Sumário
crisótilo é um dos seis tipos de amianto, e é o único que ainda pode ser comercializada em diversos países. A exposição a outros tipos de amianto tem sido associado a doenças graves, tais como carcinomas do pulmão e mesotelioma pleural. A associação de exposição à crisotila com a doença é controverso. No entanto,
in vitro
estudos mostram o potencial mutagênico do crisotila, o que pode induzir o ADN celular e danos. O presente trabalho teve por objetivo analisar alterações no pulmão de pequenas culturas carcinoma de células após 48 h de exposição à crisotila, seguido por 2, 4 e 8 dias de recuperação em meio de cultura livre de fibra. Algumas alterações, tais como a formação de células de aneuploidia, aumento do número de células em fase G2 /M, e as células em mitose multipolares foram observadas mesmo após 8 dias de recuperação. A presença de fibras de crisotilo nas culturas de células foi detectado e a morfologia das células foi observada por varrimento a laser microscopia confocal. Depois de 4 e 8 dias de recuperação, apenas alguns fragmentos crisótilo estavam presentes em algumas células, e a morfologia celular era semelhante ao das células de controlo. As células transfectadas com o plasmídeo α-tubulina GFP-marcadas foram tratadas com crisotila por 24 ou 48 h e células em mitose multipolar foram observados por microscopia de lapso de tempo. Fates dessas células foram estabelecidas: a retenção na metáfase, a morte celular, a progressão através de fase M gerando mais de duas células filhas ou fusão celular durante telophase ou citocinese. Alguns deles estavam relacionados com a formação de células aneuplóides e células com número anormal de centrossomas
Citation:. Cortez BDA, Quassollo G, Cáceres A, Machado-Santelli GM (2011) The Fate of Multipolar Crisotila Induzida mitose e aneuploidia População em cultura de células do cancro do pulmão. PLoS ONE 6 (4): e18600. doi: 10.1371 /journal.pone.0018600
editor: Robert Qi, da Universidade de Hong Kong de Ciência e Tecnologia, Hong Kong
Recebido: 30 de novembro de 2010; Aceito: 07 de março de 2011; Publicação: 05 de abril de 2011
Direitos de autor: © 2011 Cortez et al. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Licença Creative Commons Attribution, que permite uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o autor original ea fonte sejam creditados
Financiamento:. Este trabalho foi apoiado pela Fundação de Amparo a Pesquisa do Estado de São Paulo – FAPESP, e Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico – CNPq, Brasil e por doações da Agencia Córdoba Ciencia e MINCYT (PICT 815 e PME), Argentina. BAC era um companheiro de Red de MacroUniversidades de América Latina y el Caribe, durante a sua estadia na Argentina. GQ é um companheiro de doutorado de FONCyT (Argentina). Os financiadores não tiveram nenhum papel no desenho do estudo, coleta de dados e análise, decisão de publicar ou preparação do manuscrito
CONFLITO DE INTERESSES:.. Os autores declararam que não existem interesses conflitantes
Introdução
O amianto é um mineral de silicato divididos em dois grupos principais – serpentinas e os anfibólios. fibras de anfibólio eram comumente usados em aplicações comerciais até que a associação de exposição anfibólio com várias doenças graves, como a asbestose, câncer de brônquios e mesotelioma maligno da pleura e peritônio [1], [2]. Actualmente, anfibólio fibras não pode ser usado em muitos países e foram substituídos por crisotilo, uma serpentina de amianto que é considerado menos prejudicial para a saúde humana.
crisótilo é composto por fibras de seda curvos com uma pequena secção transversal (80 a 130 a) e uma estrutura tubular. A sua depuração a partir de tecido do pulmão é mais rápido do que o de fibras de anfibólio, crisotilo e não se acumula no pulmão, devido a um mecanismo que envolve a fragmentação das fibras em pedaços curtos [3].
Os mecanismos que conduzem ao desenvolvimento de doenças como carcinomas e mesoteliomas após a exposição ao amianto não são bem compreendidos. No entanto, os efeitos mutagénicos e citotóxicos de amianto tem sido demonstrado em estudos utilizando células de cultura expostas a diferentes fibras de amianto por períodos que vão desde 1 h a 72 h.
A exposição de células cultivadas para amianto leva à formação de oxyradicals e os radicais livres que danificam o ADN [4], [5], [6]. Tem sido demonstrado que a exposição de células cultivadas para crisótilo pode causar quebras de cadeia dupla em ADN após 3 h e 24 [7], [8] e pode também causar deleções e mutações de ADN intrachromosomal [9]. danos no ADN induzida por crisotilo pode desencadear a apoptose em diversos tipos de células após 3-4 h de exposição [8], [10].
micronúcleos são também observadas após o tratamento crisótilo [11]. Estes corpos de cromatina, que contêm um fragmento de cromossomo acentric ou um cromossomo inteiro que se destacaram da placa metafásica, pode ser gerado após quebras cromossômicas e interrupções de mitose, tais como fusos multipolares. Portanto, os dados sugerem que o crisotila pode causar quebras no DNA e perturbar os fusos mitóticos.
interrupções do ciclo celular em células expostas ao crisotila foram investigados por citometria de fluxo, e foram observadas alterações complexas. As células tratadas com crisotila por 4 a 48 h mostrou G2 /retenção M e uma diminuição do número de células em fase S, identificado por incorporação de BrdU [12].
divisão mitótica após a exposição ao amianto foi também observado por lapso de tempo e microscopia confocal. Alguns foram encontradas alterações, tais como defeitos na formação do fuso e falta de citocinese na presença de fibras internalizados. Estas experiências mostram que as fibras longas podem ser localizados entre as células filhas durante telofase e levar ao fracasso citocinese, a geração de células multinucleadas e aneuploides [13], [14]. Resultados semelhantes foram observados em células expostas a nanotubos de carbono. Estas células mostraram interrupções de centrossomas e fusos mitóticos, sugerindo que os nanotubos podem interferir com os microtúbulos e proteínas a motor [15].
células aneuplóides são caracterizadas por conteúdo de DNA anormal devido a uma perda ou ganho de cromossomos inteiros ou partes de cromossomos, ea maioria dos tumores sólidos contém células aneuplóides [16], [17], [18]. Aneuploidia pode ser resultado de erros no ciclo celular, erros de checkpoints mitóticas que permitem danos ao DNA ou replicação erros a serem repassados para as células filhas, erros na segregação cromossômica e citocinese, que pode ocorrer devido a amplificação centrossoma e formação de fusos multipolares [19 ].
em 1914, Boveri aneuploidia citados como causa de cancro, mas a subsequente descoberta de oncogenes e genes supressores de tumor levou a uma nova teoria, em que a acumulação de mutações em genes tais era a causa da transformação maligna [20]. A discussão tem continuado, e aneuploidia actualmente é considerado para ser envolvida em progressão tumoral, supressão ou de iniciação [21], [22], [23]. No entanto, é evidente que podem introduzir aneuploidia mutações que dão origem a transformação maligna e conduzem a instabilidade genética [24].
O presente trabalho centra-se na formação de células aneuploides após a exposição a três diferentes concentrações de fibras de crisotilo , seguido por longos períodos de recuperação em meio isento de fibras. Foram também analisadas as interrupções do ciclo celular que poderiam estar envolvidos na formação de células aneuplóides, comparando as alterações encontradas em células normais e cancerosas expostas ao crisotila. mitoses multipolares também foram monitorados para determinar o destino destas células e sua contribuição para a formação de células aneuplóides.
Materiais e Métodos
Cultura celular
As células HK2 (uma linha celular estabelecida a partir de carcinoma do pulmão de células não-pequenas humano) [25] e células Vero (uma linha epitelial derivada de rim de macaco verde – número ATCC CCL-81) foram cultivadas em Eagle Modificado de Meio mínimo de Dulbecco essencial (Sigma), suplementado com 10% de fetal de soro bovino, em uma atmosfera húmida com 5% de CO2 a 37 ° C.
Tratamento Crisotila
Crisotila 5R (Quebec padrão) obtidos a partir SAMA Mineração de Amianto Ltda (Minaçu, GO, Brasil) foram gentilmente cedidas pelo Dr. Flavia M. Cassiola. As fibras foram lavadas com água da torneira e activado por soni cação a um pH controlado (7,4) tal como descrito noutro local [26]. Para o tratamento, as células foram enzimaticamente removidas dos frascos e plaqueadas em placas de 35 mm de diâmetro (2,10
5 células /prato). Após 24 h em cultura, o meio foi mudado para 2 ml de meio fresco com fibras de crisotilo, para uma concentração aproximada final de 250 ug /ml, 125 ug /ml ou 62,5 ng /ml, limite inferior do que a maioria
in vivo
estudos (10 a 17 mg /m
3). As fibras permaneceu em contacto com as células durante períodos de 24 h ou 48 h, após o que o meio foi mudado. Após períodos adicionais de 2, 4 ou 8 dias em meio normal células foram lavadas com solução salina tamponada com fosfato (PBSA) e fixa. Durante todo o tratamento, o meio de cultura foi suplementado com soro bovino fetal a 10%, e mudado a cada 2 dias, durante o tempo de recuperação.
ADN quantificação
O conteúdo em ADN nuclear das células tratadas e HK2 crisótilo controle foi quantificada por análise de imagem com as CIRES de software (célula de imagem Recuperação e Avaliação System-Kontron Eletronik) instalados em Axioskop microscópio (Zeiss). Para a análise, os núcleos foram coradas por reacção de Feulgen [16]. tratamentos crisótilo foram feitas utilizando três concentrações diferentes fibras (250 ug /ml, 125 ug /ml, 62,5 ug /ml), e depois de 48 h de tratamento, foram usadas três diferentes tempos de recuperação em meio de cultura livre de fibra: 2, 4 e 8 dias. Quatrocentos núcleos de mononucleated, binucleadas e multinucleadas foram independentemente analisados no controle e células de crisotila tratada. As células tumorais geralmente têm alterações genéticas e a maioria deles são hyperdiploid. Desde HK2 é um
in vitro
linha celular estabelecida, o grupo diplóide foi definida de acordo com o pico de G0 /G1 nos histogramas, eo grupo tetraploid foi determinada com o dobro do teor de DNA.
Citometria de fluxo
o ciclo celular foi analisada por citometria de fluxo utilizando o Sistema de goiaba. Foram analisados e controle de crisotila (125 ug /ml) células tratadas por 48h e recuperados em meio normal para 2, 4 e 8 dias. Para análise de células foram tratadas com tripsina, centrifugadas (1000 rpm durante 10 min), lavou-se com PBSA e fixadas com metanol: PBSA (3:01) durante 1 h a 4 ° C. Em seguida, as células foram centrifugadas, lavadas com PBSA e incubou-se com uma solução de 200 ul de PBSA, 20 ul de ARNase e 20 ul de iodeto de propídio durante 1 h. Foram analisados 5.000 células para cada condição experimental
Immunoflurescence:. Índice mitótico, a morfologia celular e presença de fibras
HK2 células foram tratadas com 125 ug /ml de crisotila por 24 h e 48 h e também tratados durante 48 h e recuperados para 2, 4 e 8 dias em meio normal; e células Vero foram tratados com 125 u /ml de crisótilo durante 48 h e recuperada em meio normal durante 24 h. Controlo e as células tratadas foram fixadas com formaldeído a 3,7% durante 30 min e tratou-se com Triton X-100 a 0,1% durante 10 min. Em seguida, as células foram submetidas a imunofluorescência com anticorpos anti-anticorpos α e beta-tubulina (Sigma, diluída 1:200) e com o segundo anticorpo anti-ratinho CY5 (Invitrogen, diluída 1:200). Após isto, as células foram tratadas com ARNase durante 30 minutos, os núcleos foram coradas por iodeto de propidio e os filamentos de actina com faloidina-FITC. A morfologia celular e presença de fibras de crisotila foi fotografada por microscopia confocal laser (LSM 510, Carl Zeiss). Estas preparações também foram utilizadas para quantificar a presença de células micronucleadas, multinucleadas e mitóticas: preparações foram observadas por microscopia de fluorescência. Pelo menos 1.000 células /slides e 100 células mitóticas foram contadas em três lâminas diferentes para cada tratamento e controle.
Time-Lapse Microscopia
HK2 foram transfectadas com o GFP-Tagget plasmídeo alfa-tubulina para permitir o rastreamento dos microtúbulos durante a mitose. A transfecção foi realizada com Lipofectamine 2000 Invitrogen) de acordo com o protocolo de fabricação. Após 24 h de transfeco, o meio foi mudado para meio com fibras de crisótilo. As células permaneceram com fibras para 24 ou 48 h, em seguida, observado por disco giratório de lapso de tempo de microscopia confocal utilizando um microscópio DSU X-81 invertido (Olympus), equipado com iluminação MT20 e sistemas de aquisição de Osis, uma câmera CCD (Hamamatsu, ORCA AG), e uma câmara de aquecimento (Harvard Apparatus). As células foram colocadas em câmaras especiais contendo 2 ml de meio de gravação (solução a 5% de Hanks equilibrada de sal, 0,5% de glucose, 1% de soro bovino fetal, 20 mM de Hepes, e Glutamax 2 mM, pH 7,3) e fotografada com o sistema DSU usando um 60x 1,42 NA objetivo de imersão em óleo. imagens de projeção máximas foram obtidas e processadas utilizando o software Metamorph e Adobe Photoshop
Análise estatística
Os resultados foram analisados por χ2 de teste e P .. 0,05 foi considerado significativo
Resultados
crisotila, após a recuperação aneuploidia dependente da concentração em meio
células HK2 cultivadas livres de fibras foram tratadas com três concentrações diferentes de crisotila, e depois deixou-se recuperar em meio livre de fibra para 2, 4 e 8 dias. conteúdo de DNA nuclear foi quantificada por análise de imagem e núcleos foram agrupados em cinco classes seguintes: hipodiploidia (teor de DNA ≤1.49 C), diplóide (conteúdo de DNA entre 1,5 C e 2.39 C), hyperdiploid (teor de DNA entre 2,4 C e 3.59 C) , tetraplóide (conteúdo de ADN entre 3.6C e 5.1c) e hypertetraploid (conteúdo de DNA 5.1c). (Tabela 1)
crisotilo tratamento levou a uma formação dependente da concentração de núcleos hypertetraploid (também chamados núcleos aneuplóides). Após 48 h de tratamento crisótilo seguido por 2 dias de recuperação em meio isento de fibra, a frequência de aneuploidia foi medida. Em células tratadas com a concentração mais elevada crisótilo (250 ug /mL), 7% das células eram aneuploidia, enquanto aqueles tratados com a concentração intermédia de crisótilo (125 ug /ml) 4,5% apresentado aneuploidia; a concentração crisótilo menor (62,5 ug /mL) conduziu a 3,5% aneuploidia, que era maior do que a frequência de aneuploidia em células de controlo (0,25%). Quando analisados após os tempos de recuperação mais longo, a frequência de núcleos aneuploides aumentou, atingindo 10,5% nas células tratadas com 250 ug /ml de crisótilo, seguido por 8 dias de recuperação. As células tratadas com 125 ug /ml e 62,5 ug /ml de crisótilo e deixados a recuperar durante 8 dias, as taxas de aneuploidia apresentados de 5,9% e 4,67%, respectivamente (Tabela 1, Fig. 1). Conteúdo
ADN nuclear de HK2 controlo e crisótilo (250 ug /ml, 125 ug /ml ou 62,5 ng /ml) de células tenha sido tratada com (por 48 h) permitiu recuperar em meio isento de fibra de 2, 4 ou 8 dias foi quantificada, e núcleos com conteúdo de DNA C 5,1 foram considerados aneuploidia. As percentagens apresentadas são fundo (a percentagem de aneuploidia em células de controlo, 0,25%) – subtraídos. tratamento crisotila levou a aneuploidia, que persistiu após 8 dias de recuperação (P 0,001).
Após 48 h de exposição à crisotila seguido por 2 dias de recuperação, a população aneuploidia foi composta principalmente de bi e multinucleadas células. No entanto, após os tempos de recuperação mais longos em meio isento de fibras (4 e 8 dias), os núcleos aneuplóides foram principalmente em células mononucleares (Tabela 2).
alterações no ciclo celular após o tratamento crisotila
O ciclo celular em células de controlo e HK2 em células tratadas com crisótilo durante 48 h, seguido por 2, 4 e 8 dias de recuperação de fibras em forma livre foi analisada por citometria de fluxo. Os tratamentos foram realizados com apenas uma concentração crisótilo (125 ug /ml).
eventos do ciclo celular foram classificados como hipodiploidia /apoptótica, G1, S, G2 /M e células hypertetraploid. De modo semelhante às experiências com quantificação do DNA, o grupo diplóide foi determinada de acordo com o pico de células G0 /G1 nos histogramas.
Nos histogramas, a primeira alteração induzida por crisótilo notável no ciclo celular foi um aumento na formação de células hipodiploidia /apoptótica. No entanto, a frequência destas células diminuiu após um longo período de recuperação, atingindo o valor de controlo após 8 dias de recuperação (Tabela 3).
células tratadas com Crisotila exibiu um número 12% menor do G1 células em comparação com células de controlo, e também mostrou a 5% maior número de células G2 /M do que os de controlo de células (Tabela 3). Estas diferenças ocorreram independentemente da duração do período de recuperação, e foram mais pronunciadas após longos períodos de recuperação. Quando o número de células na fase S foi avaliada, não foi observada nenhuma diferença entre o controlo e as células tratadas com crisótilo (Fig. 2, A).
células tratadas com crisótilo e deixadas a recuperar durante 2, 4 ou 8 dias em meio isento de fibras foram analisadas por citometria de fluxo e por imunofluorescência. A) Os histogramas em linear (vermelho) e log (colorido) escalas de citometria de fluxo mostram os efeitos de crisotila sobre o ciclo celular, especificamente um aumento no número de G2 /M e células hypertetraploid; B) células tratadas com crisótilo recuperados durante 2 e 4 dias mostram um aumento no número de células em metafase e uma diminuição em células em anafase e telofase em comparação com células de controlo (P 0,01 para 48 h e P 0,001 para 4 dias) .
índice mitótico de células HK2 tratados com crisotila controle e foi quantificada utilizando imunofluorescência. Análise do índice mitótico mostrou que o número total de células na fase M foi semelhante em controlo e células tratadas com crisótilo. No entanto, em células de controlo, o número de células em anafase e telofase foi maior do que o número de células em metafase, enquanto que após 48 horas de tratamento crisotilo, seguido por 2 a 4 dias de recuperação, o número de células em metafase foi maior do que o número de células em anafase e telofase. Após 8 dias de recuperação, o número de células em metafase foi semelhante nas células tratadas com crisótilo e de controlo (Fig. 2, B).
HK2 e morfologia de células VERO e a presença de fibras de crisotilo
células HK2 tratados com crisotila Controle e foram analisadas por microscopia confocal de varredura a laser, após a marcação de imunofluorescência de microtúbulos, filamentos de actina e núcleos. fibras de crisotila foram visualizados por sua autofluorescência (ver detalhes em [13]). A presença de células multinucleadas e micronucleadas, mitose anormal e fibras foi analisada e quantificada
Depois de 24 h e 48 h de tratamento crisotila, fibras longas foram observadas interagindo com os filamentos da superfície celular HK2 e actina.; alguns pequenos fragmentos de fibras foram também detectados no interior das células (Fig. 3, A). Foram observadas alterações em cultura de células, tais como um maior número de células bi- e multi-nucleadas, micronucleadas e apoptóticos. O número de células com a mitose multipolar também aumentou, alcançando 7,23% de todas as células em divisão após 48 h de exposição (em crisótilo controlo 2,37% de todas as divisões celulares foram multipolar) (fig. 3, b).
Células foram processadas por imuno-fluorescência para visualizar os núcleos, os filamentos de actina e microtúbulos, e fibras de crisotilo foram observados pela sua autofluorescência. A) imagens confocais de HK2 células tratadas com crisótilo durante 24 h ou 48 h, mostrando fibras longas, espessas que interagem com as células e a mitose multipolar; B) as alterações na morfologia celular foram analisados, e após 24 h ou 48 h de tratamento crisotilo, o número de binucleadas e células multinucleadas aumentada, bem como o número de células micronucleadas, as células apoptóticas e células em mitose multipolar (P 0,001) .
Após 48 h de tratamento crisotila seguido por um período de recuperação semelhante, células multinucleadas, mitose anormal e foram observados longos e pequenas fibras de crisotila no interior das células (Fig. 4, a). Outras análises mostraram que as células deixadas a recuperar durante longos períodos continha menos fibras; fibras de crisótilo e fragmentos de fibras pequenas foram observadas na região perinuclear das células após 4 dias de recuperação, enquanto que após 8 dias de recuperação não foram fibras longas e alguns pequenos fragmentos de fibras no interior das células (Fig. 4, A). Após 4 dias de recuperação, o número de células BI /multinucleadas diminuiu, mas era ainda mais elevada do que nas células de controlo, no entanto, os números de células em mitose multipolar e micronucleados foram aumentados (Fig. 4 A, B). Após 8 dias de recuperação, a morfologia das células de células tratadas com crisotilo, assemelhava-se de células de controlo, constituído por células, as células mononucleares na mitose bipolar e poucas células apoptóticas e micronúcleos. O número de células em mitose multipolar diminuiu em comparação com a de células deixadas a recuperar durante 4 dias; No entanto, nas células tratadas com crisotilo, houve mais casos de mitose multipolar que havia nas células de controlo (Fig. 4 A, B).
células foram examinadas através de imunofluorescência para visualizar os núcleos, os filamentos de actina e microtúbulos , e fibras de crisotila foram observadas por sua autofluorescência. A) imagens confocais de células HK2 de controlo e as células tratadas com crisótilo durante 48 h e deixadas a recuperar durante 2 dias, 4 dias ou 8 dias, mostrando a morfologia celular e a presença de fibras de crisótilo. Após 2 dias de recuperação, as fibras longas foram observadas para interagir com a superfície de células; No entanto, após 4 e 8 dias de recuperação, apenas fragmentos da fibra foram observadas; B) as alterações na morfologia celular foram quantificadas, e após 48 h de tratamento crisótilo e 4 dias de recuperação, o número de células BI /multinucleadas e células apoptóticas diminuiu, mas era ainda mais elevada do que os controlos (P = 0,30 para BI /multinucleados depois 4 dias e P = 0,05 para células apoptóticas). O número de células micronucleadas no grupo tratado com crisótilo permaneceu maior que no grupo de controlo (P 0,001 após 4 dias) e o número de células em mitose multipolar foi maior (P 0,001). Após 8 dias de recuperação, o número de células em mitose células multipolares permaneceu mais elevado do que em células de controlo (p = 0,02).
Para determinar se as células normais, de modo semelhante responder aos crisotilo, culturas de células VERO foram expostas a fibras de crisotilo durante 48 h e deixou-se recuperar durante 24 h em meio isento de fibra, e, em seguida, eles foram processados utilizando imunofluorescência para análise da morfologia celular. As células controle foi composto de células (99,29%), principalmente mononucleated, com raras células micronucleados (1,55%) e nenhuma mitose anormal. Após o tratamento crisotilo, células BI /multinucleadas e micronucleadas foram observadas em números maiores do que em células de controlo (6,34% e 3,89%, respectivamente), e a mitose multipolar e citocinese resultando em três células filhas também foram observados (7,18% de todas as divisões celulares) ( a Fig. 5, a e B).
as células foram examinadas por imunofluorescência usando submetidos a visualizar os núcleos, os filamentos de actina e microtúbulos, e fibras de crisotilo foram observados pela sua autofluorescência. A) imagens confocais de células de controlo e células tratadas com crisótilo durante 48 h e deixadas a recuperar durante 24 h, mostrando a morfologia celular e a presença de fibras de crisótilo. Após recuperação, foram observadas fibras longas para interagir com as células, e células multinucleadas, foram observadas células e células em mitose multipolar micronucleadas; B) as alterações na morfologia celular foram quantificadas e tratamento crisotila levou ao aumento do número de células micronucleadas, células BI /multinucleadas, células em apoptose e células em mitose multipolar (P . 0.001)
Time- microscopia lapso: destino das células mitóticas anormais ea formação de centrossomas múltipla
Para disco giratório de lapso de tempo de microscopia confocal, HK2 células foram transfectadas com GFP-tagged α-tubulina. Observou-se cada célula transfectada por um período de 2-3 h. Quando uma célula de controlo na metafase foi encontrado, que progrediram para anafase e atingiu telofase em 30 a 100 minutos. Todas as divisões observados em células de controlo eram bipolar (Fig. 6, A). Em contraste, quando foram observadas células tratadas com crisotila, cerca de 40% de metáfases foram multipolar. Análise do destino de 30 dessas células revelaram padrões diferentes; cada um deles foi observado pelo menos duas vezes.
Células transfectadas com GFP marcada com α-tubulina foram tratados com crisótilo durante 24 ou 48 horas e depois observadas pelo lapso de tempo de disco giratório microscopia confocal. As células em metafase foram observados durante 2 a 3 h. A) Uma série temporal de imagens de projeção máximas mostram uma mitose bipolar que gerou apenas duas células filhas após 1 h numa cultura de controlo; B) uma série temporal de imagens de projeção máximas mostram uma mitose tripolar de uma cultura tratados com crisotila que não progrediu durante a fase M; C) uma série temporal de imagens de projeção máxima mostrando uma célula tratados com crisotila que organizou pólos do fuso de forma tripolar e progrediu para anaphase e telophase gerando três células-filhas; D) uma série temporal de imagens de projeção máxima mostrando citocinese em uma célula tratados com crisotila, gerando três células-filhas que adquiriram morfologia interfase; E) uma série temporal de imagens de projeção máxima de uma célula tratados com crisotila, que entrou anaphase gerando quatro células filhas; No entanto, as células se fundiram durante a telófase e formou apenas duas células filhas.
Cerca de metade das células em metáfase multipolar não progredir para anaphase durante o período de observação, mantendo-se em metáfase com pseudo-bipolar, tripolar ou fusos quadripolares (Fig. 6, B). Nestes casos, os microtúbulos estavam dinâmico, e os pólos do fuso foram mais dinâmica quando agrupados em fusos pseudo-bipolar. As células em metafase multipolar também foram submetidos a morte celular, tal como evidenciado pelo vazamento do citoplasma observada no canal de luz transmitida.
Algumas células em metafase multipolar após o tratamento crisótilo também progrediram para a anafase, telofase e citocinese. metafases tripolar gerado três células filhas ligadas por duas midbodies com organização de microtúbulos semelhante ao observado nas células de controlo (Fig. 6, C). As três células filhas ou se mantiveram separadas e adquiriu uma morfologia interfase 100 minutos depois do início da citocinese (Fig. 6, D), ou fundido durante a citocinese. Nestes casos, duas das três células filhas foram fundidos e ligados à ponte intercelular por duas estruturas de microtúbulos. A fusão celular também ocorreu durante telophase até a formação da ponte intercelular, então duas células filhas estavam ligados por uma única secção central (Fig 6, E.)
A formação de fusos multipolares ou vários centrossomas não foi observada durante a mitose.; todos os casos de metafase foram anormal desde o início da observação. Assim, as células de interfase foram observados para identificar alterações que poderiam estar relacionados à amplificação centrossoma, que foi responsável pela formação de fusos multipolares na fase subsequente M.
foram observadas células na interfase com dois centrossomas, e os centrossomas aproximou-se uns aos outros em vez de migrar para pólos opostos. Além disso, a rede de microtúbulos destas células permaneceu semelhante para a interfase células e não formar fusos. Outra situação que foi observado após tratamento crisotilo foi a presença de interfase com dois corpos centrossoma-like – estruturas localizadas na região perinuclear das células onde os microtúbulos foram concentradas. Estas estruturas parecia ser formada por pontos muito pequenos que se moviam durante todo o período de gravação. Além disso, o celular permaneceu na interfase e não progrediram para a fase M (Fig. 7, A).
Alterações que poderiam estar relacionados com um número anormal de centrossomas foram observadas em HK2 células tratadas com crisotila por 24 ou 48 h. A) Uma série temporal de imagens que mostram uma célula com dois like-estruturas centrossoma que não evoluem para M fase como esperado para uma célula com dois centrossomas; B) uma série temporal de imagens que mostram duas células em interfase ligadas por uma ponte intercelular, sem uma organização midbody. As células aproximou-se uns aos outros durante o período de observação, o que reflecte uma regressão da citocinese.
Outro mecanismo responsável pela formação de centrossomas adicionais nas células é falha citocinese. Este processo leva muito tempo para ser observado durante o curso dos experimentos de lapso de tempo que realizamos. No entanto, foram observadas células em interfase ligadas por uma ponte intercelular, sem uma organização midbody microtúbulos, e as células se aproximou uns aos outros durante o período de observação (Fig. 7, B).
Discussão
Crisotila é considerados menos prejudiciais para a saúde humana do que os outros tipos de amianto, devido à falta de uma forte associação entre a exposição da fibra crisótilo e o desenvolvimento de carcinomas e mesoteliomas. No entanto, alguns estudos têm mostrado o potencial do crisotila para causar danos no DNA e alterações celulares
in vitro
e lesões pulmonares
in vivo
. O presente trabalho analisou as alterações celulares relacionadas com aneuploidia e ciclo celular interrupção, e verificou que alterações persistem na cultura após 2, 4 e 8 dias de recuperação em meio isento de fibras. Além disso, alterações na morfologia celular foram relacionados com a presença de fibras em cultura durante as primeiras 24 h e 48 h de tratamento crisótilo e também após longos períodos de recuperação. Analisamos também a mitose multipolar e amplificação centrossoma, que são recursos adicionais de tratamento crisotila que estão intimamente relacionados com aneuploidia.
A análise dos HK2 células por microscopia confocal revelou que as fibras de crisotila não persistiu em cultura de células após 8 dias de recuperação, e após 4 dias de recuperação apenas fragmentos pequenos e fibras estavam presentes na região perinuclear de algumas células. Além disso, após 4 e 8 dias de recuperação, a morfologia das células assemelhava-se à das células de controlo no que diz respeito à presença de células BI /multinucleadas e micronucleadas. No entanto, a população aneuplóide persistiu em cultura de células, após 4 e 8 dias de recuperação em meio isento de fibra, e as percentagens de núcleos aneuploides foram sempre cerca de 10% da população total. Os dados fornecidos pela quantificação de ADN também mostraram que os núcleos aneuploides foram principalmente em células mononucleares após 4 e 8 dias de recuperação, enquanto que durante os primeiros dias de recuperação os núcleos foram aneuploidia em células BI /multinucleadas. Todas estas observações estão de acordo com os dados fornecidos por citometria de fluxo, o que indica que as células HK2 tratados com crisotila mostraram aumento hipertetraploidy mesmo depois de 8 dias de recuperação.
A presença de células aneuplóides é uma consequência do tratamento crisotila observado após 48 horas de exposição, que persiste mesmo após 72 h de recuperação após o tratamento [11], [13]. Estas células podem ser relacionados com o desenvolvimento do cancro, porque o ganho ou perda de um cromossoma – ou uma parte dele – pode introduzir mutações necessárias para a transformação maligna. Demonstramos neste estudo que a indução de aneuploidia em células é dependente da concentração-crisotilo, e como descrito acima, que a percentagem de células aneuploides manteve-se elevada em comparação com células de controlo após 8 dias de recuperação em meio de cultura livre de fibra.