Abstract

Meduloblastoma (MB) é o tumor cerebral pediátrico maligno mais comum. Embora as vias que estão desregulados em MB ainda não foram totalmente caracterizados, amplificação e /ou a sobre-expressão do

MYCN

gene, que é tem um papel crítico no desenvolvimento do cerebelo como um regulador de destino da célula progenitora neuronal, tem sido identificada em vários subgrupos MB. Fenotipicamente, expressão aberrante de MYCN está associada com o /MB variante anaplásico de células grandes, que é responsável por 5-15% dos casos e está associada com doença agressiva e o resultado clínico pobre. Para melhor compreender o papel da MYCN em MB

in vitro

e

in vivo

e para auxiliar o desenvolvimento de terapias alvo-MYCN que estabelecemos linhas celulares derivadas de tumores neurosphere do GTML (

GLT1-tTA /TRE-MYCN-Luc

) modelo de camundongo geneticamente modificado. Uma fracção de neuroesferas foram GTML verificou-se ser o factor de crescimento independente, expressa CD133 (um marcador de células estaminais neurais), não se diferenciou em cima MYCN retirada e foram altamente tumorigénicas quando ortotopicamente implantado no cerebelo. componente principal análises utilizando dados de ensaio de RNA única célula sugeriu que o candidato clínica aurora-A inibidor da quinase MLN8237 converte neurospheres GTML para assemelhar-se expressores não MYCN. Correlacionando-se com esta, MLN8237 alargado significativamente a sobrevivência de ratinhos portadores de aloenxertos GTML MB. Em resumo, os nossos resultados demonstram que MYCN desempenha um papel crítico na expansão e sobrevivência das células agressivas-propagação MB, e estabelecer neurospheres GTML como um recurso importante para o desenvolvimento de novas estratégias terapêuticas

Citation:. Ahmad Z, Jasnos G, Gil V, G Howell, Hallsworth A, K Petrie, et al. (2015) Molecular e

In Vivo

caracterização de células-propagação do cancro derivadas de meduloblastoma MYCN-dependente. PLoS ONE 10 (3): e0119834. doi: 10.1371 /journal.pone.0119834

Editor do Academic: Javier S. Castresana, da Universidade de Navarra, Espanha

Recebido: 11 de julho de 2014; Aceito: 16 de janeiro de 2015; Publicação: 18 de março de 2015

Direitos de autor: © 2015 Ahmad et al. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Licença Creative Commons Attribution, que permite uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o autor original ea fonte sejam creditados

Disponibilidade de dados: Todos os dados relevantes estão dentro do papel e seus arquivos de suporte de informação

Financiamento:. Este trabalho foi apoiado por fundos do Instituto de Pesquisa do Câncer, Instituto americano para Pesquisa do Câncer (11-0301), Cancer Research Reino Unido (C34648 /A12054 ) e do tumor cerebral Charity (SDBTT 6/88). Os financiadores não tiveram nenhum papel no desenho do estudo, coleta de dados e análise, decisão de publicar ou preparação do manuscrito

CONFLITO DE INTERESSES:.. Os autores declararam que não existem interesses conflitantes

Introdução

em crianças, meduloblastoma (MB) é o originário mais frequente tumor neuroectodérmico primitivo (PNET) no cérebro e tem sido classificada em quatro subtipos principais com base no número de cópias de variação e transcrição perfis: MB

WNT , MB

SHH (sonic hedgehog), MB

Group3 e MB

Group4 [1,2]. Apesar dos avanços feitos na classificação molecular MB, na maioria dos MB pediátrica (com exceção de SHH aberrante e caminhos WNT) vias de sinalização oncogênicos que são terapeuticamente targetable ainda precisam ser identificados. A pesquisa recente tem, no entanto, demonstrado que a amplificação albergando MB MYCN e /ou a sobre-expressão pode também ser orientada [3]. Amplificação dos

gene MYCN

está associada a um mau prognóstico [4,5], é observada em MB

SHH, MB

Group3 e MB

subtipos Group4 [6-10] e é expresso de forma aberrante, na maioria dos MB humanos [11]. Apesar da importância crescente de MYCN como um alvo terapêutico em MB, no entanto, ainda temos uma má compreensão de como aberrante

MYCN

expressão transforma células-tronco /progenitoras neurais para tumores. Nós relatado anteriormente um modelo de camundongo geneticamente modificado (GEMM) da-driven MYCN MB (GTML:

G

lt1-tTA /Tablet

T

RE

M

YCN-

L

uc

) em que a expressão MYCN é controlada por doxiciclina (DOX) (Tet-off). Usando este sistema, mostramos que a expressão focalizada dos MYCN induz tanto patologia independente anaplásico de células clássico e grande (LCA) do SHH [11]. classificação subgrupo com base em perfis de expressão genética derivados de amostras de meduloblastoma humanos em comparação com camundongos transgênicos sugeriu que GTML e GTML /Trp53

ratos KI /KI exibido expressão perfis característicos de MB humana

Group3 [3]. linhas neurosphere estabelecidas a partir de ratos GTML proliferam de forma robusta, expressam marcadores neuronais e formar tumores quando ortotopicamente implantados nos cérebros de ratos [12]. Estes resultados sugerem que as culturas GTML neuroesferas contêm células-propagação de tumores, tornando este um sistema potencialmente útil com o qual o papel transformador da MYCN em MB génese poderia ser elucidado.

Neste contexto, realizamos uma série de molecular e citológicas estudos para caracterizar culturas de neuroesferas estabelecidas a partir de ratinhos GTML. A análise revelou uma única célula a expansão de uma população de células homogéneas é dependente da expressão de MYCN para a sobrevivência. Estes esferóides são resistentes à diferenciação, e têm características característico das células estaminais e progenitoras neurais parcialmente-comprometidos com expressão MYCN, incluindo a regulação positiva de nestina, CD133, OTX2, e Musashi, expressão dos quais estão associados com a manutenção de um estado indiferenciado, e típico de MB-tronco /progenitoras. implantação do cerebelo GTML neuroesferas subpopulações mostrou que propagando-potencial residia em CD133 +, mas não as células CD15- CD15 + ou tumor. Além disso, o tratamento de tumores com MLN8237, uma aurora-A inibidor da quinase que induz MYCN degradação oncoproteínas [13], efetivamente estendeu a taxa de sobrevivência de ratos GTML com MB agressivos. Estes resultados esclarecer o papel do MYCN na transformação celular e progressão da MB, reforçando a hipótese de que MYCN impulsiona a expansão e enriquecimento de células-propagação de tumores CD133 + capaz de gerar MB agressivo.

Materiais e Métodos

mouse criação

O modelo de rato GTML foi descrito anteriormente [11]. Todos os procedimentos de rato foram aprovados pelo Comitê de Ética Instituto de Pesquisa do Câncer de seguir diretrizes UK Home Office (Projeto Número de licença: 70/7945). Todos cirurgia foi realizada sob anestesia isoflurothane, e todos os esforços foram feitos para minimizar o sofrimento.

isolamento Neurosphere e da cultura

O tecido foi isolado a partir de tumores GTML ou P5 pós-natal, P8, cerebelo P21 e mesencéfalo e transferidos em HBSS frio (Invitrogen). Os tecidos foram então cortados em 2-3 mm

2 pedaços e dissociados enzimaticamente a 37 ° C utilizando Liberase Blendzyme 1 (0,62 unidades Wunsch /ml, Roche) em PBS durante 15-45 min. A reacção enzimática foi parada usando volume de 10% de Soro Fetal de Vitela (FCS, PAA) antes de as células foram trituradas em meio DMEM /F12 contendo B27 e filtrada através de uma malha de 70μm. Subsequentemente, as células foram cultivadas em meio DMEM /F12 (Invitrogen) suplementado com 2% de suplemento B27 (Invitrogen), 20 ng /ml de factor de crescimento epidérmico (EGF, Sigma), /ml de factor de crescimento de fibroblastos a 20 ng (bFGF-básico, Invitrogen) e 100 unidades /ml de penicilina /estreptomicina.

Para examinar as taxas de divisão celular, neurospheres foram dissociadas por pipetagem, e as células coradas com azul de tripano foram contadas utilizando um hemocitómetro. Alternativamente, as células foram contadas utilizando o instrumento goiaba APC-96 após coloração com reagente de goiaba ViaCount Flex (1:50, Millipore), de acordo com o protocolo do fabricante.

Para a avaliação do potencial de diferenciação, as células foram plaqueadas em lamelas revestidas por poli-D-lisina (0,1 M, Sigma), 0,1% de gelatina ou laminina (0,5? g-2.0μg /ml, Invitrogen) e cultivadas sob condições de diferenciação por até 14 dias. meio de diferenciação é composta de meio DMEM /F12 suplementado com 10% de FCS, B27, com ou sem 1 ^ g /ml de ácido retinóico (Sigma Aldrich). Nós também banhado células GTML recém-ordenados na presença de 0.5-1.0mg /ml de colágeno (Invitrogen; A1048301). Na mídia Neurobasal pró-diferenciação com soro

implante ortotópico

Para examinar o potencial tumorigénico, células directamente obtido a partir de tumores primários, esferas GTML, ou os seus derivados foram ressuspensas em meios de neuroesferas e injectado no cerebelo de FVB ratinhos /N do sexo feminino: seguintes números de células foram implantadas: tumores primários (25 ou 100 células /área ), as células M10519 (passagens 10-27, 25 a 10.000 células /site) ou células recém-ordenados (10 células /local).

Ratos com idade de 6-8 semanas foram anestesiados com inalação de isoflurothane anestésico. Uma incisão (1cm

2) foi feito na linha média do couro cabeludo através do cerebelo, e um pequeno orifício com um diâmetro de um milímetro foi feita no crânio usando uma broca dentária, numa posição um milímetro lateral, a partir da linha média e entre 1 e 2 mm posterior à sutura lambdoidal evitar quaisquer vasos sanguíneos visíveis. As células foram injectadas a uma profundidade de 2 mm, utilizando uma seringa Hamilton de 10 ul numa armação estereotáxica. A agulha foi deixada no local durante mais 2 minutos, para evitar o refluxo. A agulha foi removido com cuidado para evitar a retirada células tumorais. O crânio foi então selada com cola cirúrgica. Após a progressão do tumor foi monitorizado o implante semanalmente usando o sistema Imagem IVIS bruta (Caliper Life Sciences) de acordo com as instruções do fabricante. imagiologia de luciferase foi realizado como descrito anteriormente [11] excepto que o sal de potássio de D-luciferina (Perkin Elmer) em PBS foi utilizado a 15 mg /kg.

doxiciclina tratamento foi realizado como descrito no nosso trabalho anterior [11] . Resumidamente, os ratinhos com tumores progrediu medido com um sinal de 1×10

9 fotões /s foram alimentados com ração (TestDiet) contendo doxiciclina a 200 mg /kg para proporcionar uma dose diária de cerca de 32 mg /kg. carga tumoral foi determinada por bioluminescência.

A imuno-histoquímica e imunocitoquímica

Para neurospheres imunocitoquímica foram incluídos em outubro de montagem de mídia (BDH) e lentamente congelados usando isopropanol resfriado em nitrogênio líquido. Então criocortes 4μm de espessura foram montadas em lâminas revestidas de poli-lisina (VWR) e fixadas com paraformaldeído a 4% (PFA, Sigma) em PBS durante 10 minutos. Após lavagens subsequentes com TBS, as secções foram então bloqueadas com albumina de soro bovino a 10% (BSA, Sigma), 15 mM de glicina (Sigma) e 0,02% de Triton X100 (Sigma) em TBS durante 1 hora à temperatura ambiente. Para secções de anticorpos de ratinho foram bloqueados utilizando o kit de MOM bloqueio (Vector Laboratories) de acordo com as instruções do fabricante. As secções foram incubadas com o anticorpo primário durante a noite em solução (0,1% de BSA-PBS) à temperatura ambiente e após lavagens subsequentes com lâminas de TBS foram marcadas com anticorpos secundários conjugados com Alexa Fluor (1: 500, Molecular Probes) de bloqueio. As lâminas foram contrastadas com DAPI (Sigma) e, em seguida, foram montadas com Fluoromount G (Southern Biotech).

para imuno-histoquímica, amostras de tumores foram fixadas em paraformaldeído a 4% em PBS durante 24 horas a 7 dias. As amostras foram descalcificadas com EDTA 0,3 M e depois processados ​​usando o processador de tecidos Leica ASP300 S para criar um bloco de cera de parafina. As secções foram cortadas a 4μM para hematoxilina e eosina e imuno-histoquímica foi realizada como previamente descrito [14]

Os anticorpos usados ​​para imuno-histoquímica e imunocitoquímica foram:. MYCN (OP-13, Calbiochem), Ki67 (556003, BD Pharmingen ), GFAP (Z0334, DAKO), CD15 (332.778, BD Bioscience), TuJ1 (BAM1195, R . D), caspase 3 (9664, Cell Signaling)

análise Immunoblot

as neuroesferas foram cultivadas sob condições normais e diferenciação na presença ou ausência de 1 ug /ml de doxiciclina. As esferas foram recolhidas, e, em seguida, suspenso em tampão de lise celular (Cell Signaling Technology), de acordo com o protocolo do fabricante. A análise de imunotransferência foi realizada como descrito [14]. foram usadas seguintes anticorpos: MYCN (OP-13, Calbiochem), c-myc (SC-40, Santa Cruz), nestina (ab5968, Abcam), beta-actina (4967, Cell Signaling Technology) e GAPDH (2118, Cell Signaling tecnologia).

a citometria de fluxo e de células activadas por fluorescência

Para a análise do ciclo celular, esferas GTML foram tratados com 1 ug /ml de doxiciclina e as amostras foram retiradas a 0, 2, 4, 6, 8, 24, e 48 horas. As amostras foram fixadas usando etanol a 70% arrefecido com gelo, e em seguida foram armazenados a 4 ° C durante pelo menos 30 min. Em seguida, as células foram coradas com iodeto de propídio (PI) (40 � /ml, Invitrogen) a 37 ° C durante 30 min, e em seguida foram armazenados a 4 ° C durante 24 horas. perfis do ciclo celular foram analisadas utilizando um analisador de células activadas por fluorescência Becton Dickinson LSR II.

Para isolar o CD15 + e CD15- ou populações CD133 + e CD133-, neuroesferas M10519 GTML foram dissociadas em células isoladas, e, em seguida, foram corados com anti-CD15 conjugado com FITC (1: 100, Millipore) ou anti-CD133 conjugado com PE (1: 100, Miltenyi Biotec) durante 30 min em gelo, lavados com PBS contendo 0,3% de albumina de soro bovino com antibióticos. As células foram então contrastadas com 0,5? G /mL de DAPI em PBS e classificadas através de um Becton Dickinson FACS Aria. As células foram classificados em meio DMEM /F12 contendo fatores de crescimento e B27. A pureza de cada população foi avaliado no final de cada tipo, usando o mesmo analisador.

Purificação de células CD133 +/-

usando esferas magnéticas

neuroesferas M10519 GTML foram dissociadas em células individuais, usando o Neurosphere kit de dissociação P (Miltenyi Biotec), seguindo as instruções do fabricante. Após a dissociação, as células foram centrifugadas a 500xg durante 10 min e, em seguida, sedimento foi ressuspenso em 1 ml de PBS suplementado com FBS a 2% e EDTA 1 mM (tampão de triagem). Isolamento de CD133 + e populações CD133- foi inicialmente realizada através de separação magnética (EasySep, StemCell Technologies), seguida por um passo final de purificação utilizando o FACS ARIA (BD Biosciences). A suspensão de células (0,5 ml, 2×10

7 células) foi incubado com 50 ul de anticorpo anti-CD133 (Prominin-1) conjugado com PE (Miltenyi Biotec) ou anti-IgG

1 conjugado com PE (Miltenyi Biotec) durante 10 min a 4 ° C. As células foram então lavadas com triagem de tampão e incubou-se com 100 ul de coquetel de selecção de PE (kit de selecção EasySep PE, StemCell Technologies) por 1 mL de triagem tampão durante 15 min à temperatura ambiente após a adição de nanopartículas EasySep 50 ul por 1 ml de suspensão de células antes da magnético separação. Para melhorar a pureza, o processo de separação magnética foi repetido total de três vezes. A pureza das fracções talão-encadernados ou -unbound foi avaliada usando o analisador LSRII FACS (BD Biosciences). Ambas as fracções CD133 + e CD133- foram ainda purificados a partir de fracções ligadas a esferas e não-ligada, respectivamente, utilizando o FACS ARIA (BD Biosciences). 7AAD (Beckman Coulter) foi utilizado para excluir as células mortas nas análises FACS. As células vivas foram contadas com coloração com azul de tripano antes da implantação ortotópica (10 células por sítio).

análise de diluição limitada

As células M10519 (100, 10, e uma célula (s) por 100 ul de meios Neurobasal na presença de factores de crescimento) foram plaqueadas numa placa de 96 poços para cultura prolongada. As células foram monitorados duas vezes por semana para avaliar a formação de esferas, e, em seguida, a estimativa final foi feita aproximadamente 4 semanas após a sementeira.

Primers para ensaios de célula única

Para este estudo, foram originalmente concebidas 48 primers para (i) fatores que são expressos em três subtipos distintos MB [5,15-17], (ii) marcadores de células-tronco neurais conhecidos, (iii) marcadores de câncer conhecido e (iv) alvos MYCN. Nós examinamos esses juntos com 93 iniciadores foram utilizados para células-tronco embrionárias em nossos estudos anteriores [18,19] para validação primário usando cDNA de GTML e mouse células estaminais embrionárias. Fora de 141 primers, foram selecionados 96 primers que passaram a validação primer, o processo de que foi descrito anteriormente [18].

Célula de classificação para ensaios de células individuais

A precisão do processo de classificação foi determinada como se segue. Em primeiro lugar, 2×10

5 células foram coradas utilizando diacetato de carboxifluoresceína 0.4μl N-succinimidil éster (CFSE) corante fluorescente (Sigma Aldrich), e as células individuais foram seleccionadas utilizando um seleccionador de células Becton Dickinson em slides AG480F (Beckman Coulter). Em seguida, a presença de células marcadas foram inspeccionadas sob um microscópio fluorescente CKX41 (Olympus) para confirmar que apenas uma célula foi manchado em um local de reacção da corrediça. Se duas células foram encontradas em um único local de reacção, de calibração da máquina de classificação foi reiniciado a partir do início. Uma vez que a triagem precisão foi confirmada, células de amostra foram marcadas com iodeto de propídio, classificados em tubos de PCR, e depois congeladas. As células foram então descongeladas em gelo para interromper as membranas celulares.

Inverter a amplificação de transcrição e de destino específico

O detalhe experimental é descrito em nosso estudo anterior [18]. Resumidamente, a transcrição reversa e amplificação de cDNA, foram conduzidos como se segue. A reacção foi incubada a 50 ° C durante 15 minutos, 95 ° C durante 2 minutos, seguido por 18 ciclos de 95 ° C durante 15 segundo e 60 ° C durante 4 minutos. iniciadores não incorporados foram subsequentemente removido por tratamento com exonuclease I (Exo I, NEB). A mistura de reacção contém 10 jil de cDNA amplificado, 0.4μl de tampão 10 x Exo I, 0.8μl Exo I enzima (20 U /ul), e 2.8μl de água grau de RT-PCR. A reacção foi realizada a 37 ° C durante 30 min, depois a 80 ° C durante 15 minutos para inactivar de Exo I. Finalmente, Tampão de Suspensão de ADN (36μl) foi adicionado a cada amostra (50 ul total).

Análises usando o sistema de BioMark

os detalhes experimentais são descritos em nossos trabalhos anteriores [19] [18], a não ser que usamos 96×96 Gene Expression placas IFC array (Fluidigm Corporation) neste estudo. Amostra e misturas de iniciadores foram carregados separadamente para entradas situadas em ambos os lados da matriz. A mistura de reacção BioMark qPCR era composto de 2.5μl de Gene Expression 2xTaqMan Mistura de PCR (Applied Biosystems), 0.25μl de ADN 20x ligação de corante de amostra carregar Reagente (Fluidigm Corporation), 0.25μl de 20x EvaGreen corante de ADN de ligação (Biotium) e 2 ul de exo I-tratada amostra de ADNc. A mistura de reacção foi composto iniciador de 2.5μl de 2xAssay carregar Reagente, 1.25μl de Tampão de Suspensão de ADN, e 1.25μl de um par de iniciadores 20 �. carregamento da amostra foi feita de acordo com o manual de instruções do sistema BioMark.

A validação de dados

Para avaliar a formação de produtos de amplificação não específicos devido à Primer-dímero formação ou não-específica de recozimento, que realizamos fusão curva de análises para cada um dos iniciadores, como descrito anteriormente [18].

a análise estatística

Cq valores maiores do que o limite para os valores Cq confiáveis ​​(CQ

limite, S1 Table) foram omitidos das análises estatísticas, tal como descrito [18]. Análise de componentes principais e análise de agrupamento hierárquico (método de Ward) foram realizados utilizando R. Deve-se notar que, para análises de agrupamento e análise de componentes principais, CQ valores superiores a Cq

limiar foram tratados como valores não confiáveis, e assim foram todos substituídos por CQ

limite + 1d. O teste de Kolmogorov-Smirnov foram utilizados para avaliar as diferenças de distribuição do coeficiente de correlação de conjuntos de dados provenientes de dois conjuntos de amostras, devido à presença de assimetria da distribuição desigual e número de observações entre os dois grupos em comparação, os quais não eram adequados para a realização testes mais fortes. O teste Log-rank foi utilizado para avaliar a diferença das distribuições de sobrevivência dos dois grupos de amostras.

Resultados

Criação de linhas de neuroesferas GTML

Neste estudo teve como objetivo identificar as células-propagação de tumores no MB, e estabelecer um sistema de estudo pré-clínico eficiente para examinar o potencial de pequenas moléculas para prevenir o desenvolvimento do tumor. Utilizamos o

GLT1-tTA /TRE-MYCN luciferase

(GTML) modelo de rato transgénico, em que a supressão da MYCN humana e luciferase é possível em uma forma dependente da dox no tecido cerebral [11,12] ( S1 Fig.). Neste sistema, o desenvolvimento de tumores pode ser prevenida por DOX, e a progressão do tumor é visível utilizando

in vivo

imagiologia bioluminescente (S1 Fig.); tanto a carga tumoral e

in vitro

crescimento celular é linearmente correlacionada com a intensidade do sinal da luciferase (S1 Fig.) [11].

tecidos primários foram cirurgicamente isolada a partir de tumores de crescimento monitoradas por imagem luciferase semanal ( A Fig. 1A e Fig S1.). Os tumores excisados ​​foram dissociadas e cultivadas em meio Neurobasal sem soro contendo EGF e bFGF [20], e neuroesferas estabelecidos dentro de 3-7 dias (Fig. 1A), em contraste com explantes de mesencéfalo ou cerebelo de ratinhos de tipo selvagem (que tinha um tempo de vida limitado de 7-10 passagens). As células estabelecidas a partir de pelo menos 6 tumores primários diferentes em várias idades eram imortais e exibiu um tempo de duplicação de aproximadamente 24 horas. (Tabela S2 e S1 Fig.). Tomados em conjunto estes dados sugerem a existência de uma célula altamente proliferativo, transformado provavelmente conduzido pela expressão do transgene MYCN.

(a) estabelecimento esferas GTML em cultura. As células primárias foram isoladas a partir de tumores GTML, que foram identificados através dos sinais de bioluminescência (superior esquerdo) e morfologia, e foram, então, dissociadas em células individuais. M10519 GTML neuroesferas cultivadas após 10 dias também estão apresentados. Barra de escala: 100 um. (B) Efeito da retirada MYCN sobre o crescimento celular. esferas M10519 GTML foram semeadas a uma densidade de 1×10

5 células /mL na presença ou ausência de 1 ug /ml de DOX, e a proliferação de esferas foram medidas pelo ensaio de WST-1 metabólica. As barras de erro, ± SD. (C) Efeito de retirada MYCN no ciclo celular. M10519 GTML neurosphere foram tratados com dox antes do ciclo celular análises usando FACS. analisa (D) ocidental. esferas M10519 GTML foram cultivadas com 1 ug /ml de dox.

Para examinar o papel do MYCN no crescimento de células GTML, nós tratados neurospheres M10519 GTML (bem como linhas celulares adicionais, consulte S2 Fig .) com dox, e encontrou provas claras de que o crescimento é dependente MYCN (Fig. 1B). ciclo celular análises utilizando citometria de fluxo mostrou clara acumulação de células com restrição de crescimento na fase G1, dentro de 4 a 6 horas de tratamento (Fig. 1C), restrição de crescimento coincidiu com a supressão completa de MYCN, mas não proteína c-Myc (S1 Fig . S3 e Fig.), níveis reduzidos de Ki67, um marcador de proliferação e nestina, uma estaminais neuronais e /ou um marcador de células progenitoras, às 48 horas após a retirada da MYCN (Fig. 1D e S1 Fig.). Curiosamente, em contraste com as nossas linhas GTML previamente estabelecidos com tipo selvagem

Trp53

[12], as células GTML presos expandiu rapidamente após a remoção do dox (S1 Fig.), Sugerindo que a retirada MYCN é citostático em uma fração estas células e a paragem do crescimento que é reversível. A inconsistência entre as células GTML utilizados nos dois estudos pode ser devida, pelo menos em parte, ao facto de que todas as células GTML estabelecidos no presente estudo abrigar mutações espontâneas na região do

Trp53

gene que codifica o domínio de ligação a ADN de p53 [3]. Empreendemos análise para determinar se a regulação positiva de compensação de proteína c-Myc de ratinho está envolvido na libertação de paragem do ciclo celular e descobriram que os níveis de c-myc foram constante (S1 Fig. E S3 Fig.), O que sugere que, pelo menos, nas nossas culturas de neuroesferas , c-Myc não compensar a redução de MYCN (como relatado anteriormente para ocorrer em progenitores neurais [21]). potenciais de células clonogénicas M10519, um de linhas GTML, foram examinadas por meio de ensaios de esfera secundários, mostrando que 42% das células M10519 individuais foram capazes de formar esferas em cultura (Fig S4).

MYCN expressão dirige a expansão de células expressando marcadores típicos de células-tronco neurais e /ou células progenitoras e MB

Para caracterizar neurospheres GTML, examinamos a expressão de marcadores de células tronco /progenitoras neurais por imunocitoquímica. Descobrimos que Nestina, um marcador para as células estaminais /progenitoras neurais, e o marcador de proliferação Ki67 foram expressos em neuroesferas GTML em uma maneira dependente da MYCN (Fig. 2A). A expressão de um marcador de células progenitoras específicas de neurónios TuJ1 [22] não foi no entanto visivelmente alterada por retirada MYCN (Fig. 2A), o que implica que a depleção de MYCN não afecta drasticamente o grau de diferenciação na cultura. Em contraste com a nossa observação anterior em tecidos GTML [11], sem diminuição importante da caspase 3, um marcador de apoptose, foi observada após a retirada MYCN (Fig. 2A e Fig S3.). Para obter uma imagem mais detalhada da expressão do gene ao nível da célula única, analisamos uma linha M10519 (encontramos linhas GTML que estabelecemos neste estudo foram notavelmente semelhantes) usando uma única célula de 96 plexed qRT-PCR (S5 Fig. E S6 Fig .). Esta análise indicou que os marcadores comuns para MB e células-tronco neurais, incluindo NeuroD1 [23], CD133 (Prominin 1) [24-27], OTX2 [11,28], e Musashi [29] foram reprimidos pela retirada MYCN (Fig. 2B e S5 Fig.). A frequência de células que expressam marcadores, incluindo CD133 e Musashi também foi diminuída em DOX, enquanto outros marcadores de células estaminais, incluindo Sox2 não foi afectada pela retirada MYCN (Fig. 2C e Fig S5.). Expressão de marcadores para astrócitos e células ependimárias (GFAP) [30], astrócitos (S100B) [31], progenitores grânulo neurônio e glioma (Olig2) [32-34] foram mal detectável (S5 Fig.) Ou raramente observada (S5 Fig .) em análises de célula única. Correlacionando-se com o rápido crescimento da cultura, expressão MYCN-regulada master reguladores para a progressão do ciclo celular, E2F1 e E2F2, sendo que ambos são alvos MYCN [35] (S5 Fig.). CD133, um marcador para S, G2 e M fases de células estaminais neurais [36] (Fig. 2B e 2C). MYCN, como esperado, foi apenas detectável em células M10519 tratados com DOX (Fig. 2B e 2C). Tomados em conjunto, estes resultados sugerem que a expressão MYCN resulta na expansão de células com marcadores típicos de células estaminais neurais e /ou progenitoras associadas com MB tumorigénese.

(A) M10519 GTML esferas foram tratadas com ou sem DOX para 17 dias. Análise por imunofluorescência foi realizada em esferas criosseccionada com anti-Ki67, anti-nestina, ou anti-TUJ1, anti-GFAP e anti-c-caspase 3 em conjunto com anti-MYCN. Os núcleos foram contrastadas com DAPI. Bar, 50 um. (B) um mapa de calor para níveis de expressão de médio (valores Cq, n = 96) de 13 genes de células estaminais neurais são mostrados. (C) As percentagens de células que expressam CD133, Musashi, Sox2, MYCN e CD15 são mostrados. Nós examinamos as células WT1 e WT2 (ver texto), não tratados esferas M10519 (M10519), esferas M10519 tratado com dox durante 24 horas (Dox), ou esferas M10519 tratados com MLN8237 durante 24 horas (MLN8237).

96-gene (ver S3 Mesa e Janos

et al

[19]) perfis de expressão para 96 ​​células individuais M10519 exibiu um grau de heterogeneidade (S6 Fig.). dados de expressão de célula única BioMark HD estão apresentados na Tabela S3. Para avaliar a diferença de coeficiente de correlação distribuições de conjuntos de dados derivados a partir de duas populações, usando o teste de Kolmogorov-Smirnov foram calculados coeficientes de correlação de pares de níveis de expressão de 96 genes de uma determinada população de células. O coeficiente de correlação médio (

R

) para neurospheres M10519 foi de 0,77, ea diferença entre as células M10519 e WT1 (

R

= 0,71, N

M10519 = 1081, N

WT1 = 990, D = 0,2662,

P

= 2.2×10

-16) ou WT2 (

R

= 0,60, N

M10519 = 1081, N

WT2 = 990 D = 0,57,

P

= 2.2×10

-16) células foi estatisticamente significativa. Estes dados indicam que, embora os perfis de células individuais na população neuroesfera M10519 expressão não são inteiramente homogénea na natureza, os perfis de transcrição entre células em WT1 e WT2 culturas de neuroesferas derivados de cerebelos normais são significativamente mais heterogénea. Além disso, MYCN retirada resultou em uma redução significativa do índice de heterogeneidade (

R

= 0,69, N

M10519 = 1081, N

M10519 + Dox = 990, D = 0,27,

P

= 2.2×10

-16). Tomados em conjunto, estes resultados sugerem que a expressão MYCN eleva o nível de homogeneidade celular e expande as células com tronco e progenitoras neurais marcadores.

unidades MYCN expansão de células resistentes a estímulos de diferenciação na cultura

Curiosamente, apesar da célula-tronco e /ou perfil de transcrição progenitor-like das células expandidas em culturas de neuroesferas, as células que expressam GTML MYCN exibida somente potencial de diferenciação limitada

in vitro

. Seguindo 8 dias de crescimento em meios pró-diferenciação contendo soro, descobrimos que três linhas GTML retido características morfológicas típicas de células indiferenciadas (S2 Fig.), Embora nós achamos que o neural tronco /progenitoras marcador Nestin foi reprimidos após 2 dias de MYCN retirada (Fig. 1D). Em contraste, nas mesmas condições de diferenciação induzida neurosferas estabelecidas a partir de tipo selvagem cerebelos (S2 Fig.). A aparente perda de potencial de diferenciação em células GTML sugerem que a mudança genética ou epigenética pode ocorrer após a ativação MYCN prolongado. Descobrimos também que as células não se diferenciou GTML totalmente sob uma variedade de condições (por exemplo, tratamento com ácido retinóico, um forte indutor de diferenciação (S2 Fig.), Ou a cultura em meios contendo 0,5 mg-1 mg /ml de colagénio (dados não mostrados )). Quando as células foram cultivadas em M10519 meios pró-diferenciação contendo soro e ácidos retinóicos, enquanto que foi observada a regulação negativa da MYCN, que é controlada pela

GLT1

promotor que é activado em células progenitoras, e a nestina 48-96 horas , observa-se sem alterações consideráveis ​​nos níveis de marcadores neuronal Sinaptofisina e TuJ1 e GFAP marcador glial (S3 Fig.). Tomados em conjunto, estes resultados sugerem que a expressão resulta MYCN no enriquecimento de células com marcadores típicos de células estaminais e /ou progenitoras, expansão de células proliferativas altamente resistentes aos estímulos de diferenciação de condução. A aparente perda de potencial de diferenciação em esferas GTML está em contraste com neurospheres derivados de MB humana (para o qual

MYCN

status não foi examinada) [27] ou o

Ptc viajantes – /- modelo do rato [37], sugerindo que a expressão persistente de MYCN impulsiona compromisso irreversível para a expansão de células com tronco e progenitoras neurais marcadores.

neurospheres GTML-driven MYCN reter propriedades de tumores primários

in vivo

recentemente, mostrou que neuroesferas derivadas de ratinhos GTML são capazes de tumores que se formam em uma maneira dependente da MYCN ortotopicamente quando implantado no cerebelos de crias da mesma ninhada transgénicos não-[12]. Como esperado, a adição de DOX com a dieta reduzida rapidamente bioluminescência (Fig. 3A) e a carga do tumor (Fig. 3B) em ratinhos implantados com células M10519. Para avaliar o impacto da retirada MYCN

in vivo

, examinamos a expressão de biomarcadores em tumores ortotópicos.