Abstract
Fundo
Estudos recentes têm enfatizado as ligações causais entre microRNAs (miRNAs) desregulamentação e desenvolvimento do tumor. No carcinoma hepatocelular (HCC), mais e mais miARNs foram identificados como biomarcadores de cancro de diagnóstico e prognóstico, bem como ferramentas terapêuticas adicionais. Este estudo teve como objetivo investigar o significado funcional e mecanismo de regulação do cluster miR-199a2 /214 na progressão HCC.
métodos e resultados
Neste estudo, nós mostramos que o miR-214, como bem como os níveis de miR-199-5p miR-199-3p e foram significativamente reduzidos na maioria dos tecidos examinados 23 HCC e linhas de células HepG2 e SMMC-7721, em comparação com os seus homólogos não tumorais. Para explorar ainda mais o papel do miR-214 em hepatocarcinogenese, que revelou que o ER induzida pelo stress factor de sobrevivência pro-XBP-1 é um alvo de miR-214 usando o ensaio de transferência de Western e ensaio de repórter de luciferase. Re-expressão de miR-214 em linhas celulares de carcinoma hepatocelular (HepG2 e SMMC-7721) inibiram a proliferação e apoptose induzida. Além disso, a expressão ectópica de miR-214 suprimiu significativamente a capacidade das células de carcinoma hepatocelular para formar colónias in vitro e para desenvolver tumores em um modelo de xenotransplante subcutânea do ratos BALB /c atímicos nu. Além disso, a reintrodução do XBP-1 s atenuadas supressão de miR-214-mediada de células CHC proliferação, de colónias e a formação de tumores. Para entender melhor o mecanismo do miR-199/214 cluster de down-expressão na HCC, descobrimos que thapsigargin (TG) e tunicamicina (TM) ou resposta proteína desdobrada induzido por hipoxia (UPR) suprime a expressão do miR-199 /214 aglomerado em células do CHC. Por análise do promotor do gene de miR-199a2 /214, conjeturamos NFkB como um potencial regulador negativo. Descobrimos ainda que UPR e activação NFkB induzida por LPS suprimiu miR-199a2 /214 transcrição, e esta supressão foi revertido pela inibição NFkB em células do CHC.
Conclusões
O nosso estudo sugerem que a modulação da miR-214 níveis podem proporcionar uma nova abordagem terapêutica para o tratamento do câncer e revelou que UPR pode oferecer uma nova explicação para por que o /214 cluster de miR-199 foram regulados negativamente na progressão na HCC
Citation:. Duan Q, Wang X, Gong W, Ni L, Chen C, Ele X, et al. (2012) ER estresse Negativamente Modula a expressão do miR-199/214 Cluster para Regulamenta Tumor sobrevivência e a progressão no cancro hepatocelular humano. PLoS ONE 7 (2): e31518. doi: 10.1371 /journal.pone.0031518
editor: Terence Lee, da Universidade de Hong Kong, Hong Kong
Recebido: 16 de setembro de 2011; Aceito: 09 de janeiro de 2012; Publicação: 16 de fevereiro de 2012
Direitos de autor: © 2012 Duan et al. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Licença Creative Commons Attribution, que permite uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o autor original ea fonte sejam creditados
Financiamento:. Este estudo foi apoiada por doações do National Science Foundation Natural da China (No. 30930039, 81000097 e 30770882) e Programa Nacional de Pesquisa básica da China (973 Programa No. 2007CB512004). Os financiadores não tiveram nenhum papel no desenho do estudo, coleta de dados e análise, decisão de publicar ou preparação do manuscrito
CONFLITO DE INTERESSES:.. Os autores declararam que não existem interesses conflitantes
Introdução
miRNAs são uma nova classe de endógena, RNAs de 19-25 nucleótidos de comprimento que medeiam a repressão dos transcritos alvo através da ligação a sequências complementares de sementes em regiões 3 ‘não traduzidas (UTRs) de mRNAs alvo [1 não codificante ]. Desde observação inicial, mais de 1400 miRNAs humanos foram registrados em miRBase (v.17.0). Estudos anteriores sugeriram dysexpression de pequenos RNAs tem sido observado em vários tipos de cancros, e também está associada com o resultado clínico de doentes com cancro [2]. Além disso, as capacidades de miARNs para atingir ajuste fino simultânea de vários genes alvo diferentes torna-os reguladores fundamentais de sinalização celular e implica-os na progressão tumoral [3], [4]. Mas seus papéis específicos e funções nos principais tipos de câncer e a progressão maligna de câncer ainda não foram completamente elucidados.
O carcinoma hepatocelular (HCC) é um dos cânceres mais comuns em todo o mundo e entre as principais causas de Câncer morte relacionada na Ásia, especialmente na China [5]. Vários miRNAs, como [6] miR-101, [7] miR-122, [8] [9], miR-373 [10], miR-221/222 [11], [12], [13], miR-195 [14], o miR-30d [15], o miR-125b [16], o miR-18a [17], o miR-139 [18], o miR-223 [19] e miR-29 [20], têm já foi relatado para regular a progressão do tumor HCC e metástases através da regulação de genes-chave, como Mcl-1, ADAM17, YAP, DDIT4, ciclina D1, CDK6, E2F3, Galphai2, LIN28B, receptor de estrogênio α, Rho-quinase 2, stathmin 1 e Bcl-2 e assim por diante. No entanto, os dados existentes não podem explicar totalmente a complexidade do HCC.
Recentemente, miR-199-3p /5p foi verificada ser diminuída em tecidos de carcinoma hepatocelular, e seu decréscimo correlaciona-se significativamente com a sobrevida dos pacientes com CHC, delineando um marcador potencial para a previsão do prognóstico de doentes com HCC [5], [21], [22]. É bem conhecido que há dois genes que codificam potencialmente pri-miR-199, o precursor primário de HSA-miR-199. O primeiro gene é MIR199a1 no cromossomo 19 (NCBI GeneID 406.976) eo segundo é MIR199a2 no cromossomo 1 (NCBI GeneID 406977) [23]. Curiosamente, na extremidade 3 ‘do transcrito de pri-miR-199a2, não é a sequência de precursor para um outro par de miARN HSA-miR-214 e miR-HSA-214 * [24]. miR-199a2 e miR-214 foram relatados para ser produzida a partir de um único transcrito intrão-menos de dinamina 3 oposta (Dnm3os) que é incorporado na cadeia oposta dentro de um intrão de dinamina em rato e humano [23], [24] . Além disso, a região miPPR-199a2 é mostrado aqui para ser o promotor autêntico miR-199a2 que produz o transcrito primário que alberga o miR-199-3p, miR-199-5p e sequências de miR-214 como um cluster [25]. Mais e mais estudos documentaram que o miR-214 está envolvida no cancro do ovário humano, cancro do colo do útero e a progressão do tumor de melanoma [26], [27], [28], [29]. No entanto, o conhecimento atual sobre a expressão e função miR-214 em HCC é ainda pouco claro. Além disso, os mecanismos subjacentes miR-199a2 /214 desregulamentação no HCC ainda não está clara.
No presente estudo, mostramos que miR-199-3p, miR-199-5p e miR-214 expressão era significativamente reduzida em tecidos de carcinoma hepatocelular. XBP-1 demonstrou ser um alvo directo de miR-214 por interacção com o 3′-UTR. Além disso, foi estudado o efeito supressor de miR-214 na formação de tumores HCC e crescimento
in vitro
e
in vivo
e reintrodução de XBP-1s atenuados supressão de miR-214-mediada. Nós ainda identificou que NFkB activado pela resposta proteína desdobrado (UPR) suprime miR-199a2 /214 transcrição, e demonstrou que a ativação do UPR e retículo endoplasmático (ER) estresse representa um importante mecanismo responsável por miR-214 e miR-199-3P /5p infra-regulação no desenvolvimento de HCC.
resultados
miR-199/214 é regulada negativamente em linhas de células de carcinoma hepatocelular e tecidos
Para estudar o papel do miR-199 /214 cluster no HCC, os níveis de miR-214 e miR-199-3p /5p foram determinados em 23 pares de HCC e tecidos benignos adjacentes utilizando PCR em tempo real. Os resultados mostraram que estes miRNAs foram significativamente regulada para baixo e miR-199-3p miR-199-5p miR-214 em comparação com os tecidos do fígado não tumorais adjacentes. Redução da expressão de miR-214 foi observada em 65% dos HCC (15 de 23 casos), e consistente a sub-regulação de ambos miR-199-3p e miR-199-5p também foram detectados em tanto quanto 73% de HCC (17 de 23 casos) (Figura 1A e B). Em paralelo, em linhas de células de carcinoma hepatocelular HepG2 e SMMC-7721, miR-199-3p /5p e miR-214 expressão foi marcadamente diminuiu em comparação com a de fígado humano normal (Figura 1C).
(A) Box traçar telas gráficas de 23 HCC e tecidos benignos adjacentes combinados agrupados de acordo com o miR-199-3p e expressão de miR-199-5p. (B) Box Plot telas gráficas de 23 HCC e combinados tecidos benignos adjacentes agrupados de acordo com miR-214 expressão. (C) o miR-199 /b-3p-214 e miR expressão em fígado humano normal, HepG2, e SMMC-7721 linhas celulares de carcinoma hepatocelular foi detectada utilizando em tempo real de qRT-PCR. Colunas, com média de três experimentos independentes; bares, SD; * P . 0,05 vs controle
miR-214 visa diretamente XBP-1 pela interação com o 3′-UTR
A identificação de genes alvos miRNA-regulados é um passo necessário para compreender as funções de miRNA. Embora o miR-199 e miR-3p-5p-199 Foi relatado que contribuem para a carcinogénese do fígado [5], [21], [22], o papel de miR-214 em HCC tumorigénese não tem sido elucidado. Portanto, o próximo procurou os genes alvo de miR-214 em HCC. alvos putativos miR-214 foram preditos usando programas de previsão alvo, miRBase e TargetScan. Verificou-se que o alinhamento da sequência de HSA-miR-214 com 3′-UTR do XBP-1 gene humano identificado um miR-214 local de ligação (Figura 2A). Para confirmar que a XBP-1 é um alvo putativo de miR-214, construiu-se dois vectores repórter de luciferase com o tipo selvagem da XBP-1 3 ‘UTR e mutada (a sequência complementar da XBP-1 na região 3’ UTR da semente de miR- 214 local de ligação foi mutado). Quando co-transfectadas com o miR-214 imita em células HepG2, a actividade de luciferase relativa de um repórter de luciferase da XBP-1 3 ‘UTR foi significativamente suprimida por -50% em comparação com a transfecção de controlo negativo. Em contraste, nenhuma alteração na actividade de luciferase relativa foi observado em células transfectadas com o repórter mutante ou vector vazio (Figura 2B). Estes resultados sugerem que o miR-214 alvos de XBP-1 por ligação directa a UTR 3 ‘da XBP-1.
(A) Alinhamento de sequências de miR-214 humano com 3′-UTR da XBP-1. A sequência de semente de miR-214 corresponde 3′-UTR da XBP-1 para criar a construção repórter da XBP-1 3′-UTR ou a luciferase mutante. (B) o miR-214 inibe repórter XBP-1 3′-UTR, mas não mutante ou repórter actividade repórter vazio. As células HepG2 foram transf ectadas transitoriamente com plasmídeos indicados com miR-controlo, o miR-214 imita. Após 36 h de incubação, as células foram submetidas a ensaio de luciferase. Colunas, com média de três experimentos independentes; Barras, DP. * P 0,05 vs miR-con. (C) o miR-214 reduz a XBP-1 nas células HepG2 (esquerda) e células SMMC-7721 (à direita) analisadas por western blotting.
Descobrimos ainda que a transfecção transitória de células HepG2 e SMMC-7721 células com miR-214 reduziu eficientemente a XBP-1 Os níveis de proteína detectada por análise de transferência de western (Figura 2C), que foi independente da ATF6 e IRE1 sinalização (Figura S1). Resultados semelhantes foram obtidos em células humanas epiteliais de cancro cervical Hela (figura S2). Estes dados sugerem que o miR-214 reconhece directamente a 3 ‘UTR da XBP-1 e ARNm inibe a XBP-1 de tradução.
Além disso, a análise de Western blot mostrou que o nível de proteína da XBP-1 foi aumentada em miR-214- fragmentos de CCH humanos reprimidos em comparação com os tecidos do fígado não tumorais adjacentes (Figura S3). Nossa análise revelou que XBP-1 foi um alvo potencial de miR-214.
miR-214 regula a proliferação celular e apoptose HCC
Estudos anteriores têm implicado XBP-1 como um fator de sobrevivência essencial para ER stress e crescimento do tumor [30], assim nós escolhemos se miR-214 exercer um efeito oposto em HCC para mais investigação. Para determinar o impacto da proliferação de células de miR-214 em CHC, HepG2 e células SMMC-7721, foram, respectivamente, transfectadas com miR-214 ou imita o miR-controlo e analisados para o crescimento celular. O ensaio de proliferação de CCK-8 mostrou que o crescimento celular foi diminuída em 214 miR-células mimetiza HCC-transfectados em comparação com células de controlo -transfected miR-ou células não tratadas (Figura 3A). Resultados semelhantes foram observados por um ensaio de incorporação Br-dU em HepG2 e células SMMC-7721 (Figura 3B). Os resultados da
In vitro
ensaios indicaram que exógeno miR-214 inibiu significativamente a proliferação de linhas de células de hepatoma.
(A) número relativo de células de HepG2 e células SMMC-7721 às 48 horas pós-transfecção foi avaliado utilizando o ensaio CCK-8. taxa de crescimento (B) celular de HepG2 e células SMMC-7721 às 48 horas pós-transfecção foi avaliada utilizando um ensaio de incorporação Br-du. (C) Após 48 horas de miR-214 imita a transfecção, as células foram marcadas com Anexina V e analisadas por citometria de fluxo. (D) Depois de 48 horas agomir-214 de tratamento, as células SMMC-7721 foram marcadas com Anexina V e analisadas por citometria de fluxo * P . 0,05 vs não tratado (HepG2 ou SMMC-7721) tratado com miR-con ou
Além disso, testou-se upregulated miR-214 induz apoptose celular HCC e morte celular, através da determinação do número de células HepG2 apoptóticas precoces e tardios seguintes tratamentos com miR-214 imita por análise de citometria de fluxo. Como esperado, algumas células de anexina V-positivas foram detectadas nas células de miR-controlo-tratado ou não tratado, enquanto que o miR-214 restauração aumentou a percentagem de células apoptóticas (~ 20% em HepG2), tal como avaliado por coloração com anexina V (Figura 3C) . Consistentemente, efeitos semelhantes também foram detectados em células SMMC-7721 tratados com miR-214 imita conjugados colesterol-2′-O-modificados-metilo (agomir-214) (Figura 3D). Estes resultados indicam um papel inibidor do crescimento de miR-214 em HCC.
miR-214 regula a formação de tumores HCC e crescimento in vitro e in vivo
Os resultados acima nos levou a explorar a biológica significância de miR-214 em HCC tumorigénese in vivo. Como um passo inicial, a capacidade de formação de colónias foi avaliada em células SMMC-7721 transfectadas com agomir-214 e agomir controlo negativo (agomir-NC). Os resultados mostraram que agomir-tratadas com 214 células exibido muito menos e menores em comparação com colónias agomir-NC células tratadas (Figura 4A), que eram consistentes com o ensaio de proliferação celular. células SMMC-7721 Além disso,-214 tratados com agomir agomir-NC- e foram injectados s.c. em cada flanco posterior dos mesmos ratinhos nus, respectivamente. Após 4 semanas, o tamanho dos nódulos de tumor foi examinado. Verificou-se que os tamanhos dos tumores e o peso do tumor no final da observação foram significativamente menores no grupo de tratamento agomir-214 comparado com o do grupo de tratamento agomir-NC (Figura 4B). Resultados semelhantes também foram encontrados em xenoenxertos de células HepG2 trandfected com miR-214 imita in vivo (Figura S4 e S5) .Estes resultados sugerem que o miR-214 pode funcionar como um supressor tumoral putativo nas células CHC.
(A ) XBP-1 reintroduzido inverteu a supressão da formação de colónias induzida por tratamento agomir-214 em células SMCC-7721. (B) da XBP-1 reintroduzido inverteu a supressão da formação de tumor induzido por tratamento agomir-214 em ratinho nu células SMCC-7721 modelo de xenoenxerto. O peso do tumor de 4 semanas após a inoculação foi medida. (C) da XBP-1 reintroduzido inverteu a supressão da proliferação de células induzida por tratamento agomir-214 em células SMCC-7721. Os resultados foram reprodutíveis em três experiências independentes. * P 0,05 vs agomir-NC-tratadas; # P 0,05 vs agomir-214 ou agomir-214 + tratados com vector
Para verificar ainda uma potente papel para a via de miR-214 /XBP-1 na mediação da sobrevivência de células tumorais e na regulação. o crescimento do tumor HCC, nós re-expressa XBP-1 em miR-214 células HCC tratados. Os resultados mostraram que restaurado XBP-1 expressão por transfecção de pCMV-XL5-XBP-1s atenuados agomir-214 mediadas XBP-1 de supressão e supressores de tumor efeitos
in vitro
e
in vivo
(Figura S6 e 4A-C).
resposta proteína Unfolded regula negativamente miR-199/214 expressão em células do CHC
Como miR-214 alvos XBP-1 e XBP-1 é um efetor chave da UPR e ER estresse [31], [32], nós investigado se pode haver uma ligação entre o miR-214 para baixo-expressão ea ativação de UPR no HCC em células de hepatoma. Para validar o impacto da UPR no miR-214 expressão em células de carcinoma hepatocelular, dois clássicos UPR indutor thapsigargin (TG) e tunicamicina (TM) foi usado para induzir a ativação da UPR em células HepG2. A incubação de células HepG2 com TG (5 umol /L) e TM (5 ug /ml) marcadamente elevada a GRP94 e o nível de proteína XBP1 splicing, indicando a activação da RPU. Os resultados em tempo real de RT-PCR mostrou que a expressão de miR-214 foi significativamente regulada negativamente em células HepG2 após tratamento TM TG e durante 24 h (Figura 5A). Como miR-199-3p, miR-199-5p e sequências de miR-214 era um cluster, também descobrimos que os níveis de miR-199-3p e miR-199-5p foram diminuídos em comparação com um grupo de veículo (Figura 5A). Além disso, testou-se o efeito do RPU induzida por hipoxia no nível de miR-199 de expressão /214. Os níveis de miR-199 e miR-214 de expressão também foram mais baixos em células de carcinoma hepatocelular expostos à anóxia induzida por CoCl
2 (100 pmol /L) (Figura 5B). Assim, o miR-199 e miR-214 são os níveis de expressão sub-regulada pela RPU sob várias condições fisiológicas e patológicas.
células HepG2 (A), tratados com tapsigargina (TG, 5 umol /L) e tunicamicina (TM , 5 ug /ml) durante 24 horas foram analisados por transferência de western para GRP94 e os níveis de expressão analisados por XBP1 e em tempo real de RT-PCR para miR-199-3p /-5p e miR-214 de expressão. (B) As células HepG2 tratadas com CoCl
2 (100 uM) durante 24 horas foram analisados por transferência de Western para os níveis de expressão e GRP94 XBP1 e analisadas por em tempo real de RT-PCR para miR-199-3p /-5p e miR expressão -214. Colunas, com média de três experimentos independentes; bares, SD; * P . 0,05 vs não tratado (HepG2) ou tratados com DMSO
NFkB é um potencial regulador negativo do miR-199-2 /miR-214 do gene
Como se mostra na Figura S7, miR-199a2 e miR-214 foram regulamentados como um cluster de pri-miR-199a2 dentro dos genes Dnm3os humanos; A seguir, examinou região promotora do miR-199a2 para o factor de transcrição de sítios de ligação, e identificou 3 sítios potenciais de ligação putativo de NFkB em um fragmento de ADN de 1,2 kb a montante do pré-miR-199a2 (Figura S8). Então, nós testamos se NFkB está envolvido na regulação da expressão de miR-199a2 /214. Como mostrado na Figura 6A, o lipopolissacarídeo (LPS) (10 ug /ml), um conhecido indutor da actividade de NFkB, a activação de NFkB induzida e inibiu o miR-199a2 /expressão em células 214 SMMC-7721. Em contraste, a transfecção de siRNA alvejando p65 humana reduzida expressão de NFkB e aumentou o miR-199a2 /214 nível em células SMMC-7721 (Figura 6B). Estes dados indicaram que NFkB é um potencial regulador negativo do miR-199-2 /miR-214 cluster.
(A) com LPS (10 ug /ml) o tratamento induziu a expressão de NFkB p65, atenua o miR-199 /214 células em expressão SMMC-7721. (B) siRNA alvejando especificamente subunidade P65 de NF-kB humana (100 nM) dereased NFkB p65 expresssion e aumentou a expressão de miR-199/214 em células SMMC-7721. (C) NF-kB é activado por ER stress e hipóxia em células HepG2 analisados por transferência de Western. (D, E) de miR-199/214 expressão em células HepG2 tratadas com o stress indutor ER (5 umol /L e TG 100 uM CoCl
2) e inibidores de NFkB PDTC (100 uM). * P 0,05 vs não tratado (HepG2 ou SMMC-7721) ou DMSO ou siRNA tratou-con; # P . 0,05 vs TG ou CoCl
2 tratamento
Além disso, descobrimos que a exposição ao TG induzida activação NFkB em células HepG2 (Figura 6C), e suprimiu miR-199a2 /expressão 214 ( Figura 5A). Consistente com estes resultados, o pirrolidinaditiocarbamato potente inibidor NFkB (PDTC) (100 M) reverteu significativamente o efeito supressor da UPR em miR-199a2 /214 expressão (Figura 6D), destacando a importância da via UPR /NFkB no miR-199a2 /214 expressão.
Além disso, nós também exploraram se NFkB é capaz de regular miR-199/214 expressão em cima anoxia. Os resultados mostraram que 100 pmol /L CoCl
2 tratamento também induziu NFkB e diminuição dos níveis de miR-199a2 /214 em células HepG2, simultaneamente, e a inibição de NFkB atenuou a redução dos níveis de miR-199a2 /214 observados após tratamento anóxico (Figura 6C e e). Assim, estes dados sugerem que a RPU mediada regulação negativa de miR-199a2 /214 embora activação NFkB para participar na progressão da HCC.
Discussão
MiRNAs são reguladores negativos da expressão do gene e pode funcionar como supressores de tumores ou oncogenes [33]. Alguns miARNs particulares foram relatados para ser expresso diferencialmente no cancro diferente, tal como o miR-199/214 cluster. Aumento do nível de miR-214 foi encontrado no cancro do ovário [28], o cancro gástrico [34] e melanoma [26], indução de resistência à quimioterapia ou a metástase tumoral. Mas no câncer cervical [27], [29] e cancro da mama [35], miR-214 expressão foi reduzida, sugerindo uma função de gene-like supressor de tumor. A possível explicação foi que miRNAs individuais como alvo vários alvos em diferentes células. Vários objectivos miR-214 foram caracterizados em vários tipos de tumores (cancro do ovário, o cancro cervical e o melanoma), incluindo MEK3, JNK1 [29], PTEN [28], [36], plexina-B1 [27], EZH2 [35], [37], e TFAP2C [26], e assim por diante. Em nosso estudo, identificamos ainda XBP-1 como um novo alvo de miR-214, ligando a sua 3′-UTR em células do CHC. Além disso, verificou-se que as expressões de EZH2 e plexina B1-não estavam correlacionados negativamente com o miR-214 em amostras de tumores de HCC miR-214-regulada negativamente (dados não mostrados). Com base nessas observações, assumimos que XBP-1, mas não EZH2 e plexina-B1, é o alvo “primário” de miR214 no HCC, dependendo do contexto celular diferente.
Como sabemos, XBP- 1, um importante regulador da transcrição da resposta proteína desdobrada, regula um subconjunto de genes ER residente chaperonas na resposta proteína desdobrada para proteger as células de cancro a partir de um ambiente inadequado, tais como hipóxia ou privação de glucose [31], os quais são vulgarmente encontrados pela maioria sólido incluindo tumores HCC. a sobrevivência clonogénica das células tumorais XBP-1-deficiente foi significativamente reduzida durante severa hipoxia /anoxia in vitro e as células tumorais em XBP-1-knockout eram incapazes de crescer na forma de tumores in vivo [30], sugerindo que a XBP-1 é essencial para a a sobrevivência de células tumorais em condições de hipóxia e formação de tumores sólidos e crescimento. Estudos anteriores demonstraram que a elevação de splicing da XBP-1 de mRNA, resultando na activação da XBP-1product, bem como Grp78 e ATF6, ocorreu em tecidos de carcinoma hepatocelular com maior graduação histológica [38]. Do mesmo modo, verificou-se que o nível de proteína da XBP-1 foi aumentada em tecidos humanos HCC miR-214-downexpressed. Em conjunto, estes estudos indicaram que regulada negativamente o miR-214 em cancro HCC induz a expressão excessiva da XBP-1, o que por sua vez acelera a tumorigénese. Curiosamente, resultado semelhante de miR-214-mediada XBP-1 repressão também foi alcançada em células HeLa. É consistente com relatórios recentes que miR-214 é regulada no cancro do colo do útero humano e regula negativamente a proliferação de células Hela [27], [29]. Será interessante agora verificar-se sobre-expressão de miR-214 ou modulação de sua segmentação poderia proporcionar uma nova modalidade de tratamento para tumor miR-214 com deficiência, tais como HCC, o câncer de mama e câncer cervical.
no outro lado, o nosso estudo mostrou que uma significativa diminuição da regulação do miR-199/214 aglomerado foi observada em tecidos HCC humanos e linhas celulares de carcinoma hepatocelular, quando comparado com o fígado normal, consistente com as observações anteriores de perfis de expressão miARNs em HCC [ ,,,0],9], [39], [40], [41], [42]. Mas o que é o mecanismo da /214 cluster de baixo-expressão de miR-199 em HCC? Evidências crescentes revelou que durante o stress ER, a RPU representa um mecanismo adaptativo que suporta a sobrevivência e quimiorresistência de células tumorais, e também tem vindo a emergir como um meio para as células tumorais para aumentar a sobrevivência sob condições de stress metabólico, hipóxia, e talvez mesmo a quimioterapia [43]. Além disso, a activação de MEK /ERK e mTOR têm sido relatados para desempenhar um papel crítico no controle de sobrevivência celular ou a morte celular induzida por stress sinalização ER [44], [45], [46]. À medida que o factor de transcrição RPU XBP-1 foi identificado como um alvo de miR-214 e estudos recentes revelaram as funções importantes do miR-199 /b-3p em HCC carcinogénese e progressão de segmentação de mTOR e de c-Met ou PAK4 /Raf /MEK /ERK via em células de carcinoma hepatocelular [5], [21], decidimos investigar a correlação entre a activação UPR e miR-199/214 para baixo-expressão. O resultado mostra que o miR-214 e miR-199-3p /5p foi significativamente regulada em células HepG2 após os tratamentos TG e TM ou anoxia, ainda sugerindo que UPR activado XBP-1 ou mTOR e ERK caminho para proteger a sobrevivência de células tumorais que a supressão do cluster miR-199a2 /214 em HCC.
Para começar a desvendar os mecanismos reguladores de miR-199a2 /expressão 214 sob condições UPR em maior detalhe, nós ainda descobriram que UPR activado NFkB com supressão concomitante de miR- 199a2 /214 transcrição, e esta supressão foi revertida por PDTC inibidor de NFkB em células HepG2, o que sugeriu que NFkB é um potencial regulador negativo do aglomerado de miR-199-2 /miR-214. NFkB é um factor de transcrição importante que surgiu como um modulador chave de programas gene alterado e fenótipo maligno de cancros em desenvolvimento [47]. Os primeiros estudos indicaram que muitos cânceres, como câncer de mama, câncer de pulmão e linfoma, e HCC, constitutivamente expressam altos níveis de NFkB [48], [49]. Além disso, a hipoxia em células de carcinoma hepatocelular e tecidos induzida sobre-expressão de NFkB e /ou activação constitutiva [50], [51]. Houve uma Sp1 /NFkB /rede /miR-29b reguladora de HDAC para controlar a expressão do oncogene na leucemia mielóide aguda (LMA) [52]. Em nosso estudo, mostramos que NFkB e XBP-1 foram predominantemente expresso mas miR-214 foi significativamente reduzida em tecidos HCC humanos, miR-214 visa diretamente XBP-1, e UPR ou hipoxia induzida por NFkB activação controla negativamente o miR-199 /214 transcrição de cluster em células de carcinoma hepatocelular. Portanto, um novo UPR /NFkB /miR-214 /circuito de regulação foi sugerido na progressão HCC, em que NFkB foi ativado por UPR e participou na regulação negativa de miR-199/214 para regular a progressão HCC 1-XBP (Figura 7) . Este mecanismo de regulação parcialmente explicada por tratamento PDTC inibe a activação de NFkB, promovido HCC células apoptose e suprimiu o crescimento tumoral [53], enquanto que o tratamento com LPS induz a activação de NFkB e promoveu a proliferação de células de tumor e o crescimento metastático [54], [55], [56], [57]. Certamente, mais evidências de local de ligação de NFkB no promotor do miR-199/214 cluster são necessárias no futuro para apoiar esta hipótese e são necessárias mais investigações para elucidar se o estresse ER também ativam outros fatores (egSp1) juntos envolvidos na regulação baixa de miR-199/214 em HCC. No entanto, uma maior compreensão do mecanismo molecular e da rede pela qual o miR-199/214 funções de cluster pode fornecer novos caminhos de pesquisa que podem auxiliar no diagnóstico precoce e tratamento deste tumor altamente maligno.
O miR-214 /XBP-1 via foi mostrado neste trabalho, enquanto miR-199-3p /mTOR e miR-199-5p /DDR1 vias foram relatados por outros estudos.
em resumo, os nossos resultados revelaram que ER o stress suprime a expressão do miR-199 214 cluster /através da activação de NFkB para regular positivamente a pró-sobrevivência expressão da XBP-1, o que sugere um novo RPU /NFkB /miR-214 /XBP-1 um circuito de regulação cuja disfunção pode contribuir para a sobrevivência do tumor e a progressão do carcinoma hepatocelular. Nosso estudo oferece uma nova visão sobre a actividade supressora de tumor conferida pelo miR-199/214 e os potenciais mecanismos de hepatocarcinogênese.
Materiais e Métodos
materiais e reagentes
Os materiais foram obtidos a partir dos fornecedores do seguimento: anticorpos contra XBP-1, ATF6, NFkB, GAPDH, e β-actina foram de Santa Cruz biotechnology Inc. (Santa Cruz, CA); antibodie contra GRP94 da Cell Signaling Technology (Beverly, MA); anticorpo aganist p-IRE1 eram da Thermo Scientific Pierce anticorpos (Rockford, IL); contagem de células kit-8 foram obtidos a partir Beyotime Instituto de Biotecnologia (Nantong, China); proliferação de células Br-du kit de ELISA foi obtido a partir de Roche (Penzberg, Alemanha); pCMV6-XL5-XBP-1S foi comprado a partir de plasmídeo Origene (Rockville, MD); controle de miRNA negativo (miR-con e anti-miR-con), miR-214 imita e anti-miR-214, agomir-214 e agomir-NC, antagomir-214 e antagomir-NC, siRNA segmentação NFkB humana /foram obtidos p65 de RiboBio (Guangzhou, China); Todos os outros produtos químicos e reagentes foram adquiridos de Sigma-Aldrich (Sigma-Aldrich China Inc., Xangai, China) salvo indicação em contrário.
amostras de tumores humanos
Um total de 23 snap-congelados normais e tecidos malignos do fígado (14 homens e 9 mulheres; idade média, 65,0 y; gama, 50-78 y) foram coletadas em Tongji hospitalar (Wuhan, Hubei China). tecidos hepáticos normais humanos foram obtidos a partir de tecido hepático normal distal de pacientes hemangioma fígado. Este estudo foi aprovado pelo Conselho de Revisão de Tongji Hospital e Tongji Medical College. Os indivíduos recrutados para o estudo forneceu consentimento informado por escrito. A investigação está em conformidade com os princípios enunciados na Declaração de Helsinki. As amostras de tecido foram obtidas e mantidas congeladas em azoto líquido e depois armazenadas a -80 ° C até à sua utilização.
cultura celular
A linha de células de hepatoma humano HepG2 e uma linha celular de cancro cervical humano HeLa foram obtidos a partir de a American Type Culture Collection (Manassas, VA), e a linha celular de hepatoma humano SMMC-7721 foi da Comissão da Type Culture Collection da Academia chinesa de Ciências (Xangai, China), e mantidas como recomendado pela fonte. As células foram cultivadas em DMEM, ajustado para conter 4 mM de L-glutamina, 1,5 g /L de bicarbonato de sódio, 4,5 g /l de glucose, 10% de FBS, 100units /ml de penicilina, e 65units /ml de estreptomicina. Todas as linhas celulares foram mantidas a 37 ° C numa incubadora humidificada contendo 5% de CO
2.
transfecção celular e tratamentos
HepG2 e células SMMC-7721 foram transfectadas com miARN /siRNA controle negativo (miR-con e sir-con), miR-214 imita ou siRNA segmentação humana NFkB /p65 (RiboBio, Guangzhou, China) usando Lipofectamine 2000 (Invitrogen, Carlsbad, CA) seguindo o protocolo do fabricante. As sequências de siRNA para NFkB humana /p65 foram: 5′-GCC CUA UCC CUU UAC GUC A-3 ‘[58]. células SMMC-7721 foram tratadas com 100 nM agomir-214 e agomir-NC, antagomir-214 e antagomir-NC e foram recolhidos 24 horas após o tratamento para o xenotransplante em ratinhos nus modle e ensaio de incorporação Br-du. As células HepG2 foram tratadas com 5 ng /ml de tapsigargina e 5 mol L tunicamicina /e recolhidas 24 horas após o tratamento por Western blotting (WB) e análise de extracção de ARN. condições de hipóxia foram criados usando 100 M de CoCl
2 por 24 horas antes da coleta de células.
análise de Western blot
Proteínas de lisados celulares (20 ug) foram separados por 10% SDS electroforese em gel de poliacrilamida e transferido para uma membrana de difluoreto de polivinilideno. Após bloqueio em leite magro a 5%, manchas de proteína foram incubadas com um anticorpo específico seguido de incubação com um anticorpo secundário conjugado com peroxidase em tampão de bloqueio.