Abstract

A telomerase é necessário para a vida útil ilimitado de células cancerosas. A grande maioria dos adenocarcinomas pancreáticos sobre-expressar a atividade da telomerase e bloqueando a telomerase poderia limitar a sua vida útil. GRN163L (Imetelstat) é um conjugado lípido-N3 ‘→ P5’ tio-fosforamidato oligonucleótido que bloqueia a região do molde da telomerase. O objetivo deste estudo foi definir os efeitos da exposição GRN163L a longo prazo sobre a manutenção dos telômeros e vida útil de células de câncer de pâncreas. tamanho dos telómeros, a actividade de telomerase, de telomerase e a resposta de inibição GRN163L foram medidos num painel de 10 linhas celulares de cancro pancreático. As linhas celulares exibiram grandes diferenças nos níveis de atividade da telomerase (variação 46 vezes), mas a maioria das linhas tinham telômeros muito curtos (2-3 KB de tamanho). GRN163L inibida telomerase em todas as 10 linhas celulares de cancro do pâncreas, com IC

50 variando de 50 nM a 200 nM. GRN163L exposição contínua de CAPAN1 (IC

50 = 75 nM) e CD18 células (IC

50 = 204 nM) resultou numa redução inicial rápida dos telómeros, seguido pela manutenção dos telómeros extremamente curtos, mas estável. A exposição contínua a droga eventualmente levou à crise e uma completa perda de viabilidade após 47 (CAPAN1) e 69 duplicações (CD18). Crise dessas células foi acompanhado por activação de uma resposta a danos no ADN (γ-H2AX) e provas de ambos senescência (actividade SA-β-galactosidase) e apoptose (teor de ADN sub-G1, a clivagem de PARP). A remoção do fármaco após a exposição a longo prazo GRN163L conduziu a uma reactivação da telomerase e re-alongamento dos telómeros na terceira semana de cultura, sem GRN163L. Estes resultados mostram que o tempo de vida das células de cancro do pâncreas podem ser limitados pela inibição da telomerase contínua. Estes resultados deverão facilitar a concepção de futuros ensaios clínicos de GRN163L em pacientes com câncer de pâncreas

Citation:. Burchett KM, Yan Y, Ouellette MM (2014) telomerase Inhibitor Imetelstat (GRN163L) limita a vida útil da Human cancro do pâncreas células. PLoS ONE 9 (1): e85155. doi: 10.1371 /journal.pone.0085155

editor: Arthur J. Lustig, Tulane University Health Sciences Center, Estados Unidos da América

Recebido: 19 de julho de 2013; Aceito: 23 de novembro de 2013; Publicação: 07 de janeiro de 2014

Direitos de autor: © 2014 Burchett et al. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Licença Creative Commons Attribution, que permite uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o autor original ea fonte sejam creditados

Financiamento:. Este trabalho foi apoiado por uma concessão do National Cancer Institute (NCI) SPORE (P50 CA127297) e bolsa de formação NCI (T32 CA09476). Os financiadores não tiveram nenhum papel no desenho do estudo, coleta de dados e análise, decisão de publicar ou preparação do manuscrito

Conflito de interesses:. Os autores têm as seguintes participações. GRN163L eo oligo incompatíveis foram fornecidos gratuitamente pela Geron Corp. (Menlo Park, CA). Os autores desejam expressar sua gratidão pelo conselho, feedback e reagentes adicionais fornecidas a eles por Sergei Gryaznov, Robert Tressler, Ning Go e Katia Bassett da Geron Corp. Isto não altera a adesão dos autores para todas as políticas de PLoS ONE sobre a partilha de dados e materiais.

Introdução

o câncer de pâncreas é a quarta principal causa de morte por câncer no mundo ocidental. O câncer de pâncreas é uma doença de evolução insidiosa e de alta letalidade, com uma taxa de sobrevida em 5 anos de apenas 6%. Nos Estados Unidos sozinho, cerca de 43,920 pacientes são esperados ser diagnosticados com a doença em 2012, e 37,390 pacientes são esperados para morrer com ela [1]. A grande maioria destes casos são adenocarcinomas do ducto pancreático, que se desenvolvem nas condutas do pâncreas. Estes tumores altamente invasivos consistem de um estroma desmoplástico abundante, na qual estão incorporadas as células cancerosas malignas que expressam marcadores de células do ducto pancreático [2], [3]. Para pacientes com adenocarcinoma ductal pancreático, a única opção é a cirurgia curativa [3]. O procedimento padrão é um pancreaticoduodenectomy (ou procedimento de Whipple), uma operação cirúrgica que remove a cabeça do pâncreas, mas poupa o tecido remanescente. Infelizmente, os pacientes de câncer mais pancreáticas apresentam metastática irressecável ou doença localmente avançada. De facto, apenas 20% dos pacientes têm tumores ressecados no momento do diagnóstico [3]. Mas, mesmo para aqueles pacientes que se submetem à cirurgia, a taxa de sobrevida global em 5 anos é de apenas 20%, como a maioria destes pacientes recaída dentro de um ano de sua cirurgia [3]. Deste modo, existe uma necessidade crucial para novos medicamentos que podem mais eficazmente como alvo estas células de tumor e /ou reduzir a incidência de recidivas. inibidores de telomerase foram propostos para ser especialmente bem adequada para bloquear o crescimento de células cancerosas residuais após a terapia convencional do cancro [4], [5]. Não só eles como alvo selectivamente as células cancerosas de telomerase-positiva, mas os seus efeitos inibidores do crescimento aumentar à medida que as células-alvo realizar um crescente número de divisões celulares. No presente estudo, caracterizamos os efeitos de um inibidor de telomerase, GRN163L, sobre o tempo de vida celular e sobrevivência de um painel de linhas celulares de cancro pancreático.

A telomerase é a enzima responsável pela manutenção dos telómeros, essencial estruturas que PAC e protegem as extremidades dos cromossomos lineares. telómeros humanos são feitas de cópias em tandem de (TTAGGG)

N repete ADN e de proteínas associadas, que em conjunto formam um complexo protector nivelamento [6], [7]. Este tampão protege cromossómico extremidades da degradação, e intercromossômicas fusões de ser reconhecido como (ds) quebras de ADN de cadeia dupla, uma forma de dano de ADN [7], [8]. Por causa dos problemas associados com a replicação das extremidades das moléculas lineares de ADN, os chamados problemas de replicação-fim, os telómeros encurtam cada vez que as células somáticas humanas e de dividir esta atrito limita a sua vida útil [9]. Uma vez que o telômero mais curto se tornar sem tampa, uma resposta danos no DNA é induzida que mobiliza o p53 e p16 /vias pRb que, então, agir em conjunto para induzir a senescência, um Estado viável de quiescência irreversível [10], [11]. Se as proteínas p53 e p16 /pRB vias estão desativados, as células vão ignorar esses sinais inibidores de crescimento e continuará a dividir e diminuir seus telômeros. Eventualmente, telômero terminal de redução levar a uma crise, um estado não viável associada à morte celular programada [10], [11]. Crise é desencadeada por ciclos recorrentes de fusões telômero-telômero, pontes anáfase e ruptura dos cromossomas [12]. Quando presente, a telomerase pode impedir a indução de senescência e de crises e estender o tempo de celular pela síntese e adição de novas repetições teloméricas aos telômeros. A telomerase é ubiquamente presentes nas fases iniciais do desenvolvimento humano. Mas, no momento do nascimento, a expressão da enzima é reprimida e telomerase torna-se presente na maioria dos tecidos somáticos [13], [14], incluindo o pâncreas [15], [16], [17]. espécimes de câncer, em contraste com os tecidos normais, são quase sempre positivo para a atividade da telomerase [18], incluindo adenocarcinomas do ducto pancreático [15], [16], [17]. Detectados em mais de 85% dos cancros, independentemente do tipo de tumor, a telomerase é um dos marcadores mais conhecidos de células cancerosas [18]. Além disso, esta expressão de telomerase em células cancerosas é necessário para a sua proliferação ilimitada ou imortalidade, uma característica marcante do câncer. Por conseguinte, a inibição da telomerase em células cancerosas conduz ao atrito do telómero e limita o tempo de vida destas células [19], [20], [21], [22]. Depois de suficiente atrito de telómeros tomou lugar, as células cancerosas inibidas por telomerase sucumbirá, quer a senescência ou apoptose, dependendo do sistema celular. Esta dependência de telomerase do seu crescimento ilimitado e a expressão quase universal da telomerase em células de cancro da telomerase tornar um alvo atraente para a terapia do cancro. Um inconveniente potencial, no entanto, são os atrasos necessários antes de as células cancerosas alvo perderam telômeros suficientes para a senescência ou de crise a ser induzido. Esta acção retardada pode impedir o seu uso como uma primeira linha de tratamento para o cancro, mas a bloquear o crescimento de doença residual após terapia convencional, foram esperar que os inibidores de telomerase para ter um bom potencial terapêutico [4], [5].

telomerase humana contém duas subunidades essenciais: o de hTERT proteína (humana telomerase Transcriptase reversa) e o pequeno ARN nuclear hTR (humano telomerase RNA). A primeira proporciona actividade catalítica e a segunda contém uma pequena sequência (5′-CUAACCCUAA-3 ‘), que serve como um molde para a síntese de repetições teloméricas [23]. O substrato da telomerase é o excesso de fita simples 3′-telomérica que cobre o fim de todos os telómeros. As funções enzimáticas como uma transcriptase reversa e utiliza o RNA de hTR como um molde para a síntese de ADN e a adição telomérica repete às saliências 3′-teloméricas. Para a inibição da telomerase, a região do molde de ARN de telomerase humana (hTR) apresenta um alvo acessíveis para os inibidores à base de oligonucleótidos [4], [24]. Os oligonucleótidos desenhados para hibridar com a região do molde pode ser utilizado para inibir a actividade de telomerase, [25], [26]. Os oligonucleótidos com vários produtos químicos foram testados e os oligonucleótidos N3’-P5 ‘tio-fosforamidato produziram alguns dos inibidores mais potentes e selectivos da telomerase [25], [27], [28]. Estes compostos são não-tóxicos, solúveis em água, resistentes a nuclease e exibir uma elevada estabilidade térmica de duplexes formados com as suas cadeias de ARN complementares. GRN163L é uma segunda geração N3’-P5 ‘tio-fosforamidato inibidor de telomerase concebido por Geron Corp. (Menlo Park, CA) [20]. Este inibidor, também conhecido como Imetelstat, transporta um radical 5’-terminal conjugado com o palmitoil N3 ‘ P5′ tio-fosforamidato espinha dorsal (5’-palmitato-TAGGGTTAGACAA-NH

2-3 ‘). GRN163L é solúvel em lípidos e não requer a transfecção para a absorção celular. Em concentrações nanomolares, GRN163L inibe telomerase em um largo espectro de linhas de células de cancro [20]. Em estudos de acompanhamento, a exposição GRN163L longo prazo poderia limitar o tempo de vida das células cancerosas cultivadas derivadas de glioblastoma [29], mieloma múltiplo [30] e adenocarcinoma de esôfago de Barrett [31], bem como de mama [32], [33], pulmão [34] e do fígado [35] cânceres. Em modelos de ratos, o inibidor poderia inibir o crescimento de xenoenxertos em ratinhos produzidas através da implantação destas células de cancro humano [29], [30], [31], [33], [34], [35]. GRN163L está actualmente em ensaios clínicos em doentes com mieloma múltiplo (ClinicalTrials.gov Identificador: NCT01242930)., Trombocitemia essencial ou policitemia vera (NCT01243073) e mielofibrose primária ou secundária (NCT01731951)

Os efeitos da inibição da telomerase, muito menos GRN163L, nunca foram examinados em câncer de pâncreas, uma das neoplasias mais mortais e mais frequentemente recorrentes. Neste relatório, nós testamos os efeitos da GRN163L em um painel de 10 linhas celulares de cancro do pâncreas. Com IC

50 no intervalo nanomolar, GRN163L telomerase eficazmente inibida em todas as linhas de células 10. GRN163L exposição contínua das células CAPAN1 e CD18 resultou num encurtamento inicial rápida dos telómeros, seguido pela manutenção dos telómeros extremamente curtos, mas estável. A exposição contínua a droga eventualmente levou à crise e uma completa perda de viabilidade aos 47 e 69 duplicações, respectivamente. Estes resultados mostram que a exposição contínua a GRN163L pode reverter o fenótipo de células imortal com cancro pancreático. Estes resultados devem facilitar a concepção de futuros ensaios clínicos de GRN163L em pacientes com câncer pancreático.

Materiais e Métodos

Materiais

soro fetal bovino (FBS) foi de HyClone ( Logan, UT, EUA). T4 polinucleótido quinase, proteinase K, gentamicina, penicilina /estreptomicina, meio de Eagle modificado por Dulbecco (DMEM), meio RPMI-1640, meio de Dulbecco modificado por Iscove e meio de McCoy 5A foram adquiridos a partir de Invitrogen Corp. (Carlsbad, CA, EUA). As enzimas de restrição Alui, MspI, HaeIII, Hinfl e Rsal foram da New England Biolabs (Ipswich, MA, EUA), enquanto que Cfol foi obtido da Promega Corporation (Madison, WI, EUA). O cocktail de inibidor de protease de mamífero foi da Sigma-Aldrich (St-Louis, MO, EUA). A palmitoil-conjugado N3 ‘ P5′ tio-fosforamidato oligo GRN163L (5’-palmitato-TAGGGTTAGACAA-NH

2-3 ‘) e o oligo incompatíveis (5’-palmitato-TAGGTGTAAGCAA-NH

3/2 ‘; desemparelhamentos sublinhados) foram fornecidas pela Geron Corporation (Menlo Park, CA, EUA). O N3 ‘ P5’ tio-fosforamidato oligos foram dissolvidos em solução salina tamponada com fosfato (PBS) para fazer estoques 1 mM, as quais foram mantidas congeladas a -80 ° C. Todos os outros químicos foram de Fisher Scientific (Pittsburgh, PA, EUA).

Linhas Celulares

linhas celulares utilizadas foram descritas previamente por outros [36], [37], [38], [ ,,,0],39], [40], [41]. As células foram mantidas a 37 ° C numa atmosfera humidificada contendo 5% de CO

2. Todas as linhas celulares foram cultivadas em meio suplementado com FBS a 10% e, ou 50 ug /ml de gentamicina ou 100 U /ml de penicilina /estreptomicina. Meios utilizados foram como se segue: DMEM para a maioria das linhas celulares (VA13, HeLa, HPAF, CD18, Hs766T, CAPAN1, MiaPaCa2, Panc1 e células L3.6pl); meio RPMI-1640 para as células AsPC1; meio de Dulbecco modificado por Iscove para CFPAC1; e meio de McCoy 5A para células CAPAN2.

Análise de Tamanho de Telómero

O ADN genómico total foi isolado a partir dos sedimentos congelados de células. Resumidamente, as células foram ressuspensas em 2 volumes de um tampão contendo NaCl 100 mM, Tris-HCl a 10 (pH 8,0) e EDTA 25 mM (pH 8,0), após o que foi adicionado 0,4 mg /ml de Proteinase K. dodecilsulfato de sódio (SDS) foi então adicionado a uma concentração final de 0,5% (w /v) e as amostras foram rodados durante a noite a 50 ° C. No dia seguinte, as amostras foram extraídas duas vezes com fenol saturado com Tris-tampão e, em seguida, uma vez com CHCl saturado-água

3. Em seguida, as amostras foram dialisadas durante a noite a 4 ° C contra duas mudas de tampão TE (EDTA 1 mM e 10 mM Tris-HCl, pH 8,0). As amostras de ADN genómico foram armazenadas a 4 ° C

O ADN genómico (5-10 ug) foi digerido a 37 ° C durante 2-4 horas em 100 ul de React um tampão (10 mM de MgCl

2. e Tris-HCl a 50, pH 8,0) com um cocktail de enzimas de restrição que deixam de cortar ADN telomérico: AluI, CFOI, HaeIII, Hinfl, MspI, e Rsal (16 unidades cada). As amostras digeridas foram carregadas num gel de agarose de 25 cm de comprimento de 0,7% em 0,5 × tampão TBE (Tris-Borato-EDTA), juntamente com um [

32P] marcador de ADN de peso -molecular marcado na extremidade. A electroforese foi realizada durante a noite a 50 volts, após o que o gel foi transferido para um papel de 3 M e seco sob vácuo a 60 ° C durante uma hora. O gel foi embebido em NaCl 1,5 M, NaOH 0,5 M durante 15 minutos, durante o qual o papel 3 M foi removida. O gel foi neutralizado durante 2 x 15 minutos em NaCl 1,5 M, Tris-HCl 0,5 M, pH 7,4 e, em seguida, transferidos para 6 x SSC (NaCl 750 mM, citrato de sódio 75 mM, pH 7,0). Pré-hibridação foi realizada durante 2 horas a 30 ° C num tampão contendo 5 x SSC, 5 x solução de Denhardt, EDTA 1 mM, SDS a 0,1% (w /v) de LiCl e 10 mM. A hibridação foi realizada no mesmo tampão a 37 ° C durante a noite, utilizando-se 0,5-1,0 x 10

6 cpm /ml de uma marcada na extremidade [

32P] – (TTAGGG)

4 sonda. O gel foi pré-lavada em 5 x SSC (duas vezes durante 10 minutos cada, a 37 ° C) e em seguida em 0,1 × SSC contendo SDS a 0,1% (três vezes durante 10 minutos cada à temperatura ambiente). Gel foi transferido seco, coberto com Saran Wrap e expostos a uma cassete Phosphoimager.

tamanhos dos telômeros medianos foram estimados a partir da digitalização densitométrico de cada pista. A intensidade de sinal foi representada graficamente como uma primeira função da distância de migração. os marcadores de peso molecular marcados radioactivamente foram usadas para produzir uma curva de calibração com a qual para recalcular o tamanho para cada distância migrada. intensidade de sinal dos telómeros foi, em seguida, novamente traçado como uma função da dimensão estimada, em vez do que a distância (por exemplo Figura S4). A mediana foi calculada como o tamanho que correspondia a metade da soma cumulativa de todas as intensidades de sinal.

Determinação de Actividade Relativa telomerase

actividade telomerase

foi medida utilizando uma modificação não radioactivo do ensaio TRAP (repetição telomérica Amplification Protocol), de acordo com Herbert

et al

. [42]. O ensaio foi realizado utilizando o kit de detecção de trapézio telomerase (cat # S7700; Millipore, Billerica, MA), substituindo o [

32P] marcado com TS oligo com um oligo TS Cy5 conjugada (5′-Cy5-AATCCGTCGAGCAGAGTT-3 ‘; Tecnologias de ADN integradas, Coralville, IA). O ensaio foi realizado de acordo com as instruções do fabricante, excepto que: 1) o corante de carga não continha cianol xileno; 2) A PCR foi realizada durante 33 ciclos; 3) gel foi digitalizado diretamente sem secagem. Metade reacções foram separados numa poliacrilamida a 10% /0,5 × gel de TBE durante 165 minutos a 200 volts, após o que a digitalização do gel foi realizada usando um Molecular Dynamics Typhoon Sistema Imager (Molecular Dynamics). O ensaio incorpora um padrão interno (ITAS) com o qual os sinais para normalizar as diferenças na eficiência da PCR. Com o programa ImageQuant (Molecular Dynamics), a actividade de telomerase foi calculada a partir da razão entre a intensidade dos produtos teloméricas mais que da ATI. Para comparar os níveis de actividade da telomerase entre as linhas celulares, diluições em série (50, 100, 200, 500 células /ensaio) de cada linha foram ensaiados em paralelo para a actividade da telomerase (produtos da telomerase /rácio ITAS). Traçando a actividade da telomerase como uma função de contagem de células, os dados de cada linha foi ajustada por regressão de mínimos quadrados de uma curva linear. A inclinação de cada intervalo de confiança de 95% da curva e, em seguida, podia ser usado para comparar os níveis relativos de actividade de telomerase.

Determinação de IC

50 para GRN163L

CI

50 determinações eram realizado em placas de 96 poços. As células foram semeadas a 5 x 10

4 /bem, deixou-se em anexo, e em seguida exposta em triplicado a uma dose variável de GRN163L (0, 50, 100, 200, 500, 1000, 2000, 4000 nM) ou oligo incompatíveis (0, 4000 nM). Vinte e quatro horas mais tarde, as células foram lavadas três vezes com 100 ul de solução salina tamponada com fosfato gelada (PBS) e em seguida lisaram-se em 50 ul de 1 × tampão CHAPS (kit) de trapézio. A lise foi feita por balanço em gelo durante 30 minutos, após o que a placa de 96 poços foi congelado. No dia do ensaio, a placa foi descongelado e as amostras foram diluídas de 1:20 para uma nova placa utilizando CHAPS 1 × tampão arrefecido com gelo (concentrações finais = 50 células /ul). Dois microlitros de cada amostra diluída (100 células) foram então ensaiadas como descrito acima utilizando o ensaio TRAP não-radioactivos. a actividade de telomerase (produtos da telomerase /rácio ITAS) foi calculada para cada ponto de dados, foi, em seguida, expresso como uma percentagem do valor médio das amostras não tratadas (n = 3), e foi, em seguida, relatado em gráfico de dispersão como uma função do log [ ,,,0],GRN163L]. Com SigmaPlot versão 11.0, os pontos de dados foram, subsequentemente, ajustada por regressão não linear com uma curva sigmoidal 2-parametter (Percentagem de telomerase = D + (100-D) /(1 + 10

((log [GRN163L] -log [IC50 ]) * 1,59)), em que D é a actividade residual mínimo), a partir da qual se estimou o valor e o intervalo de confiança de 95% do log [IC

50].

SA-β-galactosidase atividade

As células foram plaqueadas a uma densidade de 10

4 células /poço numa placa de 24 poços. No dia seguinte, as células foram fixadas e sujeitas a coloração histoquímica para a actividade β-galactosidase associada à senescência humana. A fixação e a coloração foi feita conforme descrito anteriormente [43]. Sem um filtro de contraste de fase, tanto as células positivamente (azul) e negativa (sem corante) corados foram contados sob o microscópio. Combinando dados de dez campos separados, a percentagem de células azuis foram tabulados a partir de um total de pelo menos 200 células contadas.

Curves

Crescimento

As células foram semeadas a uma densidade de 3 × 10

5 células por mm prato 150. Drogas (veículo de PBS, 1 uM GRN163L, 1 | iM de oligo mismatched) foram adicionados logo que as células ficaram ligadas (após 4-8 horas). As células foram cultivadas por 7 dias, período durante o qual as drogas novas foram adicionadas a cada 2-3 dias. Depois de uma semana de crescimento, as células foram tripsinizadas e contadas, e o número de duplicações da população efectuado por cada amostra foi re-calculada. As células foram então plaqueadas à mesma densidade original para outra semana de crescimento, enquanto que as células restantes foram postos de lado para qualquer isolamento de ADN ou para fazer reservas congeladas. As células foram mantidas em cultura até a perda completa das culturas tratadas com GRN163L.

Análise Western Blot

As células aderentes foram lavadas duas vezes com solução salina tamponada com fosfato gelada (PBS), colhidas por raspagem num tampão de lise contendo Tris-HCl 50 (pH 7,5), EDTA 1 mM, EGTA 1 mM, 1% de Triton X-100, 1% de protease de mamífero cocktail de inibidores, e cada um dos seguintes inibidores de cinase /fosfatase: 1 mM na

NaF 3VO

4, 50 mM, pirofosfato de sódio a 5 mM, 10 mM de sódio 2-glicerofosfato, e 1 uM microcistina. as células flutuantes foram recolhidas por centrifugação, após o que as células foram lisadas no mesmo tampão de lise. Combinados flutuante e as células aderentes provenientes do mesmo prato foram rapidamente congeladas e armazenadas a -80 ° C. As proteínas foram quantificadas usando o método de Bradford (Bio-Rad). As amostras (80-100 ug /poço) foram separadas em 4-20% de gradiente de géis de SDS-PAGE (Bio-Rad) e transferidos para membranas de nitrocelulose (Bio-Rad). Bloqueio de passos e as incubações com anticorpos foram realizadas em TBS-T (Tris-HCl a 50, NaCl 150 mM, 0,05% de Tween-20, pH 7,6) contendo quer 5% de leite seco isento de gordura ou 5% de albumina de soro bovino (quando utilizando anticorpos primários específicos de fosfo). As lavagens foram realizadas utilizando TBS-T. Os sinais foram detectadas utilizando o kit SuperSignal West Pico (Thermo Scientifics). Os anticorpos utilizados foram contra H2AX (anti-soro de coelho, gato # 07-627) e γH2AX (fosfo-Ser139, monoclonal, clone JBW301) eram de Upstate. O anticorpo anti-PARP1 (monoclonal de ratinho, clone de C-2-10) foi de Calbiochem /EMD Biosciences enquanto que o anticorpo anti-actina (anticorpo policlonal de cabra, SC-1616) era da Santa Cruz Biotechnology. Os anticorpos secundários utilizados foram anticorpos conjugados com peroxidase de rábano contra rato, coelho ou IgG de cabra (Jackson ImmunoResearch).

Análise de citometria de fluxo

As células aderentes foram recolhidas por tripsinização, seguido por centrifugação. células flutuantes foram recolhidas por centrifugação. células aderentes e flutuantes combinados foram ressuspensas em PBS, fixadas pela adição de etanol a 80%, e, em seguida, armazenada a -20 ° C. Vinte mil culas fixadas foram coradas com iodeto de propídio e analisadas quanto ao conteúdo de ADN, seguindo as instruções do fabricante, utilizando um instrumento FACS Calibur (Beckon Dickinson, Mansfield, MA, EUA).

Análise de imunofluorescência dos telómeros

As células cultivadas sobre lamelas foram lavadas em PBS e fixadas em metanol: acetona [01:01] a -10 ° C durante 15 minutos. Depois de uma lavagem em PBS, as amostras foram bloqueados à TA durante 30 minutos em PBS contendo 10% de soro de cavalo. Depois de uma lavagem em PBS, as amostras foram incubadas a 4 ° C durante a noite com o anticorpo primário em PBS contendo 2% de soro de cavalo. Depois de três lavagens de 5 minutos em PBS, as amostras foram incubadas à temperatura ambiente durante 1 hora com o anticorpo secundário em PBS contendo 2% de soro de cavalo. Depois de três lavagens de 10 minutos em PBS, as amostras foram colocadas em Vectashield contendo DAPI duro. Imagens foram visualizados em um Zeiss 510 Meta Confocal Laser Scanning Microscope. Os anticorpos primários utilizados foram um anticorpo de coelho anti-TRF2 (H-300, Santa Cruz) e anticorpos de ratinho anti-y-H2AX (clone JBW301, Upstate). Os anticorpos secundários foram um anticorpo anti-coelho de burro conjugado com FITC e anticorpo anti-murganho de burro conjugado com Cy5, ambos de Jackson ImmunoResearch.

A detecção de ALT por PCR quantitativa

C Detecção de telomérica círculos ricas em indicativos de ALT foi realizada como descrito pelo grupo Reddel [44]. Em triplicado, 20 reacções ul foram continha 32 ng de ADN genómico, de 0,2 mg /ml de albumina de soro bovino, 0,1% de Tween-20, ditiotreitol 4 mM (DTT), 7,5 unidades de polimerase de ADN Φ29 (New England Biolabs, Ipswich, MA) , 1 × Φ29 tampão de ADN-polimerase e 1 mM de cada dATP, dCTP, dGTP e dTTP. reacções de polimerase foram incubadas a 30 ° C durante 8 horas, seguido de 65 ° C durante 20 minutos. As reacções foram ponto transferidas para uma membrana de nitrocelulose (Bio-Rad). Depois de UV-reticulação, a membrana foi hibridizada durante a noite para a [

32P] marcado com (TAACCC)

4 sonda. Hibridação e lavagens foram realizadas conforme descrito na seção de análise do tamanho Telomere (veja acima).

Resultados

Telomere Comprimento e telomerase Atividade variam entre as linhas celulares de cancro do pâncreas

Um painel de 10 linhas celulares de cancro do pâncreas foi caracterizado por o comprimento dos telômeros ea atividade da telomerase relativa. DNA genómico isolado de cada linha foi digerido com um cocktail de 4 cortadores de bp, resolvidos em gel de agarose e submetido a

in situ

hibridação com um [

32P] marcado com (TTAGGG)

4 sonda . Sinais revelou uma mancha de fragmentos teloméricas, que variam em tamanho de 1 a 7 kpb (Figura 1A). A análise densitométrica permitiu a determinação do tamanho médio do sinal telomérica para cada linha celular (Figura 1B). AsPC1 tinham telômeros mais curtos (mediana = 2,2 kb), enquanto CAPAN2 e Panc1 teve o mais longo (medianas = 3,5 e 3,7 kb, respectivamente). Em algumas das linhas, em especial CAPAN1 e CFPAC1, distribuição dos telómeros foi bifásico. Nestas linhas, uma abundância de telómeros curtos coexistiram com uma pequena fracção dos telómeros muito mais longos ( 5 kb). Esperar para CAPAN2 e Panc1, todas as linhas tinham telômeros granel muito curtos, com tamanhos médios que variam 2,2-2,8 kb. A título de comparação, os telómeros no pâncreas humanos normais situam-se entre 9 e 15 kb em comprimento, dependendo da idade dos dadores [45].

a) Medições do tamanho Telomere. O ADN genómico foi digerido com enzimas de restrição, separado por electroforese em géis de agarose e detectados por hibridização in situ para [

32P] – (CCCTAA)

4. B) Quantificação do tamanho dos telómeros. Gel em A foi digitalizada e a intensidade de cada faixa foi representada graficamente como uma função do tamanho dos telómeros, como descrito na secção Materiais e Métodos. O tamanho médio dos telómeros foi estimada como sendo o tamanho correspondente a metade da soma cumulativa das intensidades. C) Detecção de actividade de telomerase pelo ensaio TRAP. Os extractos celulares contendo 300 células cada um foram ensaiadas utilizando um substrato de oligonucleótido TS marcado com Cy5. Depois de PCR com o mesmo iniciador de oligo e um telomérica retorno, os produtos foram resolvidos através de electroforese e detectado com um Typhson Phosphoimager. Tampão foi apenas tampão de lise. ATI, telomerase ensaio padrão interno. D) Quantificação da actividade da telomerase relativa. a actividade de telomerase relativa foi calculada como a razão entre a intensidade da escada da telomerase através da intensidade da ATI. Cada medição é a média ± S.D. de amostras em triplicado (n = 3). a actividade de telomerase em cada linha é expressa como uma percentagem da actividade de células HeLa ‘.

Usando um ensaio TRAP não-radioactivos (Protocolo de Amplificação de repetição telomérica), a actividade de telomerase de linha de base foi medida quantitativamente em cada linha celular. O ensaio TRAP utiliza a PCR para amplificar os produtos de alongamento da telomerase (telomerase escada), juntamente com uma norma de ensaio da telomerase interno (ITAS). actividade da telomerase é quantificada como a razão entre a intensidade da escada ao longo da telomerase que da ATI. A Figura 1C mostra um exemplo representativo de um ensaio TRAP realizados no painel, utilizando o mesmo número de células de cada linha. Foram observadas grandes diferenças na intensidade relativa da escada ATI e temos a telomerase, indicativo de grandes diferenças nas actividades da telomerase da linha de base. Para obter medidas mais precisas da actividade da telomerase, amostras diluídas em série de cada linha foram ensaiadas simultaneamente e em comparação com células HeLa. A análise densitométrica permitiu o cálculo da actividade da telomerase de linha de base para cada linha (Figura 1D). linhas de células do cancro do pâncreas tinha níveis de actividade da telomerase que variaram de 0,5% (CD18) a 23% (AsPC1) da das células de HeLa. Quatro linhas (L3.6pl, MiaPaCa2, HPAF, AsPC1) faziam parte de um grupo com maiores níveis de telomerase (15,8 ± 4,8 por cento de HeLa). Seis linhas (CD18, Panc1, Hs766T, CFPAC1, CAPAN1, CAPAN2) faziam parte do grupo exibindo 10 vezes menores níveis de telomerase (1,53 ± 1,1% por cento de HeLa). Uma diferença de 46 vezes na actividade de telomerase foi observada entre o AsPC1 (actividade mais elevada) e CD18 células (menor actividade). Não houve correlação entre o tamanho dos telômeros e nível de atividade da telomerase (Figura S1A).

A telomerase actividade inibidora de GRN163L no pâncreas linhas celulares de cancro

Em seguida, examinaram os efeitos inibidores de telomerase de GRN163L em cada uma das 10 linhas de células do cancro do pâncreas. Em cada linha, a actividade de telomerase foi medida às 24 horas após a adição de concentrações crescentes de GRN163L às células (n = 3 para cada dose). A Figura 2A mostra os resultados desta análise em células HPAF. A análise densitométrica das medições gel de TRAP permitidos de actividade da telomerase relativa, o que poderia, então, ser expressa como uma função da concentração de GRN163L. Estas curvas de dose-resposta foram ajustadas por regressão não linear para permitir o cálculo de um valor de IC

50 para cada linha. A Figura 2B mostra o intervalo de 95% de confiança para o valor do IC

50 em cada linha. Todas as 10 linhas celulares de cancro pancreático respondeu a GRN163L, com IC

50 que variaram de 50 nM a 200 nM. A linha foi menos sensível CD18 (IC

50 = 204 nM) e as mais responsivas foram CFPAC1 e MiaPaCa2 (IC

50 = 52 nM, ambos). Não vimos qualquer correlação entre a atividade da telomerase linha de base e a resposta das linhas celulares para GRN163L, medida pelo seu respectivo IC

50 (Figura S1B).

A) curva dose-resposta de inibição da telomerase por GRN163L . HPAF células foram tratadas em triplicado com concentrações crescentes de GRN163L (50 nm a 4 uM). Vinte e quatro horas mais tarde, a actividade de telomerase foi medida usando o ensaio TRAP. As amostras tratadas com droga não foram definidos como 100%. B) IC

50 de cada linha para a inibição da telomerase por GRN163L. As curvas de dose-resposta foram realizadas como no painel A. curva não-linear Encaixe permitiu o cálculo de um valor de IC

50 para cada linha. Os resultados são expressos como o IC

50 (barra do meio) e seu intervalo de 95% de (bares que ladeiam) confiança.

Efeitos de Exposição GRN163L crônica sobre a proliferação celular e Longevidade

Duas linhas celulares de cancro do pâncreas foram escolhidos para estudar os efeitos da exposição a longo prazo para GRN163L: CAPAN1 e CD18. Comparável com a maioria das linhas pesquisados, CAPAN1 e CD18 ambos tinham telómeros relativamente curtos (2-3 kb) e actividades da telomerase de baixo nível (0,5-1% de células HeLa). centrifugation.

doi:10.1371/journal.pone.0085155.s005

(TIF)

Acknowledgments

GRN163L