Abstract
RGS10 é um importante regulador da sobrevivência celular e chemoresistance no câncer de ovário. Recentemente, mostrou que RGS10 expressão transcrição é suprimida durante chemoresistance adquirida em câncer de ovário. A supressão de RGS10 é devido à hipermetilação do ADN e histona desacetilação, dois mecanismos importantes que contribuem para o silenciamento de genes supressores de tumor durante a progressão do cancro. Aqui, nós investigar plenamente os mecanismos moleculares de silenciamento epigenético da expressão RGS10 em células de câncer de ovário resistente à quimioterapia A2780-AD. Identificamos dois reguladores epigenéticas importantes, HDAC1 e DNMT1, que apresentam associação aberrante com os promotores RGS10 em células de cancro do ovário quimiorresistentes. Knockdown de HDAC1 ou expressão DNMT1, e a inibição farmacológica da actividade enzimática DNMT ou HDAC, aumenta significativamente a expressão RGS10 e a morte celular mediada pela cisplatina. Finalmente, DNMT1 derrubar também diminui HDAC1 de ligação ao promotor RGS10 em células quimiorresistentes, sugerindo recrutamento HDAC1 aos promotores RGS10 requer uma atividade DNMT1. Nossos resultados sugerem que HDAC1 e DNMT1 contribuir para a supressão de RGS10 durante chemoresistance e apoio inibição adquirida HDAC1 e DNMT1 como uma abordagem terapêutica adjuvante para superar chemoresistance câncer de ovário
Citation:. Çaçan E, Ali MW, Boyd NH , Hooks SB, Greer SF (2014) Inibição da HDAC1 e DNMT1 Modular RGS10 Expressão e Diminuir o cancro do ovário chemoresistance. PLoS ONE 9 (1): e87455. doi: 10.1371 /journal.pone.0087455
editor: Malú G. Tansey, da Universidade Emory, Estados Unidos da América
Recebido: 10 de outubro de 2013; Aceito: 25 de dezembro de 2013; Publicação: 27 de janeiro de 2014
Direitos de autor: © 2014 Çaçan et al. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Licença Creative Commons Attribution, que permite uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o autor original ea fonte sejam creditados
Financiamento:. A investigação foi suportado por Grant # RSG-09-067-01-LB da American Cancer Society. O financiador não teve nenhum papel no desenho do estudo, recolha e análise de dados, decisão de publicar ou preparação do manuscrito
CONFLITO DE INTERESSES:.. Os autores declararam que não existem interesses conflitantes
Introdução
o câncer de ovário é um dos mais mortíferos cancros ginecológicos, com uma taxa de mortalidade de 60% em pacientes e uma taxa de sobrevivência de 5 anos de inferior a 30% na doença avançada fase [1]. A taxa de mortalidade elevada é devido, em grande parte para o desenvolvimento de resistência a fármacos quimioterapêuticos [2], [3]. Assim, a compreensão dos mecanismos moleculares e genéticas que impulsionam o desenvolvimento de chemoresistance adquirida nos permitirá melhorar a agentes terapêuticos atuais para o tratamento do câncer de ovário. receptores acoplados à proteína G (GPCRs) iniciar a múltiplas vias de sinalização oncogénicas em células cancerosas através da activação suas proteínas G associadas [4], [5]. A activação de GPCRs por factores de crescimento tais como ácido lisofosfatídico (LPA) desencadeia vias de sobrevivência de sinalização que conduzem a resistência a fármacos quimioterapêuticos, tais como cisplatina e taxano [6]. ativação GPCR de proteínas G opõe-se a atividade de regulador de proteínas de sinalização da proteína G (RGS). proteínas RGS inibem as vias de sinalização da proteína G por ligação directa à subunidade Gu activado das proteínas G para acelerar a hidrólise de GTP em GDP, que retorna proteínas G para um estado inactivo [7] – [10]. Relevantes para os nossos estudos, relatórios recentes indicam que proteínas RGS inibem mama, pulmão, próstata, e no crescimento de células do cancro do ovário, através da inibição de GPCRs vias de sinalização [2], [11] – [15].
RGS10 está entre a menor das proteínas RGS e é altamente expresso em uma ampla gama de tipos de células [16] – [19]. RGS10 é um importante regulador da sobrevivência celular e quimiorresistência [2], e a expressão transcrição RGS10 é significativamente suprimida em várias linhas celulares de cancro do ovário [15]. Assim, a supressão de proteínas RGS10 pode contribuir para quimiorresistência, amplificando o crescimento celular mediada pelo GPCR e os percursos de sobrevivência de sinalização. Mostrámos recentemente que a supressão de RGS10 é em parte devido à hipermetilação do ADN e a desacetilação da histona, dois mecanismos importantes-silenciamento de genes que contribuem para a progressão de diversos cancros. A metilação do DNA é mantida por transferases de ADN de metilo (DNMTs) [20] e desacetilação histona é mantida por histona desacetilases (HDACs) [21]. Muitas vezes, estas duas enzimas coordenadamente suprimir a actividade transcricional de genes [22], [23]. Fuks
et ai. Relataram que
DNMT1 está associado com a actividade da desacetilase de histona e tem a capacidade de se ligar HDAC1 [24]. No entanto, os mecanismos moleculares pelos quais hipermetilação do DNA e histonas deacetylation suprimir RGS10 ea contribuição destas enzimas para chemoresistance adquirida permanece desconhecida.
Nós investigamos aqui os mecanismos moleculares de regulação epigenética da expressão RGS10 em células de câncer de ovário e foco em células quimiossensíveis parentais A2780 e sua linha de células derivada, resistente à quimioterapia A2780-AD. Identificamos dois reguladores epigenéticas importantes, HDAC1 e DNMT1, que são altamente associados com o promotor RGS10 em células de cancro do ovário quimiorresistentes. HDAC1 e DNMT1 derrubar aumenta significativamente a expressão RGS10 e morte celular estimulada pela cisplatina. Nossos resultados sugerem que HDAC1 e DNMT1 contribuir para a supressão de RGS10 durante chemoresistance e apoio crescente evidência adquirida que a inibição da HDAC1 /DNMT1 representam novas abordagens terapêuticas para superar chemoresistance câncer de ovário.
Materiais e Métodos
As linhas celulares e reagentes
A linha de quimiossensíveis A2780 parental celular e suas células A2780-AD quimiorresistentes derivativos (derivado como descrito [25]) foram generosamente fornecidos pelo Dr. Bob Brown, imperial College London. Estas células foram mantidas em meio RPMI 1640 (Mediatech Inc.) suplementado com 10% de FBS e 5 mM de L-glutamina. células resistente à quimioterapia, foram ainda mantidas em 3 pM de cisplatina. Todas as células foram cultivadas em 5 mM de penicilina-estreptomicina a 37 ° C com 5% de CO
2. células OV2008 e C13 (derivados como descrito [26], [27]) foram generosamente fornecidos pelo Dr. Patricia Kruk, University of South Florida.
5-aza-2′-desoxicitidina (5-Aza-dC ), Tricostatina A (TSA), cisplatina e foram adquiridos da Sigma-Aldrich (St. Louis, MO). Os anticorpos que reconhecem RGS10, HDAC1, anticorpos de coelho conjugado de cabra anti-rato IgG-HRP (peroxidase de rábano), e HRP foram obtidos a partir de Santa Cruz (Santa Cruz, CA). Os anticorpos que reconhecem DNMT1 foram obtidos a partir de Abcam (Cambridge, MA). anticorpos de ratinho conjugado com HRP foram adquiridos a Promega (Madison, WI). Os anticorpos que reconhecem β-actina foram obtidos a partir de Cell Signaling (Beverly, MA).
construções de siRNA e transfecção transiente
Curto ARN interferente (siRNA) pré-concebido para HDAC1 (Qiagen), e RGS10 DNMT1 (Santa Cruz) foram usados para derrubar expressão de HDAC1, RGS10 ou DNMT1. Todos mexidos estrela ARNsi de controlo (Qiagen) foi utilizada como um controlo. células A2780-AD foram transfectadas com 10 nM de HDAC1 ou siRNA específico DNMT1 ou All Star mexidos siRNA controle usando HiPerfect reagente de transfecção (Qiagen) de acordo com as instruções do fabricante. Após o tempo de incubação indicado, as células foram colhidas e analisadas por Western blot, a expressão de RNA, ou experiências de imunoprecipitação de cromatina.
expressão de ARN e quantitativa PCR em tempo real
O ARNm foi isolado utilizando o reagente de extracção de ARN Qiazol (Qiagen), como descrito no protocolo do fabricante. Resumidamente, as células foram lisadas em Qiazol e agitados num agitador rotativo 3D durante 5 minutos. 200 ul de clorofórmio foi adicionada e foi incubada durante três minutos à temperatura ambiente. As amostras foram centrifugadas e a fase aquosa (400 uL) foi transferido para um tubo eppendorf. 500 mL de isopropanol foi adicionado e foi incubada durante 10 minutos à temperatura ambiente. Após centrifugação, os sedimentos foram lavados com 1 ml de etanol frio a 75%, centrifugado e ressuspenso em 50 ul de ARNase água livre. O ARN foi quantificado e o cDNA foi gerado a partir de 1 ug de ARN extraído total utilizando um Kit de Transcrição Reversa Omniscript (Qiagen). Após a síntese de ADNc, reacção em cadeia da polimerase em tempo real quantitativo foi realizado utilizando TaqMan Universal PCR master mix (Roche) e os iniciadores e sondas de segmentação RGS10 ou GAPDH regiões de codificação específicos. expressão transcrição foi avaliada usando um 7900HT Real-Time PCR System ABI PRISM (Applied Biosystems). As reações foram normalizados contra a expressão GAPDH e os cálculos foram realizados utilizando curvas padrão geradas. Os iniciadores utilizados foram: RGS10 Forward: 5′- GAC CCA AGA AGG CGT GAA AAG A-3 ‘, RGS10 reversa: 5′-GCT GGA CAG AAA GGT CAT GTA GA-3′, sonda RGS10: 5’-AGA TAA GAC GCA GAT GCA GGA AAA GGC-3 ‘, GAPDH Forward: 5′-GGA AGC TCA CTG GCA TGG C-3′, GAPDH reversa: 5’-TAG ACG GCA GGT CAG GTC CA-3 ‘e GAPDH sonda: 5’CCC CAC TGC CAA CGT GTC AGT G-3 ‘.
Para determinar o efeito do 5-Aza-dC e exposição TSA na expressão transcrição RGS10, 1 × 10
6 células A2780-AD foram semeadas por 10 cm
placa de cultura de tecido 2 e foram incubadas durante a noite. As células foram tratadas com 20? M de 5-aza-dC ou com TSA 500 ng dissolvidos em DMSO. TSA células tratadas foram incubadas durante 48 horas e 5-aza-dC tratada células foram incubadas durante três, cinco ou sete dias, com os meios aspirados e substituídos por dia. Isolamento de ARN e a síntese de ADN foram realizadas como descrito acima.
imunoprecipitação da cromatina (ChIP) ensaio
ChIP ensaios foram realizados como previamente descrito [15]. Resumidamente, as células foram plaqueadas a uma densidade de 2 × 10
6 em 10 cm
2 placas. Três milhões de células foram reticuladas com formaldeído a 1%, durante oito minutos à temperatura ambiente. reacções de reticulação foram paradas pela adição de 0,125 M de glicina. núcleos de células foram isolados e foram concentradas por lise em tampão de lise de SDS (SDS a 1%, EDTA a 10 mM, Tris 50 mM, pH 8,0) mais inibidores de proteases durante 30 minutos em gelo, seguido de congelamento em azoto líquido de flash. Os núcleos foram sonicadas usando um sonicador de banho de água Bioruptor (Diagenode) para gerar uma média de 500 pb de ADN cortado que foi confirmado por electroforese em gel de agarose. Os lisados foram pré-aclarados com sonicados grânulos salmão-esperma /agarose (Millipore), a 5% do total de lisado foi armazenada como uma entrada para a normalização. Metade do lisado remanescente foi imunoprecipitada com 5 ug de anticorpo indicado durante a noite a 4 ° C e a outra metade do lisado foi imunoprecipitado com um anticorpo de controlo. Na sequência de uma imunoprecipitação adicional de duas horas com revestidos salmão esperma-esferas de agarose, todas as amostras foram lavadas com cada um dos seguintes tampões: tampão de baixo teor de sal (0,1% de SDS, 1% de Triton X-100, EDTA 2 mM, Tris 20 mM, pH 8,0, NaCl 150 mM), tampão de alto teor salino (0,1% de SDS, 1% de Triton X-100, EDTA 2 mM, Tris 20 mM, pH 8,0, NaCl 500 mM), LiCl (0,25 M de LiCl, 1% NP40, 1% de DOC, 1 mM de EDTA, 10 mM de Tris pH 8,0), e 1 x TE (Tris-EDTA); O DNA foi então eluído com tampão de eluição de SDS (SDS a 1%, 0,1 M de NaHCO3). Após eluição, ligações cruzadas foram revertidas durante a noite com 5 M de NaCl a 65 ° C e o ADN foi isolado imunoprecipitadas utilizando fenol: clorofórmio: mistura de isopropanol (Invitrogen) de acordo com as instruções do fabricante. ADN isolado foi quantificado por PCR em tempo real no ABI Prism 7900 HT (Applied Biosystems, Foster City, CA) utilizando iniciadores e sondas específicos de segmentação RGS10 GAPDH e promotores região. Valores gerados a partir de reações de PCR em tempo real foram calculados com base nas curvas padrão geradas, foram executados em reações triplicado, e foram analisados usando o programa SDS 2.0 (Applied Biosystems).
células ensaio de imunoprecipitação da cromatina em siRNA tratados
quimiorresistentes células A2780-AD foram plaqueadas a uma densidade de 1,2 x 10
6 células por 10 cm
2 placas de cultura de tecidos. As células foram tratadas com siRNA construções tal como descrito acima e foram incubadas durante 72 horas. As células foram colhidas e 1/10 do volume de células foi removida para análise de eficiência de knockdown por análise Western Blot. ChIP ensaios foram realizados como descrito acima, nas células colhidas restantes.
células de expressão do ARN em siRNA tratados
As células foram plaqueadas a uma densidade de 1 x 10
6 células por 10 cm de altura placa e cultura
2 de tecido foram incubadas durante a noite. As células foram então transfectadas com o ARNsi indicados construir tal como descrito acima e incubadas durante 72 horas, e uma extracção de ARN foi efectuada tal como descrito acima.
Ensaio de Apoptose
A apoptose de células A2780-AD foi avaliada utilizando o anexina V: PE Apoptosis Detection Kit I (BD Pharmingen). 1 × 10
6 células A2780-AD foram plaqueadas em 10 cm
2 placa de cultura de tecidos e foram incubadas durante 24 horas a 37 ° C. As células foram tratadas com ARNsi de HDAC1 ou com ARNsi de controlo usando o reagente de transfecção HiPerfect. Após 48 horas de incubação, 50 pM de cisplatina foi adicionado a ambos HDAC1 siRNA e controlar células siRNA tratados e as células foram incubadas durante um período adicional de 48 horas. células A2780-AD foram brevemente tripsinizadas e foram colhidas. Uma fracção de volume de células foi removida para análise de Western Blot e a fracção remanescente de células foi lavada duas vezes com PBS frio e foi ressuspenso em tampão de ligação de anexina V a uma concentração de 1 × 10
6 células /ml. As células foram então transferidas para tubos de cultura de 5 mL contendo 5 uL de Anexina V-PE e /ou 5 ul de 7-Aminoactinomycin D (7-AAD). As amostras foram suavemente misturadas e foram incubadas durante 20 minutos à temperatura ambiente. A seguir à adição de 400 ul de tampão de ligação de anexina V a cada tubo, as amostras foram analisadas e quantificadas por citometria de fluxo e os dados resultantes foram analisados utilizando o software FlowJo.
Resultados
acetilação de histona está suprimido em promotores RGS10 em células de cancro do ovário
Temos recentemente mostrado que os níveis de acetilação das histonas histona H3 são significativamente diminuída no promotor RGS10-1 no modelo de células A2780-AD de chemoresistance cancro do ovário [15]. Para confirmar estes resultados em linhas celulares adicionais, imunoprecipitação da cromatina (chip) ensaios foram realizados na linha de células de cancro do ovário quimiossensíveis OV2008 e em células-filhas C13 quimiorresistentes. Enquanto que os níveis totais de histona H3 são semelhantes em ambos os promotores RGS10 e GAPDH em células quimiossensíveis e quimiorresistentes (Fig. 1A), os níveis de histona H3 acetilada são significativamente mais baixos em promotores RGS10 nas células de cancro do ovário C13 quimiorresistentes em comparação com células OV2008 quimiossensíveis ( a Fig. 1B).
ChIP ensaios foram realizados em células parentais OV2008 e C13 células resistentes aos medicamentos. Os lisados foram imunoprecipitados com o controlo, anti-histona H3, anti-acetil histona H3, ou anticorpos anti-H3K18 acetilo. ADN associado foi isolado e analisado por meio de PCR em tempo real utilizando iniciadores que abrangem os promotores RGS10 e GAPDH. Os valores de PCR em tempo real foram normalizadas para a quantidade total de promotor de DNA adicionado (entrada). valores de entrada representam 5% do ligado celular total. ** P 0,005. A) os níveis de histona H3 globais associados com RGS10 GAPDH e promotores. B) Os níveis globais de acetilação das histonas H3 associado com RGS10 e GAPDH promotores. C) Os níveis de histona H3 acetilada na lisina 18 associado com RGS10 e GAPDH promotores.
As reduções no H3 lisina 18 acetilação (H3K18Ac) têm sido associados com fenótipos câncer agressivo e com mau prognóstico do paciente [28] , [29]. A seguir, realizados ensaios de chip para determinar se a perda de H3K18 contribui para a perda de acetilação da histona global a promotores RGS10 em células C13 quimiorresistentes. Uma diminuição significativa na H3K18 acetilação em promotores RGS10 foi observada em células C13 quimiorresistentes, enquanto H3K18 acetilação com os promotores de GAPDH em células OV2008 e C13 permaneceram inalterados (Fig. 1C). Em conjunto, estes dados sugerem a perda de acetilação em promotores RGS10 contribui para a perda de expressão RGS10 em dois modelos celulares independentes de cancro do ovário resistente à quimioterapia.
HDAC1 e expressão DNMT1 suprimir RGS10 em células de cancro do ovário quimiorresistentes
que anteriormente se demonstrou que as proteínas se ligam com HDAC1 significativamente o aumento da frequência para o promotor RGS10 em células A2780 AD-quimiorresistentes em comparação com as células A2780 progenitoras quimiossensíveis [15]. Para investigar papéis moleculares para HDAC1 na regulação da expressão RGS10, um duplex siRNA foi utilizada para bater especificamente para baixo expressão HDAC1 endógena em células A2780-AD. knockdown mediada por siARN da HDAC1 resultou num aumento de mais de 3 vezes na expressão RGS10 transcrição endógena, em comparação com ARNsi de controlo (Fig. 2A), sugerindo que HDAC1 desempenha um papel crítico na regulação da transcrição RGS10. A análise Western blot confirmou HDAC1 derrubar o aumento da expressão da proteína RGS10 (Fig.2B). Numa experiência semelhante, as células A2780-AD foram transfectadas com HDAC1 para determinar os efeitos da expressão ectópica de HDAC1. Superexpressão de HDAC1 reduziu drasticamente expressão RGS10 em células A2780-AD quimiorresistentes (Fig. 2C-E). Em conjunto, estes dados indicam que a acumulação de HDAC1 em promotores RGS10 provavelmente contribui para a supressão de RGS10 em células de cancro do ovário quimiorresistentes.
A) knockdown de ARNm RGS10 HDAC1 aumenta a transcrição. células A2780-AD foram transfectadas com HDAC1 ou ARNsi de controlo e incubadas durante 72 horas. O ARN foi extraído e o cDNA foi gerado usando um iniciador inverso para a segmentação RGS10 ou GAPDH região de codificação. Os dados foram quantificados usando qPCR com os iniciadores e sondas específicas para as regiões de codificação RGS10 e GAPDH. dados representados graficamente mostra a média de três experiências independentes, com barras de erro denotam erro padrão da média (SEM). A significância foi calculado com um teste de t de Student ** p 0,005. B) Análise de Western blot demonstrando eficiência do knockdown HDAC1 e expressão da proteína RGS10 seguinte HDAC1 knock down com os controles da beta-actina. C-D) HDAC1 superexpressão diminui RGS10 expressão em células quimiorresistentes. células A2780 /AD foram plaqueadas em placas de 24 poços e deixadas fixar durante a noite. As células foram transfectadas com 500 ng de HDAC1 ou vector vazio utilizando FuGene 6 reagente (Promega) de acordo com o protocolo do fabricante. Após 48 horas de incubação, as células foram colhidas em Trizol (Invitrogen) e a expressão de genes e RGS10 HDAC1 foi avaliada através de RT-PCR, como descrito, e normalizado para expressão do gene de actina. Os valores representam a média ± EPM de quatro experiências independentes *** p 0,0005. E) análise de transferência de Western demonstrando a expressão de proteína RGS10 seguinte superexpressão HDAC1 com controlos da beta-actina.
O promotor RGS10-1 contém uma concentração elevada de dinucleótidos CpG tornando-o um alvo potencial para a metilação de manutenção durante DNMT ovário progressão do câncer. Em primeiro lugar, determinado por análise de Western blot que os níveis de expressão DNMT1 são semelhantes em ambas as linhas celulares A2780 e A2780-AD (Fig. 3B). Para explorar ainda mais a relevância da DNMT1 na supressão específica de expressão RGS10, ensaios ChIP foram realizadas em A2780 dos pais e suas células A2780-AD resistentes derivativos. Os lisados foram imunoprecipitados com o controlo ou anticorpo anti-ADN e DNMT1 associada foi analisada quantitativa por meio de PCR em tempo real (qRT-PCR) utilizando iniciadores e sondas que medem os promotores específicos RGS10 e GAPDH. Em contraste com a abundância de proteína total, ensaios ChIP revelam que a ligação de DNMT1 é significativamente aumentada no promotor RGS10 quimiorresistentes em células, em comparação com células de cancro do ovário quimiossensíveis (Fig. 3a). Em conjunto, estes dados indicam que a acumulação de DNMT1 no promotor RGS10 provavelmente contribui para a supressão de RGS10 durante quimiorresistência do cancro do ovário.
A) Níveis de DNMT1 associada com promotores RGS10 em células de cancro do ovário A2780 e A2780-AD. ChIP ensaios foram realizados em A2780 parental e as suas células A2780 AD-resistentes derivados. Os lisados foram imunoprecipitados com o controlo ou anticorpo anti-DNMT1. ADN associado foi isolado e analisado por meio de PCR em tempo real utilizando iniciadores e sondas que medem os promotores específicos RGS10 e GAPDH. Os valores de PCR em tempo real foram normalizadas para a quantidade total de promotor de DNA adicionado (entrada). Os valores foram normalizados para GAPDH e representam a média ± SEM de três experiências independentes ** p 0,005. B) Análise de Western blot dos níveis DNMT1 globais em células A2780 e A2780-AD. As células foram recolhidas e os lisados foram utilizados para a imunoprecipitação. esferas de agarose-anticorpo conjugado (IP) para DNMT1 foram incubados com rotação durante a noite. As esferas foram lavadas, e eluiu-se submetida a Western blot com anticorpos respectivos. C) Células A2780-AD foram transfectadas com ARNsi DNMT1 ou com ARNsi de controlo e foram incubadas durante 72 horas. O ARN foi extraído e o cDNA foi gerado usando os iniciadores reversos de segmentação regiões codificantes RGS10 e GAPDH. Os dados gerados foi quantificada utilizando qRT-PCR com iniciadores e sondas específicas para a região codificadora de RGS10. Os valores representam a média ± EPM de quatro experiências independentes ** p 0,005. D) Análise de Western blot para a eficiência de derrubar DNMT1 e para a expressão da proteína RGS10 seguinte DNMT1 derrubar.
A acumulação de DNMT1 no promotor RGS10 levou-nos a determinar se que a acumulação afeta nível de expressão transcrição RGS10 em células quimiorresistentes. Para este fim, as células A2780-AD foram transfectadas com DNMT1 ou ARNsi de controlo. Extraiu-se ARN e ADNc gerada foi quantificada utilizando qRT-PCR com iniciadores e sondas específicas para a região de codificação RGS10 e normalizado para expressão do gene GAPDH de limpeza. Os dados revelam que derrubar DNMT1 significativamente aumenta a expressão endógena RGS10 transcrição (Fig. 3C) e a expressão de proteína (Fig. 3D) em células A2780-AD. Este aumento sugere que funções DNMT1 com HDAC1 para regular a supressão de RGS10 transcrição em células A2780-AD quimiorresistentes.
A inibição da HDAC e atividade DNMT aumenta a expressão RGS10 e diminui o câncer de ovário viabilidade celular
próxima procuraram determinar se inibidores farmacológicos de desacetilação de histonas e metilação de ADN pode alterar a expressão de RGS10 em células de cancro do ovário quimiorresistentes. A TSA inibidor de HDAC e DNMT inibidor de 5-aza-dC foram utilizados para inibir a HDAC e DNMTs, respectivamente. células A2780-AD foram tratadas com 500 nM TSA e foram incubadas durante 2 dias ou foram tratadas com 20? M de 5-aza-dC e incubou-se durante 3, 5 e 7 dias. O ARN total foi isolado a partir de células não tratadas de controlo, tsa, e 5-aza-dC células tratadas. A expressão relativa de expressão transcrição RGS10 foi quantificado por qRT-PCR e foi normalizado para a expressão de GAPDH transcrição. Consistente com observações de HDAC1 e DNMT1 derrubar experimentos, TSA e 5-Aza-DC tratamentos ambos significativamente reforçada expressão transcrição RGS10 em células A2780-AD quimiorresistentes (Fig. 4A e 4B). Para explorar potenciais papéis sinérgicos para HDAC1 e DNMT1 na regulação da expressão RGS10, estudos de associação foram realizadas utilizando TSA e 5-Aza-dC em células de cancro do ovário quimiorresistentes. Mais uma vez, TSA ou 5-aza-dC sozinho expressão aumentada RGS10 em células A2780-AD, e a combinação das duas drogas resulta num aumento de vezes na expressão RGS10 maior do que a soma dos efeitos individuais, sugerindo um efeito cooperativo potencial (Fig . 4C). Para investigar as funções de cooperação para HDAC1 e DNMT1 no crescimento celular e quimiorresistência, células A2780-AD foram tratados com TSA e /ou 5-aza-dC na presença de cisplatina e ensaios de viabilidade celular foram realizadas. 5-aza-dC sozinha reduziu o crescimento celular em aproximadamente 40%, enquanto a TSA por si só teve um efeito modesto mas significativo na viabilidade das células; No entanto, a combinação de TSA e 5-aza-dC inibiu a viabilidade celular em 90%. Como esperado, as células A2780-AD foram resistentes à toxicidade da cisplatina, mas de qualquer TSA ou 5-aza-dC parcialmente re-sensibilizados a células a citotoxicidade mediada pela cisplatina (Fig. 4D). Para determinar se RGS10 regulação positiva pelo TSA /5-aza-dC tratamento combinado poderia inteiramente responsáveis pela perda de viabilidade celular, uma tentativa para resgatar a viabilidade das células na presença de 5-aza-dC e TSA com RGS10 siARN. Não surpreendentemente, knock-down de RGS10 sozinho não resgatar a viabilidade celular, consistente com a ampla gama de HDAC e DNMT genes alvo em células cancerosas (Fig. 4E). Assim, RGS10 coordenadamente regula a viabilidade celular e a quimiossensibilidade com HDAC adicionais e genes alvo DNMT.
O ARN total foi isolado a partir de células de controlo não tratadas e TSA ou 5-aza-dC células tratadas. A expressão relativa de ARNm RGS10 foi quantificado por qRT-PCR e normalizada para a expressão de GAPDH transcrição * p 0,05; ** P 0,005. A) aumenta a inibição de HDAC RGS10 expressão em células A2780 AD-quimiorresistentes. As células foram plaqueadas numa 10 cm
2 placa e incubou-se durante 24 horas. No dia seguinte, as células foram tratadas com 500 nM TSA e foram incubadas durante um período adicional de 48 horas. B) DNMT inibidor de 5-aza-dC aumenta a expressão em células RGS10 quimiorresistentes. Dois milhões de células A2780-AD foram semeadas em placas de 10 cm
2 e placas foram incubadas durante 24 horas. No dia seguinte, as células foram tratadas com 20? M de 5-aza-dC. Mídia e drogas foram atualizado a cada 24 horas. Após o tempo de incubação indicado (3, 5, e 7 dias), as células foram recolhidas, o ARNm foi isolado, e o ADNc foi gerado e quantificado utilizando qRT-PCR com iniciadores e sonda específicas. C) As células A2780-AD foram plaqueadas em placas de 96 poços e tratadas com 5 uM 5-aza-dC, durante 5 dias, 500 nM TSA durante 36 horas, uma combinação de 5? M de 5-aza-dC durante 5 dias e 500 nm TSA para as 36 horas finais ou DMSO. A expressão de genes foi avaliada utilizando qRT-PCR, como descrito, e normalizado para expressão do gene RPL13A. A seta indica o nível de expressão previsto por um efeito aditivo de TSA e 5-aza-dC. D) Em uma experiência paralela, as células A2780-AD foram tratados sob as mesmas condições que 4C, com ou sem cisplatina 30 uM durante as 12 horas finais. A sobrevivência das células foi avaliada utilizando ensaios de viabilidade fluorimétricos CellTiter-Azul. ***: P 0,001 comparando droga epigenética para controlo de DMSO na ausência de cisplatina. ###: P 0,001 comparando veículo versus tratamento cisplatina dentro dos grupos de tratamento de drogas epigenética. A caixa a tracejado indica a viabilidade celular previsto por um efeito aditivo de TSA e 5-aza-dC. E) as células A2780 /AD (5000 células /poço) foram plaqueadas em placas de 96 cavidades e foram transfectadas com controlo negativo ou cadeias duplas de siRNA RGS10 (Ambion Grand Island, NY), conforme o protocolo do fabricante usando o reagente de transfecção Dharmafect1 (Dharmacon). As células foram doseadas com uma combinação de 5? M de 5-aza-dC durante 3 dias e 500 nM TSA para a última 36 h ou DMSO. cisplatina 30 uM, ou veículo foi adicionado para a última 12 h. A sobrevivência das células foi avaliada através de ensaios de viabilidade fluorimétricos CellTiter-Azul.
Derrubar HDAC1 intensifica a apoptose estimulada por cisplatina em células quimiorresistentes
O nosso trabalho anterior sugere que a supressão da expressão RGS10 contribui para a desenvolvimento de quimioresistência durante a progressão do cancro do ovário, através de amplificação de sobrevivência vias de sinalização endógenas [2], [15], e os resultados aqui apresentados sugerem que a HDAC1 contribui para a perda de expressão RGS10 em células de cancro do ovário quimiorresistentes. Para determinar mudanças mediada por HDAC1 na sobrevivência celular de células de cancro do ovário quimiorresistentes, células A2780-AD resistentes cisplatina foram transfectadas com HDAC1 siRNA. Após a transfecção, as células foram incubadas com cisplatina 50 uM e a apoptose foi analisada utilizando um Anexina V: kit de detecção de apoptose PE (BD Pharmingen). A anexina V liga-se a fosfatidilserina, a qual está exposta apenas em células apoptóticas, enquanto a etiqueta ADN impermeante de membrana 7-Aminoactinomycin D (7-AAD) liga-se selectivamente às regiões de GC do ADN apenas em apoptose tardia ou células mortas com membranas comprometidas [30] – [32]. Assim, as células início apoptóticos estão manchadas com apenas anexina V-PE, enquanto as células tarde apoptóticos e mortos estão manchadas com tanto anexina V-PE e 7-AAD. A análise de citometria de fluxo foi usada para distinguir entre as populações de células não marcadas e singly- ou duplamente marcada. HDAC1 derrubar aumentou significativamente a população de células estimuladas com cisplatina a partir de 12,9% para 32,1% que são positivas tanto para anexina V-PE e 7-AAD (células apoptóticas tardias ou mortas) (Fig. 5A). Os resultados são confirmados por três experiências independentes (Fig. 5B). Derrubar a eficiência da expressão da proteína HDAC1 e RGS10 seguindo o HDAC1 derrubar foi confirmada em células A2780-AD por análise de western blot (Fig. 5C). Em conjunto, estes dados sugerem que HDAC1 redução mediada de expressão RGS10 embota a capacidade de cisplatina para induzir a morte celular em células de cancro do ovário A2780 /AD.
células A2780-AD foram tratados com HDAC1 ou ARNsi de controlo e foram incubadas durante 48 horas. Após a incubação, as células foram tratadas com 50 pM de cisplatina e incubou-se durante 48 horas adição em meio RPMI 1640. Um Anexina V: PE Apoptosis Detection Kit I (BD Pharmingen) foi utilizado para a coloração; Os resultados foram quantificados por análise de citometria de fluxo e foram analisadas usando software de FlowJo. As células viáveis foram negativos tanto para anexina V-PE e 7-AAD; células apoptóticas iniciais foram positivas para anexina V-PE e negativos para 7-AAD, enquanto que as células mortas apoptóticas tardias foram positivos para ambos anexina V-PE e rotulagem 7-AAD. A) O aumento relativo de células em apoptose em HDAC1- siRNA transfectadas células A2780-AD, que incorporaram o 7-AAD manchas anexina V-PE e. B) O gráfico representam média de três experiências independentes, com barras de erro denotam SEM * p 0,05. C) Análise de Western blot representa eficiência do knockdown HDAC1 e RGS10 expressão da proteína seguinte HDAC1 derrubar.
DNMT1 derrubar diminui HDAC1 de ligação ao promotor RGS10 em células de cancro do ovário quimiorresistentes
HDAC1 e DNMT1 contribuir para silenciamento de genes através do recrutamento de repressores de transcrição ao promotor regiões [33] – [35] e trabalhar juntos para suprimir a expressão gênica [24], [36]. Nossos dados sugerem que as atividades de HDAC e DNMT cooperativamente silenciar RGS10 (Fig. 4C). Para investigar a diafonia entre estes dois reguladores epigenética, células A2780-AD foram transfectadas com DNMT1 ou ARNsi de controlo e foram incubadas durante 72 horas. ligação ao promotor RGS10 HDAC1 foi examinado por ensaios chip no DNMT1 siRNA ou controlar células A2780-AD siRNA tratada. DNMT1 derrubar diminuiu significativamente a ligação de HDAC1 ao promotor RGS10 (Fig. 6A) e análise de western blot (Fig. 6B) demonstraram knockdown bem sucedido e específica de DNMT1. O experimento inverso também foi realizada em células A2780-AD foram transfectadas com HDAC1 siRNA. A análise por Western blot demonstrou knockdown de HDAC1 resultou na supressão da expressão da proteína DNMT1 (dados não mostrados); uma observação vista por outros, bem [37]. Estes dados sugerem que HDAC1 é recrutado para o promotor RGS10 através DNMT1 e a metil-CpG proteína de ligação 2 (MeCP2) mecanismos dependentes (Fig. 6C).