Abstract

cancro do pulmão de pequenas células (CPPC) é altamente agressivo e é caracterizada por metástase maligna . Aproximadamente 90% dos pacientes morrem devido à grande metástase. A matriz extracelular (ECM) é uma barreira natural que pode prevenir a invasão celular e metástase. Por conseguinte, a degradação da ECM devem ter lugar de forma extensa para metástases de ocorrer. Proteína Adam (ADAM) é uma protease de múltiplos domínios, que desempenha um importante papel na tumorigénese, bem como o desenvolvimento de tumores, invasão e metástase. No entanto, tem havido poucos relatos sobre a expressão eo papel da Adams em SCLC. No estudo atual, a expressão eo papel da Adams em proliferação SCLC, invasão e metástase foi investigada. Um total de 150 amostras de tecido SCLC foram examinados por imuno-histoquímica para a expressão Adams. ADAM-12 foi encontrado para ser expresso abundantemente em amostras de 72,67% e outra ADAMs foram encontrados para ser expresso em 10% a 40% das amostras. Adam-12 no soro e na urina, de 70 doentes com CPPC e 40 controles normais, também foram medidos através de ELISA. ADAM-12 foi significativamente maior em pacientes SCLC do que nos controlos saudáveis ​​e em pacientes com doença extensa em comparação com aqueles com doença mais limitada. Silenciar a expressão de ADAM-12 em células H1688 com o uso de siRNA específico significativamente reduzido proliferação celular, invasão e metástase. Completando a expressão de ADAM-12-L ou -S em H345 células, aumentou significativamente celular proliferação, invasão e metástase. Os modelos animais com CPPC metastático também apresentaram aumento da expressão de ADAM-12, juntamente com a invasão aumentada e metástase. Em breve, o ADAM-12 é um factor de risco independente e marcador de diagnóstico, e está envolvida na proliferação, invasão e metástase de SCLC

citação:. Shao S, Li Z, W Gao, Yu L, Liu D , Pan F (2014) ADAM-12 como um marcador diagnóstico para a proliferação, migração e invasão em pacientes com o Small Cell Lung Cancer. PLoS ONE 9 (1): e85936. doi: 10.1371 /journal.pone.0085936

Edição: Pan-Chyr Yang, da Universidade Nacional de Taiwan, Taiwan

Recebido: 20 de setembro de 2013; Aceito: 03 de dezembro de 2013; Publicação: 21 de janeiro de 2014

Direitos de autor: © 2014 Shao et al. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Licença Creative Commons Attribution, que permite uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o autor original ea fonte sejam creditados

Financiamento:. Este trabalho foi apoiada pela National Science Foundation Natural da China (81.302.017). Os financiadores não tiveram nenhum papel no desenho do estudo, coleta de dados e análise, decisão de publicar ou preparação do manuscrito

CONFLITO DE INTERESSES:.. Os autores declararam que não existem interesses conflitantes

Introdução

cancro do pulmão de pequenas células (CPPC) é o mais maligno de todos os cancros do pulmão. A taxa de sobrevivência de cinco anos é de apenas 3-8%, devido à metástase generalizada durante a fase inicial e recaídas que ocorrem quando a resistência aos tratamentos desenvolve [1]. Anteriormente, a degradação da matriz extracelular (ECM) tem sido o foco de estudos principal na invasão e metástase de SCLC [2], [3]. As metaloproteinases de matriz (MMPs) têm sido detectadas em CPPC, e elevados níveis de expressão de MMP-11 e -14, foram identificados como factores de prognóstico negativos independentes em [4] SCLC. Inibidores de MMPs têm sido utilizados clinicamente em pacientes com CPPC, mas provou ser ineficaz e não melhorou a taxa de sobrevivência de cinco anos dos pacientes [5]. Isto sugere que a degradação da ECM é um processo complexo e que as proteases, excepto as MMPs, deverão ser estudadas para determinar se outros factores desempenham um papel em CPPC.

Proteína Adam (ADAM) pertence à protease família. ADAMs pode degradar a ECM e verter os precursores ligados à membrana que modulam a célula-célula e as interacções célula-matriz [6]. Adams estão divididos em dois grupos: Adam e segregada ancorado à membrana tipo ADAM. Tipo secretado ADAM contém motivos trombospondina e é também chamado Proteína Adam com trombospondina Motivos (ADAMTS). Adams e ADAMTS pode degradar ECM e derramou precursores, promovendo assim a invasão e metástase. A expressão aumentada de Adams e ADAMTS foi detectado em vários tumores. ADAM-8, -12, -15 e -28 são altamente expressos no cancro do pulmão de células não pequenas [7], [8], [9], [10], ADAM-9, -12, -17 e -23 são altamente expressos em câncer de mama [11], [12], [13], [14] e ADAM-9, -12 e -17 são altamente expressa em câncer de fígado [15], [16], [17]. ADAMTS4 e ADAMTS5 ter sido referida como estando envolvida no processo metastático por clivagem brevican em glioblastomas [18]. Curiosamente, ADAMTS1 de comprimento completo foi encontrada para promover a invasão e metástases por derramamento factor de crescimento epidérmico de ligação a heparina (HB-EGF) e anfirregulina, no entanto, o fragmento ADAMTS1 exibida uma função anti-metastático [19]. Quimioterapia é um tumor altamente agressivo. Aproximadamente 90% dos pacientes morrem em resultado de extensa metástase. Portanto, é essencial que um marcador de diagnóstico ser identificados, e um factor de prognóstico para os doentes ser avaliados SCLC. Presentemente, não há nenhum marcador de diagnóstico eficaz para SCLC. Há poucos estudos que examinam o papel de expressão Adams em SCLC, com excepção da ADAM-15 [8]. Com base no significado potencial do papel de ADAMs na promoção da proliferação, metástase e angiogénese, que destinado a avaliar os níveis de expressão de Adams e a sua relação com o prognóstico clínico em CPPC, a fim de identificar um marcador de diagnóstico eficazes.

no presente estudo, verificou-se que a expressão de ADAM-12 foi maior no CPPC do que outros ADAM através de imuno-histoquímica (IHQ). análise de sobrevivência uni e multivariada indicou que ADAM-12 foi um fator prognóstico independente para doentes com CPPC. O nível de expressão de ADAM-12 no soro e na urina foi mais elevada em pacientes com SCLC comparação controlos saudáveis, bem como em pacientes com doença extensa em comparação com aqueles com doença limitada. Os modelos animais demonstram alta metástase do CPPC também havia aumento da expressão de ADAM-12 e invasão e metástase reforçada. Nossos resultados suportam a conclusão de que altamente apresentado ADAM-12 como um fator prognóstico independente e marcador de diagnóstico estava envolvido na proliferação, invasão e metástase em pacientes com SCLC.

Materiais e Métodos

Pacientes e celular linhas

amostras de tecido de tumor fixadas em formalina de 150 pacientes que sofrem de SCLC foram obtidos a partir Medical University Hospital Binzhou, China, entre janeiro de 2008 e dezembro de 2011. das amostras de tecido, 140 foram obtidos através de biópsia e 10 foram obtidos durante a cirurgia. Informações básicas paciente foi obtida a partir de arquivos de pacientes e é mostrada na Tabela 1.

amostras de soro e urina frescas foram obtidas de 70 pacientes com SCLC do departamento de oncologia em Binzhou Hospital Medical University, China (48 do sexo masculino e 22 do sexo feminino, com idade média de 52,3 ± 11,3 anos). Um total de 45 pacientes tinham doença extensa definida como a doença que se espalhou para o pulmão contralateral ou que tem metástases distantes) e 25 pacientes tinham doença limitada definida como a doença que se limita a um pulmão, do mediastino, e /ou os gânglios linfáticos regionais . Todos os pacientes assinaram voluntariamente o termo de consentimento. Todos os pacientes foram diagnosticados com SCLC por amostras de biópsia patológicos e tinham sido submetidos a quimioterapia e radioterapia. Um total de 40 voluntários saudáveis ​​(20 homens e 20 mulheres com idade média de 38,7 ± 12,1 anos) foram também estudados. controles saudáveis ​​não apresentaram alterações anormais em funções sanguíneos, fígado, coração, pulmão ou rins. Este estudo foi aprovado pelo Comitê de Ética Médica da Universidade de Medicina de Binzhou, China (Permit Number: BY2010008).

linhas de células SCLC humanos, incluindo H1688, H446 e H345, foram adquiridos a partir de Xangai celular Biblioteca do chinês Academy of Science. As células foram cultivadas em 1640 suplementado com 10% de soro fetal bovino, 100 U /ml de penicilina e 100 ug /ml de estreptomicina.

A imuno-histoquímica

Os espécimes embebidos em parafina foram desparafinados em dimetilbenzeno e hidratada em álcool gradiente. Os cortes foram tratados de acordo com os seguintes protocolos: peroxidase endógena removido (incubação em 3% H

2O

2 durante 30 min), antigénio recuperado (cerca de 95 ° C durante 45 min), o bloqueio com soro de cabra a 10% (à temperatura ambiente durante 30 min), durante a noite anticorpo primário incubação a 4 ° C, conjugado com HRP secundário anticorpos de incubação durante 30 min a 37 ° C, reacção de cor DAB, coloração com hematoxilina, diferenciação, desidratação e da transparência. A diluição dos anticorpos primários foi 1:50 para ADAM-8, ADAM-10, ADAM-11 (Santa Cruz Biotechnology, Dallas, TX, EUA), 1:200 para ADAM-12 (Abgent, Suzhou, China), Adão- 15 e ADAM-17 (R D Systems, Minneapolis, MN, EUA). Dois patologistas que foram cegados para o diagnóstico clínico realizado a pontuação de coloração. No caso de um resultado contestado, o consenso foi alcançado por discussão. Um sistema de pontuação semi-quantitativa foi usada para classificar as amostras de acordo com a percentagem de coloração positiva: grau de grau 0 (negativo), no grau 1 (fraco, expressão positiva positiva foi inferior a 10%), 2 (expressão positiva e positiva moderada foi entre 10% e 60%) e grau 3 (forte expressão positiva e positiva foi superior a 60%) [20].

ELISA

no soro e urina do primeiro dia do (médio corrente) foram obtidas de pacientes com SCLC, centrifugado (1000 g, 30 min) para recolher o sobrenadante e armazenou-se a -80 ° C [21]. Os níveis séricos e urinários de ADAM-12 foram medidos usando um kit de ADAM-12 específica ELISA (R D Systems). Um volume de 50 ul das amostras diluídas 2 vezes foi adicionado a uma placa de 96 cavidades cobertas com o anticorpo monoclonal específico do ADAM-12 e incubadas durante 2 h à temperatura ambiente. Após aspiração e lavagem de cada poço quatro vezes, adicionaram-se 200 ul de conjugado de ADAM-12 e os poços foram incubadas durante 2 h à temperatura ambiente. Cada poço foi lavado mais quatro vezes para remover o líquido residual e 200 ul de solução de substrato foi adicionado a cada poço e os poços foram incubadas durante 30 minutos na escuridão. tampão parar foi adicionada para terminar a reacção ea intensidade de absorção foi lida a 450 nm.

tratamento de RNA de interferência pequeno (siRNA)

siRNAs para genes alvo foram sintetizados e modificados (Invitrogen, Carlsbad, CA, EUA). A sequência do siRNA segmentação ADAM-12 foi de 5 ‘GGA AGA GCU GAU GAA GUU GTT 3’ [22] e a corrida siRNA foi de 5 ‘UUC UCC GAA CGU GUC ACG UTT 3’. células H1688 foram cultivadas em placas de 6 cavidades e foram transfectadas com 75 pmol de siRNA e 7,5 ul de Lipofectamina 2.000 (Invitrogen) foi adicionado a todos os poços, quando a densidade das células era cerca de 30% -50%. Após 4 h, a Opti-media foi substituído por meios normais e as proteínas foram coletadas em 48 h após a interferência.

A transfecção de ADAM-12-L e Adam-12-S em células H345

H345 células foram transfectadas transitoriamente com o ADAM-12-L e ADAM-12-S vetores de expressão (plasmídeos pcDNA3.1 contendo humana tudo cDNA comprimento do ADAM-12-L ou -S foram presentes de Ulla M. Wewer na Universidade de Copenhague ) usando Lipofectamine 2000 (Invitrogen). As células transfectadas com o ADAM-12-G foram nomeados H345-G e as células transfectadas com o ADAM-12-S foram nomeados H345-S.

PCR em tempo real

O RNA total foi extraído usando um Kit de Trizol (Takara, Dalian, China). O ADNc foi preparado utilizando um kit de síntese de ADNc (Thermo Scientific, Waltham, MA, EUA). PCR em tempo real foi realizado com SYBR Green (Thermo Scientific). Os iniciadores dos genes alvo foram como se segue:

F: 5′-GCAGTTTCACGGAAACCCAC-3 ‘,

R: 5′-ACACGTGCTGAGACTGACTG-3′ para ADAM-12;

F: 5′-TCCTGTGTCTTCTTGCTGCC-3 ‘,

R: 5′-GCGCACACACCTTAGTTTTTC-3′ para ADAM-12-G;

F: 5′-CCACCCATTCCATCTCCATC-3 ‘

R: 5′-TTCTGCAAACCCTCAAACC-3’for ADAM-12-S

F: 5′-GAGCACAGAGCCTCGCCTTT-3 ‘

R: 5′- CGCGGCGATATCATCATCCA-3′ para a beta-actina.

Western blotting

As células foram lisadas com tampão de lise de SDS contendo uma mistura de inibidor de protease. As proteínas quantitativos foram separadas por electroforese em SDS-PAGE e as proteínas foram transferidas para membros NC. O membro foi bloqueada com leite isento de gordura a 5% durante 1 h com agitação ligeira e incubadas com anticorpos primários durante a noite a 4 ° C (1:500 para ADAM-12, Abgent, Suzhou, China; 1: 3000 para a beta-actina, Cell Signaling Technology, Inc. Danvers, MA, EUA), em seguida, incubadas com anticorpos secundários conjugados com HRP durante 40 minutos à temperatura ambiente. bandas immunoblot foram visualizados utilizando o sistema ECL (Millipore, Billerica, MA, EUA) e filme de raios-X.

Transwell experimentos

foram conduzidas

Transwell experimentos de acordo com o manual do fabricante (BD, Franklin Lakes, NJ, EUA). O Matrigel foi diluída com meio isento de soro (1: 2). Um volume de 60 ul de gel foi plaqueada para dentro da câmara superior e solidificada por incubação a 37 ° C durante 3 h. 1 × 10

4 células foram plaqueadas para dentro da câmara, filtrou-se para dentro da câmara inferior e introduzido no soro. Em seguida, as células foram coradas com Giemsa Dye, e o número de células em 3 campos foi contado sob um microscópio de luz.

análise do ciclo celular

As células foram fome durante 24 h por retirada de soro. células H1688 e H345 foram tratados. As células foram recolhidas, fixadas e incubadas com ARNase A (Thermo Scientific) durante 30 min a 4 ° C. Em seguida, as células foram então incubadas com iodeto de propídio (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, EUA) durante 30 min. conteúdo de DNA foi detectado através de citometria de fluxo [23].

Experiências com animais

H1688 células (a linha clássica pulmão de pequenas células de células de câncer) foram cultivadas em 1640 e 10

6 células foram administrados subcutaneamente em ratinhos nus. O tamanho do tumor foi monitorizado a cada semana. Quando o diâmetro do tumor atingir cerca de 1 cm, os murganhos foram sacrificados sob anestesia e os tumores foram excisados. tumores extirpados (chamadas células parentais) foram cortados pela metade. Uma metade foi armazenada a -80 ° C, e o outro foi cortado em pedaços, digerido (0,25% de tripsina durante 15 minutos de incubação) e filtrou-se. células filtradas foram cultivadas novamente em meio normal. Três dias mais tarde, as células foram injectadas em ratinhos imunodeficientes através da veia da cauda. Dez semanas mais tarde, os ratinhos foram sacrificados sob anestesia. Dos 10 ratinhos que foram injectados, 5 ratinhos tinham tumores visíveis (diâmetro 0,5 cm) no abdómen do pulmão e no fígado e o outro 5 ratinhos não tinham tumores visíveis. Em comparação com os tumores resultantes da injecção subcutânea, os tumores resultantes da injecção na veia da cauda tinham níveis mais elevados de infiltração e invasão [24]. Assim, um modelo animal metástase tumoral altamente metastático em simulando pacientes foi construída com sucesso. O Comité das University Medical Binzhou Ética Médica aprovou este estudo (Permit Number: BY2013001).

A análise estatística

Todos os dados foram analisados ​​usando SPSS 17.0 software. O método de Kaplan-Meier e teste log-rank foram utilizados para avaliar a taxa de sobrevivência univariada. A regressão de Cox foi utilizado para realizar a análise de sobrevida multivariada. A análise da curva receiver operating características (ROC) foi realizado para avaliar o ponto de corte para níveis séricos e urinários de ADAM-12 em pacientes com SCLC e voluntários saudáveis. A área sob a curva (AUC) e valores de p foram avaliados. As diferenças de expressão entre os diferentes grupos foram analisados ​​utilizando emparelhado

t

teste.

P Art

0,05

foi considerada estatisticamente significativa

Resultados

A expressão de Adams em amostras de SCLC por IHC

A expressão de ADAM-8,. – 10, -11, -12, -15 e -17 foi avaliada por IHC em 150 amostras de SCLC. O nível de expressão positiva (dezenas de graus 2 e 3) do ADAM-8, -10, -11, -15 e -17 foi 31,33% (47/150), 34,66% (52/150), 19,33% (29 /150), 39,33% (59/150) e 10% (15/150), respectivamente (Figura S1). A expressão positiva da ADAM-12 foi o mais alto em 72,67% (109/150) ea forte expressão positiva (grau 3) do ADAM-12 foi significativamente maior em comparação com o outro Adams (

P Art 0,001 ). Como mostrado na Figura 1, verificou-se que ADAM-12 foi expressa em SCLC e foi localizado no citoplasma, mas não no núcleo. Coloração HE indicou que o tipo de tecido do tumor tem características tipicamente SCLC clinicopatológicos (núcleos maiores e quase nenhuma citoplasma). As amostras de tecido que foram incubadas durante a noite com PBS, em vez do anticorpo primário, foram utilizados como controlos negativos. ADAM-12 foi expressa significativamente mais em amostras de tecido de SCLC em comparação com a expressão de outros Adams (

P

0,001), indicando que a ADAM-12 pode desempenhar um papel importante no processo de proliferação, invasão e metástase em SCLC.

ADAM-12 foi detectado no tecido do cancro do pulmão de pequenas células por coloração imuno-histoquímica. A razão de diluição de anticorpo primário foi de 1: 200 para ADAM-12. (A) tecido pulmonar normal; (B) coloração HE no tecido SCLC; (C) controlo negativo (incubadas com STF em vez de anticorpo primário durante a noite a 4 ° C); (D) coloração para ADAM-12 no tecido SCLC.

ADAM-12 é um fator prognóstico independente em pacientes com CPPC

Desde ADAM-12 foi altamente expressa em SCLC, investigamos a relação entre a ADAM-12 e o prognóstico da doença. Todos os pacientes tinham aceitado a terapia sistêmica e 15 de 150 pacientes ainda estavam vivos em janeiro de 2013 (data de encerramento do estudo). O tempo médio de sobrevivência dos pacientes foi de 12,59 meses ea taxa de sobrevivência de 2 anos foi de 16%. De acordo com as pontuações de coloração IHC, aqueles com graus 0 e 1 foram considerados no grupo negativo e aqueles com graus 2 e 3 foram considerados no grupo positivo. análise de sobrevida univariada mostrou que os fatores clínicos significativos que influenciaram a sobrevivência eram doença extensa (

P Art 0,001). Nem fumar (

P

= 0,882), sexo (

P

= 0,396) foi um fator prognóstico significativo nem foram níveis de ADAM-8 (

P

= 0,903), ADAM-10 (

P

= 0,075), ADAM-11 (

P

= 0,317), ADAM-15 (

P

= 0,349) ou ADAM-17 (

P

= 0,427). No entanto, o ADAM-12 (

P

= 0,022) foi um fator prognóstico negativo significativo (Figura 2). A análise multivariada foi realizada para avaliar a influência de prognóstico de vários fatores. Os resultados foram consistentes com a análise de sobrevivência univariada. estágio clínico (

P

= 0,001, HR = 2,003, IC 95%: 1,330-3,015) e nível de ADAM-12 expressão (

P

= 0,049, HR = 0,443, IC 95% : 0,197-0,995) foram significativos fatores prognósticos independentes (Tabela 2) e ADAM-12 foi intimamente associado com o estágio clínico (

P Art 0,001). As características clínicas dos pacientes positivos para o ADAM-12 foram comparados com aqueles que foram negativos para ADAM-12, a fim de esclarecer melhor o papel da ADAM-12 como um fator independente de prognóstico no CPPC. Os resultados mostraram que o estágio patológico foi estatisticamente significativa (

P

= 0,037), enquanto que outros fatores como idade ( 65 em comparação com ≥ 65,

P

= 0,325), sexo (

P

= 0,975), tabagismo (

P

= 0,743) eo tamanho do tumor (

P

= 0,511) não foram significativas.

tempo de sobrevida dos pacientes foi obtido por seguimento. análise de sobrevida univariada foi realizada para avaliar se o ADAM-8, -10, -11, -12, -15 e -17 podem ser consideradas como fatores prognósticos independentes. O resultado mostrou ADAM-12 ser um factor independente e negativo (

P

= 0,022).

soro e urina Adam-12 níveis em doentes com CPPC

IHC demonstraram coloração ADAM-12 a ser altamente expressa em secreções mucosas, excepto para células SCLC (Figura 3A). Em seguida, inferir que ADAM-12 foi provavelmente segregada para o sangue e excretados através da urina. Assim, investigou-se os níveis de ADAM-12 no soro e urina de pacientes com SCLC. O soro e urina de 70 pacientes com SCLC e 40 voluntários saudáveis ​​foram recolhidas, centrifugadas e armazenadas a -80 ° C. Um kit de ELISA foi utilizado para detectar a expressão de ADAM-12. As curvas ROC produziu uma AUC mais elevada de 0,899 (

P Art 0,001, IC 95%: 0,842-0,956) para 346 pg /ml no soro ADAM-12 nível de doentes com CPPC (Figura 3B) do que os controles normais (a AUC de 0,847 para 105 pg /ml), e uma maior AUC de 0,979 (

P Art 0,001, IC 95%: 0,959-0,999) para 258 pg /ml na urina ADAM-12 nível de doentes com CPPC (Figura 3C) do que controles normais (a AUC de 0,869 para 92 pg /ml). O nível sérico ADAM-12 foi significativamente maior em doentes com CPPC do que em voluntários saudáveis ​​(502 ± 234

vs

180 ± 92 pg /ml,

P Art 0,001) e naqueles com extensa doença em comparação com aqueles com doença limitada (586 ± 205

vs

317 ± 185 pg /ml) (Figura 3D). O ADAM 12 nível de urina foi consistente com o nível de soro e foi maior em doentes com CPPC do que em voluntários saudáveis ​​(404 ± 247

vs

128 ± 50 pg /ml) e em pacientes com doença extensa em comparação com pacientes com limitada doença (477 ± 201

vs

303 ± 152 pg /ml) (Figura 3E). Isto indica que a ADAM-12 níveis no soro e na urina estão correlacionadas com a progressão da SCLC e que ADAM-12 pode ser considerado como um marcador de diagnóstico para a doença de SCLC uma vez que a expressão de ADAM-12 aumentou com o desenvolvimento e progressão da doença.

(a) ADAM-12 coloração era fortemente positiva em secreções de muco (a região é indicado pela seta). (B, C) Uma curva ROC foi realizada para avaliar o ponto de corte para pacientes com SCLC e voluntários saudáveis; ROC = características de operação do receptor. (D, E) Os níveis de expressão de ADAM-12 no soro e de urina de pacientes com SCLC e os controlos normais foram detectados utilizando um kit de ELISA. **

P Art 0,01, doentes com CPPC

vs

controles normais, doentes com CPPC com doença extensa

vs

doença limitada

ADAM-12 metástase afetada e proliferação em H1688 células

Como figuras mostradas. 1, 2 e 3, o ADAM-12 é um factor de risco independente, que pode ser útil como um marcador de diagnóstico em CPPC. Nós posteriormente explorado o papel de Adam-12 na proliferação, invasão e metástase em SCLC. Em primeiro lugar, foi detectada a expressão de ADAM-12 em linhas de células SCLC (H1688, H446 e H345) e descobriram que ADAM-12 foi mais altamente expresso em células H1688 e H446 em comparação com a linha celular H345 (Figura 4A). Em um estudo sobre câncer de mama, ADAM-12 foi relatado para ter duas formas de transcrição (membrana ancorada ADAM-12-L e tipo secretado ADAM-12-S) que desempenham papéis diferentes [22]. Devido à semelhança de sequência, diferentes ARNsi que tinham como alvo ADAM-12-L e ADAM-12-S, respectivamente, não pode ser concebido de modo siARN foi usada para alvejar ADAM-12. A expressão de ADAM-12 foi significativamente reduzida no grupo de siRNA específica em comparação com o não tratado e os grupos de ARNip mexidos (Figura 4B). Quando não havia interferência com a expressão de ADAM-12 em células H1688, as células induzidas pelo soro de filtração da membrana câmara foram significativamente reduzidos (Figura 4C) e o ciclo celular foi preso na fase G0-G1 (Figura 4D). Roy

et ai relataram que ADAM-12-L promoveu a proliferação celular e que ADAM-12-S promovido migração celular no cancro da mama [22]. Na nossa investigação, a proliferação celular e migração foram significativamente inibida após silenciar a expressão de ADAM-12 por ARNsi específico na linha de células H1688, demonstrando que a ADAM-12 está associado com a proliferação celular, invasão e metástase. Para esclarecer os papéis de ADAM-12-L e -S na proliferação celular e migração, um experimento foi concebida e realizada que é detalhado abaixo.

(A) A expressão de ADAM-12 foi maior no H1688 e células H446 H345 comparação com células por Western blotting. A expressão de mRNA e proteína de ADAM-12 (B) foi significativamente reduzida quando ADAM-12 expressão foi silenciado por um siRNA específico visando ADAM-12 (ADAM-12i) em comparação com não tratada (Mock) e mexidos siRNA (NCI) em H1688 células , **

P Art 0,01. (C) As células induzidas pela membrana câmara de filtragem de soro foram significativamente reduzidas no grupo ADAM-12i em comparação com os grupos Mock e NCI em células H1688, **

P

0,01. (D) O ciclo celular foi significativamente preso na fase G0-G1 no grupo ADAM-12i. Mock: células não tratadas; NCi: as células foram tratadas com siRNA mexidos. ADAM-12i:. As células foram tratadas com siRNA segmentação ADAM-12

ADAM-12-L promove a proliferação e ADAM-12-S promove invasão

Como mostra a Figura 4, quando a expressão de ADAM-12 foi silenciada, a proliferação celular e migração foi significativamente inibida em células H1688. ADAM-12 foi inferior a expressão em células H345 e H1688 em comparação com células H446 (Figura 3A). As células H345 foram então transfectadas transientemente com o vector de ADAM-12-G (G-H345) ou -S (H345-S) expressão. A eficiência de transfecção foi avaliado por PCR em tempo real uma vez que não havia nenhum anticorpo específico segmentação ADAM-12-L ou -S. A expressão de ARNm de ADAM-12-G e -S foram significativamente aumentados após a transfecção (Figura 5A). Não houve diferença significativa entre as células H345-L induzida por filtração através de membrana e câmara simulada (controlo normal) ou controlos negativos (pcDNA3.1). No entanto, os resultados contraditórios foram encontrados em células H345-S. Após a transfecção com o ADAM-12-S, H345 células induzidas pelo soro de filtração através da membrana câmara foram significativamente aumentadas, o que indica que ADAM-12-S, não ADAM-12-L, desempenha um papel importante na invasão SCLC e metástases (Figura 5B ). Enquanto isso, a análise do ciclo celular mostraram que as células H345-L entrou em fases S, mas que as células H345-S não foram significativamente diferentes em comparação com células de controlo negativo (Figura 5C). Isto indicou que ADAM-12-L pode promover a proliferação celular e Adam-12-S poderia promover a invasão celular e metástase, o que é consistente com o resultado de Roopali [22].

(A) As expressões de mRNA de Adão- 12-G e -S foram detectadas por PCR em tempo real em células H345 transfectadas com o vector de ADAM-12-G e -S expressão, **

P

0,01. Mock: grupo não tratado; pcDNA3.1: grupo negativo. 12-G: transfectadas com pcDNA3.1-ADAM-12-G; 12-S: transfectadas com pcDNA3.1-ADAM-12-S. (B) As células induzidas pela membrana câmara de filtragem não foram significativamente diferentes nas células H345 transfectadas com pcDNA3.1-ADAM-12-G (denominado H345-G), no entanto as células estavam significativamente aumentados em células H345 transfectadas com pcDNA3. 1-ADAM-12-S (nomeado H345-S), *

P Art 0,05. (C) ADAM-12-L células para ir desde a fase G0-G1 para a fase S induzida, mas ADAM-12-S não influenciaram a proliferação celular em células H345.

A expressão de ADAM-12 foi aumentado quando a invasão tumoral e metástase foi reforçada

Estudos anteriores [22] relataram que o ADAM-12-L promoveu a proliferação de células e ADAM-12-S promoveu a invasão celular e a metastase num modelo animal; que confirmou esta conclusão em um nível celular. No entanto, não houve relatos sobre se a expressão de ADAM-12 é aumentada quando a invasão tumoral e metástase são reforçadas. Como mostrado na Figura 3, no soro e urina do ADAM-12 os níveis estavam significativamente aumentados em pacientes com doença extensa quando comparado com aqueles com doença limitada, o que sugere que a expressão de ADAM-12 é aumentada com o desenvolvimento da doença. De modo a confirmar esta conclusão, a metástase do tumor modelo animal que simula altamente metastático foi construído como descrito nos métodos (Figura 6A). Houve uma maior alteração na morfologia das células metastáticas em comparação com as células parentais a partir deste modelo. o tamanho das células metastático era menor, a mancha foi shoaled citoplasma, o corante nuclear foi aprofundada, a densidade celular e diluído a célula enfraquecido compacto (Figura 6B). A expressão de ADAM-12 foi detectada em células parentais e metastáticos. A expressão de ARNm de ADAM-12-L, não foi diferente entre as células parentais e metastáticos, mas ADAM-12-S ARNm foi significativamente maior em células metastáticas (Figura 6c). Isto indica que a ADAM-12-S, não ADAM-12-L, desempenha um papel importante na invasão e metástase. A proteína ADAM-12 foi detectado por IHC e Western blot. O resultado mostrou que a ADAM-12 era, obviamente, maior em células metastáticas em comparação com células parentais (Figura 6D).

(A) Um modelo animal altamente metastático foi construído, por via subcutânea 1 x 10

6 células foram administrados e os tumores subcutâneos (células parentais) foram injectadas em ratinhos nus por meio da veia da cauda para formar tumores metastáticos (células metastáticas). Foram observadas (b) as diferenças morfológicas entre células progenitoras e células metastáticas através de hematoxilina e eosina (HE). Em comparação com células parentais, as células metastáticas eram menores, tinha shoaled marcação citoplasmática, coloração nuclear mais profundo, mais fino densidade celular e mais fraco compacto celular. (C), não houve diferença no ADAM-12-L-expressão de ARNm de entre as células parentais e metastáticas, no entanto ADAM-12-S ARNm foi significativamente maior em células metastáticas, *

P

0,05. (D) ADAM-12 de expressão de proteína foi significativamente aumentado nas células metastáticas por IHC e Western blotting. P1-P5 indica os cinco tumores subcutâneos e M1-M5 indica os cinco tumores metastáticos.

Discussão

Há mais de 30 ADAM que pertencem à família metaloproteinase. Eles interagem com as integrinas para mediar célula-célula e as interacções célula-matriz extracelular [25], verter um grande número de proteínas transmembranares, degradam a ECM e activar as vias de entalhe e de EGFR para promover a proliferação celular, invasão e metástase [6].

as principais características do CPPC são o crescimento rápida e extensa metástase em fase inicial. Actualmente, não há nenhum marcador de diagnóstico eficaz para auxiliar no diagnóstico de SCLC, especialmente durante a fase inicial. Este estudo foi desenhado para avaliar a expressão de Adams em SCLC e a fim de encontrar um marcador de diagnóstico útil. Até agora, apenas a expressão de ADAM-15 havia sido detectado ea expressão de outra Adams tinha sido única raramente relatada em SCLC [8]. Em nossa pesquisa, detectamos ADAM-8, -10, -11, -12 e -17 e descobriu que ADAM-12 foi mais altamente expresso em comparação com outros Adams em amostras clínicas SCLC.

ADAM-12 é altamente expresso em vários tipos de cancro, incluindo o cancro da mama [12], [14], [26], câncer de fígado [16], câncer de estômago [26], [27], o cancro do cólon [26] e cancro do sistema nervoso [28]. No presente estudo, análise de sobrevivência uni e multivariada indicou que ADAM-12 é provavelmente um fator prognóstico independente indica pior sobrevida em pacientes com CPPC. Embora ADAM-12 é sobre-expresso em numerosos tumores, ADAM-12 como marcador de diagnóstico específico só tem sido utilizado para o cancro da mama [22].