteca de 354 cinases humanas activadas composta de 98 quadros de leitura aberta relacionada com quinase ( ORFs) e 256 quinases humanos clonados num vector gateway compatível retroviral destino, pWN-MF-DEST, em que uma sequência de miristoilação e uma etiqueta de epitopo-FLAG (MF) foram adicionados ao terminal N de cada ORF introduzido [27] . Como uma leitura para a tela, foi utilizada uma construção repórter contendo o

cis e região promotora -regulatory (5,8 kb contendo um

AR

potenciador) do antígeno prostático específico (

PSA

) gene, que é altamente expresso no epitélio da próstata normal e em tumor da próstata [28], [29]. A actividade /intensificador de promotor pode ser medida por um fundido

luciferase

gene repórter (Figura 1A). A fim de identificar possíveis genes da quinase capaz de induzir a atividade transcricional do

PSA

potenciador /promotor de

cis região dos -regulatory sob condições de depleção de androgênio, cada construção quinase, juntamente com o plasmídeo repórter , foi co-transfectado em poços individuais de uma placa de 12 poços contendo células LNCaP dependente de androgénios células (AD-LNCaP) cultivadas em meios suplementados com R1881, um androgénio sintético (Figura 1A). Vinte e quatro horas após a transfecção, as células DA-LNCaP foram incubadas com o meio contendo 10% de soro bovino fetal despojado com carvão (CS-FBS) sem R1881. Após 24 horas de incubação, a atividade transcricional do

PSA

potenciador /promotor de

cis região dos -regulatory sob condições de depleção de androgênio foi medida por ensaios de luciferase. De 354 genes humanos activados quinase, a expressão de

TPL2

gene nas células DA-LNCaP induzida o mais elevado nível de actividade de transcrição de PSA na ausência de R1881 (Figura 1B superior). Como controlos, outros oncogenes, tais como o

RAF

e

RAS

que foram conhecidos previamente para ser associada com o crescimento do cancro da próstata ADI, foram incluídos [5], [22], [23] , [26], [30]. Sua expressão, na verdade, induzem a atividade transcricional do

PSA

potenciador /promotor de

cis região dos -regulatory sob condições de depleção de androgênio para alguns, mas menor grau do que

TPL2

. No entanto, quando testados em receptor de androgénio (AR) DU-145 células de cancro da próstata -negativas,

TPL2

não induziu a actividade transcricional de ADI, o que sugere que a expressão de AR é necessário para a activação da transcrição de ADI

PSA

potenciador /promotor de

cis região dos -regulatory induzida pela

TPL2

(Figura 1B média; observe a mudança na escala do eixo Y). Por outro lado, as células (ADI-C4-2B) andrógeno independente de esgotamento C4-2B apresentaram altos níveis endógenos de atividade transcricional do

PSA

potenciador /promotor de

cis e região regulamentares no a ausência de R1881 (Figura 1B inferior). Esses dados levantam a possibilidade de que preexistente alterações genéticas e epigenéticas em células ADI-C4-2B contribuir para o elevado nível endógeno da atividade transcricional ADI impulsionado pelo

PSA

potenciador /promotor de

cis

-regulatory região. Note-se a indução da atividade transcricional do

PSA

potenciador /promotor de

cis região dos -regulatory pelo

TPL2

superexpressão nas células DA-LNCaP foi mais acentuada (maior do que 20 vezes) em níveis baixos (0.1~0.001 nM) de R1881, o que é comparável com os níveis fisiológicos de androgénio em pacientes que tenham sido submetidos a cirurgia de castração (Figura 1C). Além disso, a ADI de activação da transcrição foi revogada através de um tratamento inibidor TPL2 quando quer com TPL2 sobre-expressão nas células DA-LNCaP ou simplesmente com expressão endógena em células TPL2 ADI-C4-2B (Figura 1D). Para testar a possibilidade de que o alto nível endógeno da atividade transcricional ADI do

PSA

potenciador /promotor de

cis e região regulamentares no células ADI-C4-2B pode ser devido ao aumento da expressão TPL2, comparamos o nível de expressão

TPL2

em células AD-LNCaP e ADI-C4-2B. De fato, as células ADI-C4-2B apresentaram maior nível de

TPL2

expressão do que nas células DA-LNCaP (Figura S1A). Além disso, em células C4-2B, actividade PSA potenciador /promotor responde aos baixos níveis de expressão TPL2 exógeno, mas não a níveis elevados de expressão TPL2 (Figura S1B). É possível que níveis elevados de expressão exógeno em células TPL2 C4-2B, que já expressam um nível mais elevado de expressão TPL2 endógena do que as células LNCaP, resultar em efeitos adversos sobre a actividade de PSA potenciador /promotor. Por isso, nós identificamos

TPL2

como um oncogene candidato, que pode estar associada com o crescimento do cancro da próstata ADI.

(A) Representação esquemática da identificação de genes candidatos que podem induzir a activação da transcrição de um

PSA

potenciador /promotor de

cis

repórter região -regulatory construir sob condições de depleção de andrógenos em células LNCaP andrógeno-dependentes. Myr, sequência miristoila�o; SÃO, elementos de resposta a andrógeno; CS-FBS, soro bovino fetal despojado com carvão. (B) actividade LUC relativa (o

actividade PSA

potenciador /promotor de luciferase normalizada para a actividade de beta-galactosidase pGL3) foi medido após 24 horas de incubação com 10% de CS-FBS sem R1881 (excepto para o segundo coluna com 10% de CS-FBS + 1 nM R1881 como um controlo), a seguir à co-transf ecção de plasmídeos que expressam formas constitutivamente activados dos genes indicados quinase. Os valores de indução de dobragem (actividade LUC relativa dividido pela actividade basal LUC relativa do controlo de vector) são indicados no gráfico para as células LNCaP. atividades LUC relativa sobre

TPL2

expressão são indicados em vermelho. Aumentos estatisticamente significativos nas actividades de LUC em comparação com o controlo de vector sem tratamento R1881 são marcados com * (P 0,05). (C) A actividade LUC relativa com o aumento da concentração de R1881 em células LNCaP transientemente co-transfectadas com plasmídeos que expressam miristoilada

TPL2

ou com vector vazio. Aumentos estatisticamente significativos na actividade LUC em comparação com cada concentração R1881 correspondente com controlo de vector são marcados com * (P 0,05). (D) A actividade LUC relativa com o aumento da concentração de inibidor TPL2 quer nas células DA-LNCaP transientemente co-transfectadas com plasmídeos que expressam miristoilada

TPL2

ou em células não transfectadas AI-C4-2B. atividades LUC em relação com /sem R1881 são indicados em preto como controles. Aumentos estatisticamente significativos nas actividades de LUC em comparação com o controlo de vector sem tratamento R1881 são marcados com * (P 0,05). Todos os experimentos foram realizados três vezes com cada uma em triplicado, e cada coluna representa a média ± desvio padrão.

TPL2 Activation indutor de crescimento ADI do AD células cancerosas da próstata

Para verificar se

TPL2

está funcionalmente associado com o crescimento de células de câncer de próstata ADI, investigamos as conseqüências funcionais da superexpressão ou supressão de

TPL2

nas células dA ou câncer de próstata ADI, respectivamente. Em primeiro lugar, para determinar se

TPL2

superexpressão é suficiente para promover o crescimento do câncer de próstata ADI, estabelecemos linhas de células estáveis ​​AD-LNCaP com superexpressão quer N-terminal de tipo selvagem marcada com myc [

myc-TPL2

(WT)], uma forma constitutivamente activado com uma deleção de ácidos 70 aminoácidos no seu terminal C [

myc-TPL2

(Sc)], ou uma forma quinase inactiva do

TPL2

[

myc-TPL2

(D270A)] utilizando o vector pBabe-Puro (Figura 2A). A expressão de cada gene transduzido foi confirmada por Western blot (Figura 2B). Curiosamente, a expressão de

myc-TPL2

(Sc) mutante constitutivamente activado foi menor do que a de

myc-TPL2

(WT) e

myc-TPL2

mutante D270A apesar tendo o nível mais alto de fósforo-ERK, uma molécula de sinalização a jusante (Figura 2B). Para eliminar a possibilidade de efeitos de nível de expressão, nós estabelecemos um outro conjunto de linhas celulares estáveis ​​AD-LNCaP que a sobre-expressar tanto no terminal C flag-etiquetado do tipo selvagem (

TPL2

-wt-bandeira), um constitutivamente forma ativada com uma deleção de 70 aminoácidos no terminal C (

TPL2

-delC-bandeira), ou uma forma quinase inactiva do

TPL2

(

TPL2 viajantes – inactiva-flag) utilizando o vector pEF-IRES-Puro (Figura S2). Esta condição também mostrou a menor expressão de

TPL2

-delC-bandeira de

TPL2

-wt-bandeira e

TPL2

-inactive-bandeira (Figura S2), sugerindo que a expressão de uma forma constitutivamente activado de

TPL2

acima dos níveis fisiológicos podem ter efeitos adversos sobre a célula. No entanto, independentemente

TPL2

níveis de expressão, as células globais LNCaP que expressam tanto

myc-TPL2

(WT) ou myc-

TPL2

(Sc) mostrou acelerada proliferação celular na androgénio privados, -baixo, e as condições ricas em comparação com células LNCaP que expressam quer apenas o vector ou myc-

TPL2

mutante (D270A) (Figura 2C). Em particular, as células LNCaP que expressam myc-

TPL2

(Sc) mostraram aumentos estatisticamente significativos da proliferação celular em comparação com células de controlo (LNCaP-GFP), sob a condição de depleção de androgénio e a baixos níveis de R1881 (0,01 nM e 0,1 nM) em 3, 6, 9 dias (* p 0,05). Dados semelhantes foram obtidos com linhas celulares estáveis ​​construídos com o vector pEF-IRES-Puro (Figura S2). Portanto, estes dados indicam que

TPL2

activação por sobre-expressão quer de tipo selvagem ou uma forma constitutivamente activado de TPL2 leva à promoção do crescimento ADI das células AD-LNCaP.

(A ) Esquema de linhas de células LNCaP estáveis ​​estabelecidas com superexpressão quer

GFP

, um tipo selvagem marcado com myc

TPL2

[

myc-TPL2

(WT)], um myc- etiquetado forma constitutivamente activado de

TPL2

com uma truncagem de ácidos 70 aminoácidos no seu terminal C [

myc-TPL2

(Sc)], ou uma forma quinase inactiva myc-tag de

TPL2

[

myc-TPL2

(D270A)] usando o vetor de expressão pBabe-puro. (B) Análise de transferência de Western para detectar a expressão do

TPL2

construções anteriores (como indicado com setas em vermelho). β-actina foi utilizado como um controlo para carregar a mesma quantidade de proteínas. (C) Ensaios de MTT para medir a proliferação de células das linhas de células estáveis ​​acima, na ausência ou com níveis reduzidos de R1881 (0,01 nM, 0,1 nM e 1 nM). aumentos estatisticamente significativos na proliferação celular, em comparação com células de controlo (LNCaP-GFP) estão marcados com * (p 0,05).

A repressão do TPL2 expressão ou inibição da sua atividade da quinase na ADI cancro da próstata células resulta na reduziu a proliferação fenótipos

em seguida, para determinar se as células cancerosas da próstata ADI são dependentes

TPL2

para o seu crescimento celular ADI, que suprimiu

TPL2

expressão ou actividade seja por knockdown ou por tratamento com inibidor da TPL2, respectivamente shRNA-mediada. Como mostrado na Figura S1,

TPL2

expressão foi mais elevada em células é ADI-C4-2B do que nas células DA-LNCaP. A expressão diminuída de

TPL2

em células ADI-C4-2B por knockdown shRNA mediada utilizando o vector pLKO.1-TRC foi confirmada por Western blot (Figura 3A). células ADI-C4-2B com uma expressão diminuída de

TPL2

mostrou significativamente reduzida taxa de proliferação em condições de depleção de androgênio (Figura 3B). Nós confirmaram estes dados pelo sistema knockdown adicional shRNA mediada usando o vetor de lentivírus pGIPZ (Figura S3). Além disso, o crescimento celular de células ADI ADI-C4-2B foi também significativamente diminuída mediante o tratamento de um inibidor TPL2 [Figura 3C; A concentração inibidora de 50% (IC

50) de 4,0 pM foi determinada tal como na Figura S4]. A supressão da via de MEK /ERK em células ADI-C4-2B com o tratamento de TPL2 foi confirmada por Western blot (Figura 3D). Juntos, estes dados indicam que

TPL2

de ativação é necessário para o crescimento eficiente ADI das células ADI-C4-2B.

(A) Análise de Western blot para mostrar a quantidade de

TPL2

expressão em linhas de células estáveis ​​que expressam os C4-2B shRNAs indicadas usando o vetor lentiviral pLKO.1-TRC no momento do ensaio MTT seguinte. β-actina foi utilizado como um controlo para carregar a mesma quantidade de proteínas. Os ensaios (B) MTT para medir a proliferação celular de linhas celulares estáveis ​​na ausência de R1881. * P 0,05. (C) Ensaios de MTT para medir a proliferação celular de células C4-2B independente de depleção androgénica com o tratamento de inibidor TPL2 (4 uM). (D) A supressão da via de MEK /ERK em células ADI-C4-2B com o aumento da concentração de um inibidor TPL2 foi confirmada por Western blot.

TPL2 Activação ADI Promove o crescimento do cancro da próstata em PTEN Supressão Modelo rato

Anteriormente, tinha sido demonstrado que bialélico eliminação Pten condicional no epitélio da próstata poderia induzir adenocarcinoma que recapitula a maioria das características histopatológicas do câncer de próstata humana [31], [32], [33]. Mais importante ainda, ablação de androgénios de estes ratos por castração cirúrgica levou ao surgimento de ADI crescimento do cancro da próstata (Figura 4A) [33]. Recentemente, linhas celulares de cancro da próstata foram estabelecidas a partir de cancros da próstata primários do

Pten

modelo de exclusão [34]. Após cultura a longo prazo destas células sob condições de depleção de androgénios, ADI-células cancerosas da próstata como células designada como “E” evoluíram na sequência de uma morte celular massiva de células inicial AD. Além disso, as linhas de células de câncer de próstata também foram estabelecidas a partir de câncer de próstata ADI recorrente que se desenvolveu após a castração cirúrgica e células nomeadas “CE” [34]. Ao contrário das células de E, estas linhas celulares são CE andrógeno independente de esgotamento a partir do início de tal forma que não havia nenhuma morte celular em massa inicial sob condições de depleção de androgênio. Para investigar se a

TPL2

activação é fisiologicamente relevante para o crescimento do tumor ADI

in vivo

, primeiro compararam os níveis de expressão

TPL2

entre E linhas celulares (E2 e E4) e linhas de células do CE (CE1, CE2 e CE3). linhagens de células CE (CE1, CE2 e CE3) apresentaram níveis mais elevados de

TPL2

expressão em comparação com linhagens de células E (E2 e E4) por western blot e imunohistoquímica (Figura 4B e 4C). Curiosamente, as linhas celulares E apresentaram níveis ligeiramente mais elevados de

expressão AR

do que linhas de células do CE, sugerindo que as linhas de células E pode ter adquirido o crescimento ADI embora AR superexpressão (Figura 4B). O crescimento celular de células ADI CE (CE1, CE2 e CE3) foi mais do que impactado nomeadamente células E (E2 e E4), quando tratados com doses crescentes de um inibidor de TPL2 (Figura 4D). Coletivamente, essas observações sugerem que

TPL2

também é necessária para o crescimento celular eficiente ADI câncer de próstata no modelo do rato.

(A) Esquema do “Pb-Cre4 :: Pten

f /f :: β-Actinp-GFP

f /f-Luc “modelo de rato, em que

PTEN

alelos estão homozigoticamente excluído e

luciferase

é expresso no epitélio da próstata por o específico da próstata

probasina

promotor (Pb) -driven Cre recombinase expressão. Estes ratinhos desenvolveram compostos neoplasia intra-epitelial da próstata (PIN), adenocarcinoma invasivo da próstata, e cancro da próstata metastático nos tempos indicados. Mais importante ainda, ablação de androgénios de estes ratos por castração cirúrgica levou ao surgimento de crescimento do cancro da próstata em ADI vezes variando de 7 a 28 semanas pós-castração em todos os ratos vivos. linhas celulares de cancro da próstata E2 e E4 foram estabelecidos inicialmente a partir de células de câncer de próstata primário antes da castração que mais tarde evoluiu crescimento ADI sobre a cultura de longo prazo em condições de depleção de androgênio. No entanto, as linhas celulares de cancro da próstata CE1, CE2 e CE3 foram estabelecidas a partir de cancros da próstata ADI após a castração. Fotografias (200X) são representativos de morfologias celulares de células de E2 e CE1. (B) Análise de transferência de Western para comparar os níveis de expressão de AR e TPL2 entre linhas de células E (E2 e E4) e linhas celulares de células do CE (CE1, CE2 e CE3).

β-actina

foi utilizado como um controlo para carregar a mesma quantidade de proteínas. AD, dependente de androgénios; ADI, andrógeno depleção de independentes; e AR, receptor de andrógeno. (C) Análise imuno-histoquímica para examinar

expressão TPL2

no AD e ADI próstata do

Pten

modelo de exclusão mouse. duodeno tecido humano que expressa níveis elevados de TPL2 endógena foi usada como um controlo positivo (canto superior direito). Como um controlo negativo, o tecido foi corado apenas com o anticorpo secundário (superior esquerdo). APC, adenocarcinoma prostático. (D) Ensaios de MTT para medir a proliferação celular de células E (E2 e E4) e células do CE (CE1 e CE3) com o tratamento de diferentes níveis de inibidor TPL2 (0, 1, 5 ou 10 uM). reduções estatisticamente significativas na proliferação celular em comparação com o tratamento veículo estão marcados com * (p 0,05).

expressão TPL2 é regulada em amostras de câncer de próstata ADI humanos

Finalmente, para validar a relevância clínica da

TPL2

ação quinase no crescimento do câncer de próstata ADI humano, examinamos a frequência de

expressão TPL2

na ADI espécimes de cancro da próstata humana utilizando microarrays de tecido (TMA). Avaliou-se a imunocoloração TPL2 de 12 normal (N), 52 hormone-naïve (HN), 52 hormônio-refratário (HR), 26 hormone-naïve metastático (HN Met), e 12 metastático hormônio-refratário (HR Met) fixados em formalina parafina amostras incorporados. A Figura 5A mostra fotos representativas da expressão TPL2 de próstata normal, o câncer de próstata hormônio-naive, e próstata humana amostras hormônio-refratário cancro da próstata TMA. Como mostrado na Figura 5B, a frequência global de coloração TPL2 aumentou em amostras de hormona não tratados (34,8%) e refractário a hormonas (36,5%) em comparação com amostras de próstata normal (18,2%). Os aumentos são mais significativa em amostras de cancro da próstata metastático com 46,2% (p 0,05) de metastático hormona-ingénuos e 41,7% de amostras metastático refractário a hormonas, sugerindo que a expressão TPL2 pode também ser associado com a metástase do cancro da próstata. Em particular, tanto a marcação com média geral ea frequência de amostras com um esforço forte escore aumentou com a progressão do câncer de próstata (Figura 5B). Tomados em conjunto, estes dados sugerem que a expressão TMA TPL2 é regulada com a progressão do câncer de próstata.

(A) fotos representativas de cada próstata normal (N), o câncer de próstata hormônio-naïve (HN), hormônio-refratário cancro da próstata (HR), câncer de próstata metastático hormônio-naïve (HN Met), e cancro da próstata metastático hormônio-refratário (HR Met) dos microarrays de tecido da próstata humana manchadas. TPL2 expressão foi detectada através de análise imuno-histoquímica utilizando um anticorpo contra TPL2. (B) Análise estatística de expressão TPL2 em cada grupo de N, HN, HR, HN Met, amostras HR Met dos microarrays de tecido da próstata humana coradas em termos de graus de marcação médios e percentual de coloração. As diferenças estatisticamente significativas na pontuação média coloração é marcado com * (p 0,05). o número total de amostra para cada grupo são anotados. intensidade da coloração foi marcado de forma independente por dois patologistas urológicas com 0 (sem coloração), 1 (coloração fraca), 2 (coloração intermediária) e 3 (coloração forte) para cada amostra.

Discussão

o câncer de próstata pode ser facilmente tratada e curada se for detectado em seus estágios iniciais, quando o crescimento do tumor ainda está confinado à próstata. No entanto, uma vez que o cancro se espalha para fora da glândula da próstata, o tratamento torna-se difícil, embora as opções de tratamento, tais como terapia de radiação, terapia hormonal, e quimioterapia são usadas com diferentes graus de eficácia. O surgimento de uma forma mais agressiva, andrógeno independente de esgotamento (ADI) de câncer de próstata é uma complicação frequente ocorrência e razão para a falha da terapia hormonal. Portanto, estudos associados com a identificação e caracterização da genética subjacentes crescimento do câncer de próstata ADI são fundamentais para futuros desenvolvimentos de estratégias terapêuticas impulsionado-alvo para o tratamento eficaz do câncer de próstata ADI. Neste estudo, por rastreio de uma biblioteca de quinases humanas activadas, foram identificados e caracterizados um gene quinase,

TPL2

, que aparece para promover o crescimento do cancro da próstata ADI. Mais importante,

TPL2

é regulada na ADI cancros da próstata, tanto do

Pten

modelo de exclusão do mouse e os espécimes de cancro da próstata clínicos. Estes dados sugerem fortemente que

TPL2

quinase desempenha um papel fundamental na promoção da progressão do câncer de próstata ADI.

TPL2

, também conhecida como a progressão do tumor lócus 2, que codifica uma produto com uma deleção da sua região C-terminal foi inicialmente clonado como um gene transformante a partir de uma linha de células de carcinoma da tiróide humana, e foi chamado

berço

(Osaka cancro da tiróide) [35]. Quase ao mesmo tempo, também foi identificada como uma quinase de proteína associada com o desenvolvimento de linfoma de células T, quando se descobriu que a Moloney da leucemia murina genoma proviral tinha integrado no último intrão do

TPL2

gene resultando numa supressão do seu C-terminal [36]. Um estudo de ratinho transgénico mostrou que apenas os ratinhos transgénicos que expressam uma forma suprimidos do terminal C de

TPL2

sob o controlo de uma extremidade proximal

Lck

promotor desenvolveram linfoma de células T, sugerindo que o C-terminal domínio de tipo selvagem

TPL2

desempenha um papel inibitório na sua actividade de quinase [37]. Na verdade, o C-terminal suprimido TPL2 tem maior estabilidade e uma actividade de cinase específica mais elevada do que o de tipo selvagem. Além disso, TPL2 interage com um regulador negativo, a proteína de NF-kB-inibidor NF-κB1 p105 através da sua extremidade C-terminal, e, assim, o C-terminal suprimido TPL2 é insensível a regulação negativa p105 [38], [39]. Curiosamente,

TPL2

expressão é também regulada em aproximadamente 40% dos espécimes de cancro da mama humano, que podem ser causados ​​por um aumento na

TPL2

números de cópias do gene [40]. Portanto, é importante para determinar se a activação de sinalização TPL2 em amostras de cancro de próstata humanas pode ser devido a mutação genética a uma região C-terminal ou um aumento do número de cópias do gene. Nossos dados mostraram que TPL2 é expresso em nível mais elevado em células ADI-C4-2B do que nas células DA-LNCaP, contribuindo assim para o alto nível endógeno da ADI activação da transcrição da

PSA

potenciador /promotor de

cis e região regulamentares no células ADI-C4-2B (Figura S1). Também comparamos a

TPL2

sequências de duas linhas de células, mas não detectou nenhuma diferença sequência, sugerindo que o fenótipo ADI das células C4-2B não está associado com mutações específicas no

TPL2

gene. Além disso, um estudo anterior demonstrou que o nível de ARNm de

TPL2

na próstata do rato aumentou após a castração cirúrgica, mas subsequentemente diminuiu após a re-administração de testosterona [41]. Estes dados sugerem que microarray

expressão TPL2

na próstata é inversamente regulada pela testosterona ao nível da transcrição. Portanto, é possível que a redução do nível de androgénio com a terapia hormonal pode aumentar a expressão TPL2, resultando em sobrevivência de células de cancro da próstata e a proliferação sob condições de depleção de androgênio. Esta hipótese está sob investigação activa.

Na presença de androgénio, AR sofre fosforilação, dimerização, e a translocação para o núcleo, onde se liga a são locais, resultando na activação da transcrição de genes alvo [8] . No entanto, vários relatórios indicam que a RA é ainda necessário para o crescimento do cancro da próstata ADI [9], [10]. Quanto aos mecanismos subjacentes de crescimento do câncer de próstata ADI TPL2 mediada, a questão é se essa ação requer expressão AR e atividade. A revogação da ativação do promotor PSA TPL2 mediada em DU-145 células de câncer de próstata AR-negativos sugere que

TPL2

mediada ADI crescimento do câncer de próstata pode ser ainda dependente da actividade da AR.