Abstract

Fundo

claudinas são proteínas da membrana que desempenham papéis críticos na junção (TJ) formação e função apertado. Os membros da família de genes claudina têm demonstrado ser regulada de forma aberrante, e a participar na patogénese de vários cancros humanos. No presente estudo, relatamos que claudin-11 (

CLDN11

) é silenciada no câncer gástrico

via

hipermetilação da sua região promotora.

Metodologia /Apreciação principais

Os níveis de

CLDN11

metilação e expressão de mRNA foram medidos em tecidos primários de câncer gástrico, mucosa gástrica não cancerosos, e linhas celulares de origem gástrica utilizando PCR quantitativo específico-metilação (qMSP) e quantitativa da transcriptase reversa-PCR (qRT-PCR), respectivamente. As análises dos cancros gástricos emparelhados e tecidos gástricos normais adjacentes hipermetilação revelada da região promotora

CLDN11

em cancros gástricos, e este hipermetilação foi significativamente correlacionada com a regulação negativa do

expressão CLDN11

vs

tecidos normais. O

CLDN11 e região promotor foi também hipermetilado em todas as linhas celulares de cancro gástrico testados em relação às células epiteliais gástricas normais imortalizadas. Além disso,

CLDN11

expressão de mRNA foi inversamente correlacionado com o seu nível de metilação. Tratamento de

CLDN11

-nonexpressing células cancerosas gástricas com 5-aza-2′-desoxicitidina restaurado

CLDN11

expressão. knockdown Além disso, siRNA mediada por

expressão CLDN11

em células epiteliais gástricas normais aumentaram sua motilidade e invasão.

Conclusões /Significado

Estes dados sugerem que a hipermetilação de

CLDN11

, levando a expressão reprimidos, contribui para carcinogênese gástrica através do aumento da motilidade celular e invasão. Uma melhor compreensão dos mecanismos subjacentes ao papel da Claudina proteínas na carcinogênese gástrica provavelmente ajudará na identificação de novas abordagens para diagnóstico e terapia do câncer gástrico

Citation:. Agarwal R, Mori Y, Cheng Y, Jin Z, Olaru AV, Hamilton JP, et ai. (2009) Silenciamento de Claudina-11 está associado ao aumento invasão das células neoplásicas gástrica. PLoS ONE 4 (11): e8002. doi: 10.1371 /journal.pone.0008002

editor: Fatah Kashanchi, George Escola de Medicina da Universidade de Washington, Estados Unidos da América

Recebido: 03 de agosto de 2009; Aceito: 23 de outubro de 2009; Publicação: 24 de novembro de 2009

Direitos de autor: © 2009 Agarwal et al. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Licença Creative Commons Attribution, que permite uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o autor original ea fonte sejam creditados

Financiamento:. Este trabalho foi apoiado pelos Estados Unidos Institutos Nacionais de Saúde concede CA085069, CA138677 e CA146799 a Meltzer SJ. Os financiadores não tiveram nenhum papel no desenho do estudo, coleta de dados e análise, decisão de publicar ou preparação do manuscrito

CONFLITO DE INTERESSES:.. Os autores declararam que não existem interesses conflitantes

Introdução

o câncer gástrico (GC) continua a ser a segunda causa mais comum de morte por câncer no mundo todo. É uma das neoplasias mais letais e uma das principais causas de morte por câncer nos países em desenvolvimento, com taxas de sobrevida em 5 anos em geral abaixo de 20% [1], [2].

Estudos de GCs e seu precursor pr�neopl�ica lesões identificaram várias alterações genéticas e epigenéticas, incluindo instabilidade de microssatélites, mutações pontuais, e perda de heterozigosidade (LOH) que afeta os genes supressores de tumor (ETG) [3] – [6]. No entanto, a patogênese molecular de GC ainda não é completamente compreendida.

alterações epigenéticas são extremamente importantes no desenvolvimento e progressão do câncer [7]. inactivação transcricional de genes supressores de tumor via hipermetilação do promotor aberrante de ilhas CpG, fazendo com que o silenciamento do gene permanente, é um importante mecanismo epigenético de TSG inativação.

Anteriormente, estudos têm sido publicados sobre a hipermetilação do promotor em GCs e seus precursores pré-malignas [ ,,,0],8] – [10]. p16INK4a e p15INK4B estavam entre os primeiros genes para mostrar hipermetilação em GCs [11]. O nosso grupo e outros posteriormente descobriu hipermetilação do gene de reparo incompatível DNA hMLH1 em GCs exibindo instabilidade freqüente de microssatélites (MSI-H) [12] – [14]. Nós também mostrou que a hipermetilação do gene da caderina-E (CDH1) ocorre freqüentemente em GCs [15].

Uma pesquisa do genoma baseado em microarray piloto realizado pelo nosso grupo, realizado para descobrir novos genes silenciados epigenetically em carcinogênese gástrica, identificado claudin-11 (

CLDN11

), uma proteína apertado junção (TJ), como um alvo potencial de inativação epigenética em cancros gástricos (dados não publicados).

claudina-11 pertence para a família de proteínas claudina, que contém mais de 23 membros. Os membros da família claudina são expressas de maneira altamente específica do tecido numa variedade de tecidos normais e neoplásicos [16]. Claudinas são proteínas transmembranares que desempenham papéis cruciais na formação e função TJ. TJs junções intercelulares são críticos para o transporte paracelular de solutos, bem como na manutenção da polaridade celular. As células tumorais comumente apresentam deficiências estruturais e funcionais em sua TJs [17].

Nos últimos anos, vários estudos têm demonstrado expressão aberrante de Claudina proteínas em vários tipos de câncer [18], [16]. Vários destes estudos encontraram desregulação da expressão da proteína claudina

via

hipermetilação do promotor. silenciamento induzido por hipermetilação da claudina-7 expressão foi previamente relatada em cancros da mama [19] e [20] colorectal carcinomas. Claudina-6 também é epigenetically silenciada no cancro da mama [21], enquanto claudinas -3 e -4 são epigenetically regulada em células de cancro do ovário [22], [23].

A corrente identifica estudos e relatórios, a nosso conhecimento, pela primeira vez, que o

CLDN11 e região promotor é hipermetilado em tecidos GC e linhas celulares. Além disso, enquanto

CLDN11

ARNm foi expressa em todos os tecidos da mucosa gástrica não cancerosos primários, bem como de uma linha normal, gástrico imortalizada de células epiteliais, foi silenciada em todos os tecidos e linhas celulares de GC examinados. downregulation Curiosamente, siRNA mediada por

CLDN11 Online em

CLDN11

-expressing células gástricas também foi associada com alterações fenotípicas relacionadas ao câncer, especificamente aumento da motilidade celular e invasão.

Materiais e Métodos

Linhas de células e tecidos Clínica amostras

células normais humanas imortalizadas gástricas epiteliais (HFE145) foram obtidos a partir de Dr. Duane T. Smoot (Universidade Howard) e GC linhas celulares AGS, SIIA, MKN28, KATOIII, e SNU-1 foram obtidas da ATCC. Todas as linhas celulares foram cultivadas e mantidas em meio RPMI 1640 suplementado com 10% de soro fetal de bovino e solução de antibiótico-antimicótico a 1% (Invitrogen).

emparelhados tecidos normais e de tumor gástrico primários foram recolhidos no Johns Hopkins Hospital ( JHH). Os espécimes foram snap-congelados imediatamente após a ressecção.

Ética Declaração

Johns Hopkins University (JHU) Institutional Review Board (IRB) aprovação foi obtida para todos os casos incluídos no estudo. Os casos foram obtidos a partir de JHU patologia cirúrgica sob 02-07-19-05e isenção JHU IRB-aprovado ao abrigo da regra 45 CFR 46,101 (b), que renuncia os requisitos para a obtenção de consentimento do paciente.

Purificação e preparação de DNA genômico O ARN total e

O ADN genómico foi extraído de amostras de tecido ou de linhas de células utilizando um DNeasy Blood Kit de tecido (Qiagen, Valencia, CA) de acordo com o protocolo do fabricante. O ARN total foi extraído com o reagente de Trizol (Invitrogen). Extraiu-se ADN e ARN foram quantificados usando um NanoDrop ND-1000 Spectrophotometer (NanoDrop, Wilmington, DE).

quantitativa metilação-PCR específica (qMSP) para Claudina-11

DNAs genómicos obtidos a partir de 36 amostras de paciente, que compreende 18 GC e 18 não canceroso estômago mucosas tecidos emparelhados (NS), bem como a partir de várias linhas de células gástricas, foram submetidos a qMSP. qMSP foi realizada como descrito anteriormente, com modificações de menor importância [24]. Em resumo, o tratamento com bissulfito de DNAs genómicos foi realizada utilizando um Kit de bissulfito Tratamento EpiTect (Qiagen, Valencia, CA). Um amplicon MSP e sonda TaqMan para detectar DNA completamente metilado foram projetados para incluir vários locais CpG na região 5′-UTR do gene

CLDN11

.

CLDN11

iniciadores espec�icos e sequências de sondas utilizadas foram: iniciador directo 5 ‘CGCGATTGGTCGGCGCGTTTC 3’; iniciador de sentido reverso 5 ‘GACGAAAACAACAACGCTACT 3’; TaqMan sonda 5’TCGGAGTCGCGGGGTTTAAAGAG 3 ‘. CpGenome Universal Methylated DNA (Chemicon International, Temecula, CA) serviu como um controlo positivo, e as diluições em série de que foram utilizados para traçar uma curva padrão. qMSP com sonda TaqMan foram realizadas num termociclador IQ5 (BioRad, Hercules, CA), utilizando o IQ Supermix (

ibid.

). Cinquenta ciclos de amplificação por PCR a partir de 50 ng de ADN genómico tratado com bissulfito foram realizadas em triplicado, de acordo com o protocolo do fabricante. Duplex PCR com sequências β-actina (ACTB) Iniciador e Sonda contendo CpG não foram realizados para normalização. As sequências dos iniciadores e das sondas utilizadas foram como publicado anteriormente [24]. valor metilação normalizada (NMV) foi definida da seguinte forma: NMV = (

CLDN11-S

/

CLDN11-FM

) /(

ACTB-S

/

ACTB -FM

) * 100, onde

CLDN11-S Comprar e

CLDN11-FM

representam

CLDN11

níveis de metilação na amostra e totalmente DNAs metilados, respectivamente, enquanto

ACTB-S Comprar e

ACTB-FM

correspondem a

β-actina

na amostra e DNAs totalmente metilados, respectivamente. Todo o genoma DNA amplificado (WGA) foi usado como um controle negativo não metilado.

quantitativa transcrição reversa-PCR Análise

O

CLDN11

amplicon RT-PCR foi projetado para se sobrepor uma fronteira intrão-exão, de modo a excluir ADN genómico (

g de ADN

) amplificação. As sequências dos iniciadores foram como publicado anteriormente [18]. Um passo de qRT-PCR foi realizada como descrito anteriormente [24], utilizando um kit de Quantitect Sybra RT-PCR (Qiagen, Valencia, CA), de acordo com o protocolo do fabricante.

CLDN11

expressão foi normalizado para

β

actina expressão. O ARN total a partir de células HFE145 foi utilizada para a curva padrão. (

CLDN11-S

/

CLDN11-C

) /(

ACTB-S

/

ACTB-C

), onde

CLDN11- S Comprar e

CLDN11-C

representam

CLDN11

níveis de expressão de mRNA na amostra de teste e controle mRNAs, respectivamente, enquanto

ACTB-S

e

ACTB -C

correspondem a

os níveis de expressão

beta-actina na amostra de teste e controle mRNAs, respectivamente.

5-aza-2′-desoxicitidina (5-Aza-dC) Tratamento

AGS é uma linha de células GC manifestando hipermetilação do

CLDN11

promotor em conjunto com

CLDN11

expressão ausente mRNA. 5-aza-2′-desoxicitidina (5-aza-dC) tratamento das células foi realizada como descrito anteriormente [24]. Em resumo, a linha de células de GC AGS (ATCC número de catálogo CRL-1739) foi semeada a uma densidade de 2 × 10

5 culas /ml num frasco T-75. Vinte e quatro horas mais tarde, as células foram tratadas com 1? M de 5-aza-dC durante 72 horas. Meios contendo 5-aza-dC foi substituído com meio recém-preparado em cada 24 horas. As células foram então colhidas para extracção de RNA total. Total de RNAs das células AGS antes e após tratamento com 5-aza-dC foram submetidas a análise em tempo real RT-PCR quantitativo.

Experimentos pequeno RNA de interferência Knockdown

CLDN11

Os oligos de ARNip espec�icos foram adquiridos da Ambion, Inc. (Austin, TX). A linha de células HFE145, que é

CLDN11

positivo, foi selecionado para estudar o efeito da claudina-11 knockdown na migração e invasão propriedades das células gástricas. As experiências foram realizadas como descrito anteriormente (Agarwal

et ai.

, 2005). As células cultivadas em placas de 6 poços foram transfectadas com o ARNic em cadeia dupla utilizando Lipofectamine 2000 (Invitrogen), seguindo as instruções do fabricante. Mock-transfecções e os ARNic em cadeia dupla não específicos foram utilizados como controlos negativos. As células foram tratadas durante 48 a 72 horas para permitir a máxima knockdown, após o que foram colhidas, quer por análise de Western blot, ou utilizadas para ensaios de migração e invasão.

Análise Western Blot de Claudina-11 em linhas de células gástricas

culturas de células confluentes foram lavadas com HBSS (Invitrogen) e os lisados ​​celulares totais foram feitas utilizando tampão de lise: 62,5 mmol /L de Tris-HCl (pH 6,8), glicerol a 10%, e 2% de SDS. A concentração de proteína foi determinada utilizando um kit de ensaio de ácido bicinconínico (BCA) (Pierce, Rockford, IL). Vinte microgramas de proteínas totais foram separadas por 10% a 20% de SDS-PAGE em géis de Tris-Glicina (Invitrogen) e transferidas para membranas de difluoreto de polivinilideno (Millipore Corp., Bedford, MA). As membranas foram bloqueadas com 5% de leite em pó magro, lavadas em tampão TBST, e sondadas com um anti-claudina-11 anticorpo (Zymed, San Francisco, CA). As manchas foram então lavadas e incubadas em anticorpo secundário conjugado com peroxidase de rábano (anti-IgG de coelho: 1:10,000; Amersham Pharmacia Biotech, Piscataway, NJ). Para a detecção, por quimioluminescência foi realizada utilizando um kit de quimioluminescência aumentada (Amersham Pharmacia Biotech).

Migração e invasão celular Ensaio

invasividade das células de siRNA-transfectadas foi determinada utilizando inserções câmara de invasão de Matrigel-revestidas (24-well-formato com poros de 8 ^ m, BD Biosciences) utilizando um ensaio de câmara de Boyden modificado [25]. As células foram cultivadas a cerca de 80% de confluência e durante a noite privadas de soro. No dia do ensaio, as células foram tripsinizadas e as contagens de células viáveis ​​tomadas. Aproximadamente 50000 células foram plaqueadas sobre a parte superior de cada de cada filtro em meio isento de soro. Um volume igual do mesmo meio contendo 20% de FCS foi colocado na câmara inferior (

i.

, O bem abaixo do filtro) para agir como um quimioatractor. As placas de ensaio foram incubadas a 37 ° C durante até 48 horas. As células que não migraram ou invadem através dos poros das inserções Transwell foram removidos manualmente com um cotonete. As células presentes na parte inferior da membrana foram fixadas em metanol frio durante 10 min e em seguida coradas com 0,01% de violeta cristal em 20% de etanol. Após 10 min de incubação, os filtros foram lavados em água e suspenso em 200 ul de ácido acético a 5% e 5% de metanol. leituras colorimétricas foram tomadas no OD

595. As experiências foram repetidas pelo menos três vezes, com triplicados em cada experiência. Para avaliar a migração de células, ensaios foram realizados essencialmente como acima, excepto que as células foram colocadas em cima de inserções não revestidos (Matrigel-free).

Análise Estatística

As análises estatísticas foram realizadas utilizando t de Student -test (SPSS, versão 16), com o

p

. 0,05 considerado estatisticamente significativo

resultados e Discussão

em primeiro lugar, testou a nossa hipótese de que o

CLDN11

promotor é hipermetilado e que esta hipermetilação correlaciona inversamente com a

CLDN11

expressão de mRNA em tecidos GC primários. Emparelhados tecidos normais e tumorais gástricas primários foram coletados no Hospital Johns Hopkins (JHH). As amostras foram obtidas imediatamente após a ressecção e snap-congelados até à sua utilização. Apenas os casos obtidos com o consentimento informado aprovado pelo Institutional Review Board (IRB) foram incluídos neste projecto. Os ADN genómicos foram obtidos a partir de 36 amostras clínicas, compreendendo 18 GC e 18 tecidos da mucosa gástrica emparelhados não cancerosos (NS).

CLDN11

níveis de metilação do promotor nestas amostras foram analisadas utilizando PCR em tempo real quantitativo específico-metilação (qMSP). A Figura 1A mostra o valor metilação normalizada (NMV),

i.

, A razão entre o valor metilado do

CLDN11 e região promotora em cada amostra a um DNA de controle totalmente metilado.

CLDN11

NM

Vs

foram significativamente maiores nas amostras de GC do que nos seus correspondentes tecidos NS (

P Art 0,001). Para avaliar se

CLDN11

hipermetilação do promotor em GCs foi associada com silenciamento de

CLDN11

expressão,

CLDN11

níveis de mRNA foram medidos usando quantitativo em tempo real (qRT-PCR) em RNAs extraídos a partir das 36 amostras utilizadas para a análise de metilação. Como demonstrado na Figura 1B, valores de expressão normalizados (NEVs) de

CLDN11

em amostras de GC foram significativamente menores do que em amostras NS emparelhados (

P Art 0,001). Estes dados estabelece que

CLDN11

hipermetilação do promotor correlaciona-se com

CLDN11

expressão do mRNA diminuída ou silenciados em GCs primário.

Esta figura ilustra a metilação do promotor e os níveis de expressão de mRNA de

CLDN11

no cancro gástrico emparelhado (GC) e os tecidos não cancerosos da mucosa gástrica (NS). A) quantitativa metilação específicas de PCR (qMSP) para

CLDN11

em tecidos primários. O ADN genómico extraído a partir de 18 GC e 18 NS tecidos combinados foram submetidos a análise qMSP usando amplicão MSP e sonda TaqMan concebido para incluir múltiplos locais de CpG da região 5′-UTR do gene da

CLDN11

. CpGenome Universal Methylated DNA (Chemicon International, Temecula, CA) foi utilizado como um controlo positivo totalmente metilado. Duplex PCR com sequências β-actina (ACTB) Iniciador e Sonda contendo CpG não foram realizados para normalização. valor metilação normalizada (NMV) foi definida da seguinte forma: NMV = (

CLDN11-S

/

CLDN11-FM

) /(

ACTB-S

/

ACTB -FM

) * 100, onde

CLDN11-S Comprar e

CLDN11-FM

representam

CLDN11

níveis de metilação na amostra e totalmente DNAs metilados, respectivamente, enquanto

ACTB-S Comprar e

ACTB-FM

correspondem a

β-actina

na amostra e DNAs totalmente metilados, respectivamente. Esta dispersão unidimensional demonstra significativamente alta

CLDN11

níveis de metilação do promotor nas amostras GC quando comparado com os modelos NS (

P Art

0.001

). Todo o genoma de ADN amplificado (WGA), utilizado como um controlo negativo não metilado não mostraram qualquer amplificação. O

P valor

foi calculada utilizando o teste t de Student pareado. B)

CLDN11

expressão de ARNm em tecidos gástricos. O ARN total extraído de 18 ns emparelhados e amostras de GC foram submetidos a

CLDN11

específica de RT-PCR.

CLDN11

expressão de mRNA foi normalizado para

β

actina expressão de mRNA em cada amostra. O

P valor

foi calculada utilizando o teste t de Student pareado. Este lote demonstra que os

CLDN11

níveis de expressão de mRNA foram significativamente menores para não detectáveis ​​nas amostras de GC, enquanto a maioria dos espécimes NS correspondentes tinha detectável

CLDN11

níveis de mRNA (

P Art

0.001

). C) 2D-trama de dispersão de metilação do promotor e os valores de expressão de ARNm em tecidos de GC.

CLDN11

silenciamento expressão do mRNA está associada a hipermetilação do promotor em pacientes GC. Esta dispersão bidimensional demonstra valores NEV (eixo Y) e os valores NMV (eixo X) nos 18 NS emparelhadas e amostras de GC.

Em seguida, avaliamos

CLDN11

metilação do promotor e a expressão em linhas de células gástricas. células imortalizadas humanas normais gástricas epiteliais (HFE145) e linhas celulares GC AGS, SIIA, MKN28, KATOIII e SNU-1 foram estudadas. Todas as linhas celulares testadas (GC AGS, SIIA, MKN28, KATOIII, e SNU-1) demonstraram a hipermetilação do promotor, enquanto que a metilação não foi observada em células imortalizadas HFE145 normais (Figura 2A).

CLDN11

níveis de ARNm foram avaliados por meio de qRT-PCR em ARN purificado a partir de linhas de células, enquanto claudina-11 expressão da proteína foi analisada por Western blotting. Tal como mostrado na Figura 2B, todas as linhas de cancro 5 exibiu nenhuma expressão detectável de

CLDN11

ARNm ou proteína, enquanto que as células que se manifesta HFE145 elevados

CLDN11

níveis de expressão. Essa descoberta estabelece que

CLDN11

é coordenadamente hipermetilado e reprimidos em GC linhas celulares em relação às células normais epiteliais gástricas (NGECs).

Esta figura ilustra a claudina-11 metilação do promotor, os níveis de expressão de mRNA e expressão de proteínas em linhas de células gástricas. A) quantitativa metilação específicas de PCR (qMSP) para

CLDN11

. ADNs genómicos isolados a partir de células imortalizadas humanas normais epiteliais gástricas (HFE145) e linhas de células de GC AGS, SIIA, MKN28, KATOIII, e SNU-1 obtidos a partir da ATCC foram analisados ​​por qMSP. Esta Figura ilustra que a região promotora de

gene CLDN11

é hipermetilado em todas as linhas celulares de GC em relação ao HFE145 células. B)

CLDN11

expressão de mRNA em linhas de células gástricas. Os ARNs totais de diferentes linhas de células gástricas foram submetidos a análise em tempo real quantitativa de RT-PCR. Como pode ser visto nesta figura, HFE145 células expressaram níveis muito elevados de

CLDN11

ARNm, enquanto que todas as cinco linhas celulares tumorais testadas tinha

CLDN11

expressão muito baixa ou indetectável ARNm. C) Análise de transferência de Western de claudina-11 de expressão em linhas de células gástricas. Os lisados ​​celulares totais obtidos a partir de várias linhas de células gástricas foram sondados com o anticorpo anti-claudina-11. Esta figura ilustra que enquanto a linha imortalizada de células epiteliais normais gástrica, HFE145, expresso abundante proteína claudina-11, não podia ser detectada em várias linhas celulares de GC. anticorpo anti-β-actina foi usado como um controle de carga.

Para validar ainda mais silenciamento de

expressão CLDN11

por hipermetilação, nós tratamos a linha de células GC AGS com o agente de desmetilação, -5-aza 2-desoxicitidina (5-aza-dC, 1 uM), durante intervalos de tempo variados. Total de RNAs extraídos antes

vs.

Após o tratamento foram submetidos a qRT-PCR para

CLDN11

. Como pode ser visto na Figura 3, em cada ponto de tempo,

CLDN11

mRNA ficou re-expressos aquando do tratamento com 5-aza-dC, confirmando que

CLDN11

é silenciado por hipermetilação do promotor em AGS células GC.

AGS é uma linha de células GC manifestando hipermetilação do

CLDN11

promotor em conjunto com

CLDN11

expressão de mRNA ausente. Estas células foram tratadas com 5-aza-dC, um agente de desmetilação global. O ARN total a partir de células AGS antes e após o tratamento com 5-aza-dC foram submetidos a quantitativo em tempo real A análise de RT-PCR para

CLDN11

expressão de ARNm. O

Y-eixo

representa a variação média vezes nos níveis de

CLDN11

expressão de ARNm após o tratamento com 5-aza-dC em vários pontos de tempo, quando comparado com as células não tratadas. células AGS, quando tratados com 5-aza-dC, exibiu um aumento dependente do tempo em

CLDN11

expressão de ARNm de até 72 horas de tratamento. Esta restauração da

expressão CLDN11

após 5-aza-dC tratamento suporta nossa hipótese de que claudin-11 é silenciado por hipermetilação do promotor em células GC.

Os membros da família de proteínas claudina têm sido implicado na regulação da adesão celular, invasão e migração de células cancerosas [25] – [27]. Portanto, o próximo investigou se

CLDN11

motilidade celular influências ou invasão. HFE145 células, que expressam abundante

CLDN11

, foram escolhidos para estudar os efeitos de

CLDN11

knockdown sobre as propriedades invasivas e migratórias de células epiteliais gástricas. transfecções siRNA transitórios foram realizados utilizando

CLDN11-

ARNic em cadeia dupla específicas. A transfecção com

CLDN11

espec�ico ARNic em cadeia dupla de forma eficiente reprimidos claudina-11 os níveis de proteína em 90%, enquanto que a expressão permaneceu inalterada em mock- ou células de controlo tratadas com siRNA (Figura 4A). Os ensaios de motilidade celular e invasão foram conduzidos em células transfectadas com ARNsi utilizando um sistema de ensaio Boyden modificada câmara-[25]. Curiosamente, tal como mostrado nas Figuras 4B e 4C, a inibição de

expressão CLDN11

em HFE145 células aumentou significativamente os potenciais migratórios e invasivos destas células, respectivamente.

HFE145 linha celular, que é claudin- 11 positiva foi selecionado para estudar o papel da claudina-11 knockdown na migração e invasão propriedades das células gástricas. As células foram transfectadas com

CLDN11

oligos siRNA específicos. transfecções Mock e ARNic em cadeia dupla não específicos foram utilizados como os controlos negativos. A) Análise de Western blot de siRNA mediada claudin-11 knock-down no HFE145 células. HFE145 células foram transfectadas com

CLDN11

– duplexes específicos e não-específicos ARNsi de controlo, tal como descrito em Materiais e Métodos. Após 48 a 72 horas, os lisados ​​celulares totais foram preparados e analisados ​​para a expressão claudina-11. A transfecção de oligos siRNA específico claudina-resultou em 90% de redução na expressão da proteína, enquanto que os níveis de proteína claudina nas células de controlo não foram significativamente alterados. B) ensaio de invasão de células de câmara de Boyden. A capacidade de invasão das células transfectadas com ARNsi foram determinados utilizando câmara de Matrigel invasão revestido, utilizando um ensaio de câmara de Boyden modificado. As experiências foram repetidas pelo menos três vezes, com triplicados em cada experiência. Os dados aqui representados é a variação média vezes na invasão das células transfectadas com ARNsi, quando comparado com as transfecções simuladas. Como é demonstrado nesta figura, siRNA knockdown da claudina-11 conduz a um aumento na invasão de células de HFE145 células. C) ensaio de migração celular duas câmaras. Os efeitos da claudina-11 knockdown sobre a migração das células HFE145 foram comparadas por medição do número de células que migram através dos filtros não revestidos (em vez de filtros revestidas com matrigel). As barras nesta figura representam a mudança de dobragem significativo na migração de células transfectadas com ARNsi em comparação com as células de controlo transfectadas por simulação. Como pode ser visto nesta figura, uma redução da claudina-11 os níveis de proteína está associada com o aumento da motilidade das células.

O presente estudo confirma por conseguinte a hipótese de que

CLDN11

, uma proteína de junção apertado, é silenciada no GC via hipermetilação do promotor, e esses dados suportam o envolvimento de

CLDN11

no controle da invasão de células GC e migração.

hipermetilação promotor é conhecido por estar associado com o silenciamento transcricional de determinados genes. metilação de ADN pode interferir com a ligação de factores de transcrição cuja locais de ligação contêm dinucleótidos CpG. Usando o programa de software TFSEARCH, que examinou o

CLDN11

sequência encontrada a ser hipermetilado em tecidos com câncer gástrico e linhas celulares,

ou seja

., O amplicon qMSP (-104 a quatro bases em relação ao o local de início da transcrição para o

CLDN11

). Essa verificação identificados sítios de ligação putativos para o SP1 e GATA-1 e GATA-2. Estudos anteriores demonstraram que a hipermetilação do DNA promotor contribui para silenciamento de

CLDN3

e

CLDN4

em linhas celulares de ovário, em parte

via

perturbação induzida por metilação de ligação de Sp1 ao seu local de ligação cognato (22, 23). Além disso, os membros da família GATA foram mostrados para ser reguladores positivos da

CLDN11

transcrição [28]. Mais estudos são agora necessários para avaliar se hipermetilação desses sites interfere com a ligação de fatores de transcrição, e como tal perturbação pode influenciar

CLDN11

transcrição do gene.

As células tumorais normalmente exibem deficiências estruturais e funcionais na sua TJs [17]. Estas deficiências são associados com uma perda de polaridade e diferenciação. Outra ligação importante entre TJs e cancro é uma perda de integridade de TJ, com consequente fuga ou o transporte de substâncias pró-tumorigénicas (tais como factores de crescimento ou nutrientes) no desenvolvimento de primórdios de células tumorais, promovendo o crescimento de tumores [29]. Além disso, a perda de polaridade, diferenciação, e propriedades adesivas associadas com a função prejudicada em TJ câncer pode ser crítica na aquisição de um fenótipo metastático [30]. Os estudos sugerem que as alterações nas proteínas TJ-associados podem representar a transição epitelial-mesenquimal (EMT), mudando assim a invasividade e motilidade das células cancerosas.

modulações na expressão de proteínas TJ-associados, particularmente proteínas, têm claudina foi demonstrado em vários cancros. Estudos recentes realizados por nós e outros demonstraram alterações na regulação da proteína claudina em vários cancros epiteliais [18]. Os membros da família de genes claudina são expressas de maneira altamente específica do tecido, bem como uma fase muito específicas do desenvolvimento,. Além disso, dependendo do tipo de cancro, a expressão de proteínas claudina pode ser regulada positivamente ou regulados negativamente em células cancerosas. Por exemplo, várias proteínas claudina são regulados positivamente em cancros do cólon, ovário, pâncreas e próstata, enquanto alguns são reprimidos no câncer de mama e câncer de cabeça e pescoço [16], [18]

Estudos têm relatado anteriormente mudanças na expressão perfis de membros da família claudina para ser associado com GC. Análise serial da expressão gênica (SAGE) identificou o

CLDN18

gene como reprimidos em GCs que possuem um fenótipo intestinal [31]. O

gene CLDN23

também é regulada negativamente em GCs do tipo intestinal [32]. Por outro lado, Cunningham

et ai. Relataram

CLDN4

expressão seja aumentada em metaplasia intestinal e displasia epitelial gástrica, identificar este gene como marcador de lesões precursoras GC [33]. No presente estudo, encontramos

CLDN11

expressão a ser reprimidos ou silenciados em GC

via

hipermetilação da sua região promotora. Além disso, verificou-se que, ao contrário

CLDN18

e

CLDN23

,

CLDN11

expressão foi regulada negativamente em amostras GC paciente, bem como em linhas de células, independentemente da difusa

vs .

subtipo intestinal.

Claudina-11, também conhecido como proteína específica-oligodendrócitos, foi identificado pela primeira vez para ser expresso especificamente na junção dos fios apertados de oligodendrócitos no cérebro e nas células de Sertoli de ratos e ratinhos [ ,,,0],34], [35]. A perda da expressão claudina-11, levando a quebra da barreira TJ, está associada a défices neurológicos e reprodutivos [36]. Um estudo recente relatou sobre-expressão e mislocalization de

CLDN11

da barreira hemato-testicular em células de Sertoli para ser associado a neoplasia intra-epitelial testiculares em homens [37]. Os dados do estudo estabelece que

CLDN11

é expresso em tecidos gástricos normais e imortalizadas NGECs. No entanto, as suas funções completas no estômago normal, assim como na carcinogénese gástrica permanecem obscuros.

Em uma tentativa de explorar o possível envolvimento de

CLDN11

no GC, estudamos alterações fenotípicas associados com silenciamento de

expressão CLDN11

em

CLDN11-

expressando células epiteliais gástricas (HFE145). knockdown muito interessante, siRNA mediada por

CLDN11

resultou em aumento da motilidade celular e invasão.

Estudos anteriores relataram alterações fenotípicas específicas do cancro a ser associados com modulações na expressão claudin em vários tipos de câncer . Superexpressão de claudina-3 e claudina-4 proteínas em linhas celulares de cancro do ovário resultados no aumento da invasão por essas células [25].