Abstract

Embora o câncer de próstata (PCA) tem progressão lenta, o hormônio refratário (HRCP) e entidades metastáticos são substancialmente letal e falta de tratamentos eficazes. Slug factor de transcrição é essencial na regulação de metástases de vários tumores, incluindo CaP. Aqui nós estudamos terapia direcionada contra Slug usando combinação de 3 drogas que alvejam 3 vias, respectivamente convergentes via Slug e mais regulam CaP metástase. Usando

in vitro

ensaios que confirmaram que Slug-regulação inibição incorrido da caderina-E que era anti-metastático, e inibiu a apoptose celular Bim-regulados de CaP. PTEN Upstream /caminhos Akt, mTOR, Erk, e AR /Hsp90 foram responsáveis ​​por Slug-regulação e cada um deles poderia ser alvo de rapamicina, CI-1040, e 17-AAG respectivamente. Em 4 linhas de células APC com diferentes características em termos de perda de PTEN e androgénio sensibilidade foi testada a eficácia de mono- e terapia combinada com as drogas. Descobrimos que a capacidade metastática de células foi maximamente inibida apenas quando todos os 3 fármacos foram combinados, devido à diafonia entre as vias. 17-AAG diminui expressão Slug através do bloqueio da estabilidade AR dependente de HSP90. Combinação de rapamicina e CI-1040 diminui invasão mais potente em células CaP que são andrógeno insensível e com a perda de PTEN. Slug inibiu a apoptose Bim-mediada que poderia ser resgatado por inibidores de mTOR /Erk /HSP90. Usando modelos de ratos para fazer circular quantificação do DNA APC, verificou-se que a combinação de inibidores de mTOR /Erk /HSP90 reduziu células circulantes CaP

in vivo

significativamente mais potente do que a combinação dos 2 ou monoterapia. Conclusivamente, combinação de mTOR /Erk /Hsp90 inibe a capacidade metastática do câncer de próstata através da inibição Slug

Citation:. Ding G, Feng C, Jiang H, Ding Q, Zhang L, Na R, et al. (2013) Combinação de rapamicina, CI-1040, e 17-AAG Inibe a capacidade metastática do câncer de próstata através Slug inibição. PLoS ONE 8 (10): e77400. doi: 10.1371 /journal.pone.0077400

Edição: Natasha Kyprianou, da Universidade de Kentucky College of Medicine, Estados Unidos da América

Recebido: 22 Abril 2013; Aceito: 02 de setembro de 2013; Publicação: 10 de outubro de 2013

Direitos de autor: © 2013 Ding et al. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Licença Creative Commons Attribution, que permite uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o autor original ea fonte sejam creditados

Financiamento:. Este estudo foi apoiado em parte pelas elites Jovens financiamento Científico da Universidade de Fudan (No.144) e Juventude de financiamento científico da National Science Foundation Natural da China (NSFC-81202002). Os financiadores não tiveram nenhum papel no desenho do estudo, coleta de dados e análise, decisão de publicar ou preparação do manuscrito

CONFLITO DE INTERESSES:.. Os autores declararam que não existem interesses conflitantes

Introdução

o câncer de próstata (PCA) é uma neoplasia comum, que ainda classifica alta como principal causa de morte entre malignidades urológicas, e permanece a segunda principal causa de mortes por câncer em homens [1]. Embora a detecção precoce de CaP melhorou o resultado clínico, o PCA metastático e câncer de próstata hormônio refratário (HRPC) continuam a ser um dos problemas clínicos mais difíceis, o que leva a um evento de fase final com um mau prognóstico. CaP tem uma tendência marcante de metástase para os ossos. A taxa de sobrevida em 5 anos de câncer de próstata primário se aproxima de 100%, e no entanto se recusa a 33%, se metástase óssea é diagnosticada [2]. A terapia de privação de androgênio (ADT) é actualmente sugerido para homens que são diagnosticados com ou desenvolver avançado ou metastático CaP após tratamento local [3]. Infelizmente, a resistência à ADT eventualmente emerge, manifestando-se como normalmente recrescimento tumoral associada com um aumento dos níveis séricos de antigénio específico da próstata (PSA), e no caso de HRPC, desfechos fatais é geralmente associada [4,5]. estratégias terapêuticas tradicionais (quimioterapia e radioterapia) são muitas vezes associada a resultados insatisfatórios nessa população. Portanto, a terapia alvo tem emergido como uma modalidade alternativa promissora para pacientes com CaP metastático ou HRPC. O desenvolvimento de intervenções terapêuticas mais eficazes baseadas nos estudos moleculares pelos quais os tumores se desenvolvem resistência a fármacos terapêuticos é, portanto, uma necessidade urgente. Um trabalho recente tem sido o objetivo de identificar as moléculas-chave envolvidos na metástase como alvos terapêuticos.

Slug (Snai2) é um membro da família do caracol, o que é um factor de transcrição dedo de zinco. É também um dos genes específicos de vertebrados associados com caracol. Foi confimred num certo número de estudos in vitro que Slug é crítica para a metástase e invasão capacidade das células cancerosas [6,7]. Estudos também mostraram que a expressão do Slug pode ser aumentado em certos órgãos (mama e tecidos de tumor do estômago), mas decresed em outros (tais como cancro do cólon, ovário de tecidos normais e esófago). O nosso estudo anterior mostra que a proteína do Slug é altamente expresso em tecidos de cancro da próstata, e que a proteína é expressa em Slug PC-3, linhas celulares de LNCaP, DU-145, e 22RV1 APC. A sua expressão podem ser submetidos a regulamentação a modificação pós-transcrição ou tradução. Descobrimos também que a proteína Slug é altamente expresso em amostras de tumor, mas não no tecido normal da próstata [8]. Portanto, no presente estudo pretende-se estudar a forma como Slug está implicado na capacidade metastática do APC e testar a eficácia da terapia direcionada contra vias relacionadas Slug.

Materiais e Métodos

Reagentes

A rapamicina, CI-1040, 17-AAG, o DHT (0,1 mg /ml) e anticorpos primários do pedaço de chumbo (de coelho), PS6 (pSer235 /236, de coelho), pAkt (pSer473, coelho), (PTEN de coelho), HIF-1α (rato), HSP90 (coelho), AR (coelho), e β-actina (rato) foram adquiridos da Sigma-Aldrich, Munique, Alemanha. Anticorpos de Perk (pThr202 /pTyr204, coelho), e Erk (coelho) foram adquiridos da Cell Signaling Technology (Danvers, MA). Anticorpos secundários foram adquiridos a partir de Santa Cruz, EUA. Utilizou-se o kit de substrato quimioluminescente SuperSignal West Pico (Thermo Scientific, IL). Slug e controle siRNAs humanos foram adquiridos de Santa Cruz.

cultura celular

DU145 Humano, PC-3, LNCap e 22RV1 linhas celulares de adenocarcinoma de próstata eram comerciais e foram adquiridos a partir Cell Bank da Academia Chinesa de Ciências (Xangai, China). células LNCaP e 22RV1 foram cultivadas em meio RPMI 1640 (PAA, Alemanha) com 10% de soro fetal de bovino (FBS) (PAA). DU145 e células PC-3 foram cultivadas em meios F-12 de Ham (GIBCO, NY) com L-glutamina (300 mg /L, de NaHCO

3 1,5 g /L) e 10% de FBS. As células foram incubadas com 5% de CO

2 a 37 ° C.

Western blotting

A proteína total dos lisados ​​foi extraída e purificada. quantidade igual de proteína de 25 ug foi carregado em gel de poliacrilamida dodecil sulfato de sódio a 10% para electroforese. Os géis foram subsequentemente transferidas para uma membrana de nitrocelulose. As membranas foram bloqueadas durante 1 h com leite não gordo a 5%. Os anticorpos primários de Slug, PS6, pAkt, PTEN, PERK, Erk, HIF-1α, HSP90, AR, e β-actina foram então adicionados e as membranas foram incubadas a 4 ° C durante a noite. anticorpos secundários correspondentes foram aplicados seguido pela aplicação de peroxidase de rábano.

Migração e invasão ensaio

Os ensaios in vitro de migração foram realizados como previamente descrito. Resumidamente, as células foram semeadas na câmara de topo das inserções de cultura de células de tamanho de poro 8.0μm que eram ou revestido ou não revestido com matrigel para os ensaios de migração e invasão, respectivamente. Em seguida, as pastilhas foram colocadas numa placa de 24 poços cheios com meio com soro fetal bovino a 5%. As células que penetrou nas superfícies do lado de baixo dos insersores foram fixados e corados com o método Diff-Quick (Fisher Scientific, Pittsburgh, PA) e foram contados sob o microscópio. foi calculada a média de três campos de alta potência para cada condição feitas em triplicado.

Realtime PCR

O RNA total foi extraído com RNAiso reagente (Takara, Dalian, China). Após concentração foi determinada com Thermo Nanodrop 1000 espectrofotómetro, RNAs foram convertidos em ADNc com o kit de RT PrimeScript Reagente (Takara), sob a condição de 37 ° C, 15 min; 85 ° C, 5 seg. iniciadores de Slug, E-caderina, e GAPDH controle interno (gliceraldeído-3-fosfato) foram sintetizados (Invitrogen) para a frente e para trás como se segue sequências (Tab. 1): para o ser humano E-caderina, sentido, 5′-ACA GCC CCG CCT TAT GAT T-3 ‘e antisense, 5′-TCG GAA CCG CTT CCT TCA-3′; para Bim, sentido, 5’-GGT CCT CCA GTG GGT ATT TCT CTT-3 ‘e antisense, 5′-ACT GAG ATA GTG GTT GAA GGC CTG G-3′; para a caspase-3, sentido, 5’-GAC AGA CAG TGG TGT TGA TGA TGA C-3 ‘e anti- sentido, 5′-TGG CGC CAC AAA GCG ACT GGA T-3′; para Slug, sentido, 5’-GGA TTC CCCACA CAT TAC CT-3 ‘e anti- sentido, 5′-GCA GTG AGG GCA AGA AAA AG-3′; para GAPDH, sentido, 5’-ATG GAA ATC CCA TCA CCA TCT T-3 ‘e antisense, 5′-CGC CCC ACT TGA TTT TGG-3’. As amostras foram processadas com SYBR Green Premix Ex Taq (Takara), em 20 ul de sistema de 7500n ABI (Applied Biosystem, Forster City, CA). As amostras foram corridas a 95 ° C, 30 seg e foram amplificados durante 40 ciclos (95 ° C, 5 segundos; 60 ° C, 34 seg). Para cada amostra, o valor médio do ciclo de limiar foi normalizado para GAPDH nível com a fórmula, 2

-ΔΔCt. Os resultados foram, assim, apresentado por dobras Expressional o controle.

Xenoenxerto e intravenosa modelo de tumor

Homem BALB /c atímicos camundongos nus com 6 semanas de idade (Vital Rio, Pequim, China) foram criados em SPF licenciada laboratório grau (especial livre de patógenos). Todos os ratos foram submetidos a orquiectomia para a privação de andrógeno. Um total de 2 x 10

6 células (DU145, PC-3, LNCap, 22RV1 respectivamente) por via subcutânea em 100 ul de PBS foram injectados em ambos os flancos de cada ratinho. grupo de controlo de veículo foi dada 100 ul de PBS. O crescimento do tumor foi monitorado e sangue periférico foi recolhido em 1 mo. Para injecções intravenosas, 2 × 10

5 células foram injectadas na veia lateral da cauda e o sangue periférico foi recolhido às 24 h. Todos os protocolos foram aprovados pela Universidade de Fudan comitê de ética animal.

detecção de morte celular

A morte celular foi detectada utilizando um ensaio MTT, um método que foi bem estabelecida. Resumidamente, as células foram em primeiro lugar dada tratamentos diferentes, e, em seguida, expostas a 400? M H

2O

2 durante 4 h. No grupo controle, as células RIN-mβ só foram tratadas com 400? M H

2O

2 e correspondente de drogas, respectivamente. No final dos tratamentos, os meios foram removidos e as células foram coradas e medido a 495 nm utilizando um leitor de Autoplate (Bio-Tek, EUA). O tratamento com 400 mM H

2O

2 para 4 h poderia induzir a apoptose de cerca de metade das células CaP (~ 50%) e a dose foi, portanto, escolhido como condição ideal.

Circulação DNA tumor detecção

rato sangue (0,5 mL) foi recolhido nos tempos indicados por sangramento intra-ocular, e os glóbulos vermelhos foram lisados ​​antes da extracção do ADN. O kit miniprep Quick-gDNA (Epigenética, EUA). Resumidamente, 400 ul de tampão de lise foram adicionados a 100 ul de plasma. Depois de vórtex vigoroso, todos os conteúdos foram transferidos para colunas e foram centrifugados. tampão de pré-lavagem, em seguida, foi adicionado, seguido por outra centrifugação e adição de tampão de lavagem. DNAs foram finalmente eluído com tampão de DNA de eluição e foram quantificados por PCR em tempo real TaqMan-química base como acima referidas, para expressões Slug humana e E-caderina.

A análise estatística

One-amostra e Two testes t -Sample e teste de Mann-Whitney foram utilizados para in vitro e in vivo. Um valor p ou 0,05 foi aceito como significância estatística. Os dados foram apresentados como média ± desvio padrão (SD).

Resultados

andrógeno promove potencial metastático da PCA através de aumento da regulação do Slug

O câncer de próstata se alimentava de andrógenos no maioria dos casos e a transição para o fenótipo hormônio refratário (HRPC), a terapia da privação do andrógeno geralmente necessária a longo prazo. Nós, portanto, investigado aqui se Slug foi implicado na via metastática mediada por andrógeno no cancro da próstata. Através da aplicação de di-hidrotestosterona (DHT) a 1 nM até 4 linhas de células APC com diferentes características, verificou-se que as células eram diferentes quanto à sua capacidade inerente migrando com diferente sensibilidade para androgénio (Figura 1A). As células PC-3 foram inerentemente mais invasivo, e LNCaP e 22RV1 foram mais sensíveis à estimulação de androgénio com aumentos significativos no perfil metastático. padrão semelhante de alterações na capacidade de invasão também foi observada no ensaio de invasão, confirmando os perfis acima mencionada (Figura 1B). Para elucidar se Slug foi implicado no reforço metástase /invasão relacionada ao hormônio, exploramos os níveis de mRNA e proteína nessas células. Por conseguinte, a expressão de Slug foi significativamente aumentado significativamente em LNCaP e 22RV1 células que foram hormona sensível em resposta a DHT (Figura 1C). A mudança na expressão de mRNA também correspondia às mudanças no nível de proteína, como revelado em imunotransferência (Figura 1D). E-caderina, uma proteína essencial para a adesão célula-célula foi estabelecida para efectuar a jusante da pastilha, inibindo a transição epitelial-mesenquimal (EMT) e subsequente evasão célula. Nós ainda estudado se ativação do Slug por andrógeno inibição incorrido da caderina-E para promover a migração e invasão celular. De acordo com os ensaios anteriores, tanto ARNm e os níveis proteicos de E-caderina foram diminuiu após a adição de DHT em células sensíveis ao androgénio (Figura 1E, F). Conclusivamente, aqui nós demonstrou as diferenças de sensibilidades andrógeno de 4 linhas de células APC e revelaram que as células sensíveis ao andrógeno estimulado tinha aumentado a capacidade de migração e invasão via elevada Slug e diminuição da atividade E-caderina. Assim, para as células insensíveis ao andrógeno, que era suposto ser resistente hormona-privação, deve haver vias em que a migração se baseou e que a invasão poderia ser alvejados.

Migração (A) e invasão (B ) ensaios realizados em 4 linhas de células CaP tratados com dihidrotestosterona (DHT) e controle. Os níveis de ARNm (C) e proteína (D) do pedaço de chumbo em linhas celulares de CaP tratados com DHT ou de controlo. Os níveis de ARNm de (E) e de proteína (F) de E-caderina em linhas celulares de CaP tratados com DHT ou PBS (controlo). (Erro bar = desvio padrão; n = 3 para cada grupo; * p 0,05; ** p 0,01).

A combinação de rapamicina e CI-1040 diminui invasão do CaP

a hiperatividade da via PTEN /Akt /mTOR tem sido comprovada para ser pró-tumorigénico em uma variedade de cancros, incluindo a tumorigénese da APC, em que Slug era conhecido por ser um efector a jusante da hipóxia inducible factor-1α ( HIF-1α). Em seguida, estudou se a inibição do mTOR diminuiu o potencial metastático de PCA através de Slug. Detectamos grande perda de PTEN em DU145 e células PC-3, perda menor em células LNCaP em comparação com 22RV1 celular. Os substitutos a jusante para Akt, mTOR, e as atividades de HIF-1α foram todos aumentaram nas células PTEN-null, indicando uma mudança para mTOR via para fenótipos andrógeno-insensitive (Figura 2A). A adição de rapamicina a 10 nM diminuição dos níveis Slug em todas as linhas celulares, mas o nível basal de lesma maior apareceu em DU145 e células PC-3 (Figura 2B). A rapamicina com a mesma dose inibiram a migração e a invasão de células com perda de PTEN em ~ 30% e não afecta 22RV1 (Figura 2C, D). Como a inibição de mTOR poderia implicar feedbacks que eram, pelo contrário, pró-tumorigénico, examinamos a atividade de ERK1 /2, que foi relatada a desempenhar um papel alternativo na regulação da expressão de bala na CaP anteriormente. Surpreendentemente, a actividade de ERK1 /2 era elevado em todos os 3 linhas de células com a perda de PTEN seguintes aplicação rapamicina, indicando um contorno existente contornar mTOR em direcção Slug (Figura 2E). Temos, assim testou-se se a combinação de rapamicina e CI-1046, um /inibidor de ERK1 2, que é no ensaio clínico poderia diminuir ainda mais o perfil metastático nestas células. Western blot mostrou que a combinação de fármacos reduziu substancialmente o nível de Slug em todas as linhas celulares de CaP (Figura 2F). Em seguida, testamos se rapamicina efectuado através do bloqueio de mTORC1 e exerceu o seu efeito a jusante via ERK e sobre Slug. O tratamento de células DU145 com diferentes combinações de rapamicina, rapina e Rictor siRNAs, verificou-se que, apesar de um bloqueio completo de ambos os elementos MTOC-1 e -2 resultaram em máxima inibição de ERK e de espaçador, o efeito inibitório de rapamicina foi possivelmente através mTORC1- ERK-Slug via (Figura 2G). O efeito sinérgico da combinação de 1 nM de rapamicina e 0,5 uM de CI-1040 foi mostrado nas Figuras 2H, I. Houve uma maior inibição de migração e invasão capacidade em células com perda de PTEN atingindo ~ 50% em comparação com a monoterapia de rapamicina. Em conclusão, andrógeno-insensitive CaP foram geralmente mTOR hiperativo devido à perda de PTEN. Monoterapia com rapamicina no entanto implicou a ativação ERK, que activado Slug como um desvio. Combinação de inibidores de mTOR e ERK conferida melhor efeito do que a monoterapia.

os níveis basais de PTEN, Akt fosforilada e S6, e HIF1α nas linhas celulares indicadas CaP por Western blot (A). Mudança de nível Slug em células CaP tratadas com rapamicina sobre o controle (B). Ensaios de Migração em linhas de células APC com ou sem tratamento de rapamicina (C) e invasão (D). Activação de Erk 1/2 via em células que respondem a tratamento com CaP rapamicina (E). Os tratamentos combinados de rapamicina (R) e CI-1040 (IC) em linhas de células APC e o efeito sobre Slug (F). Combinações de rapamicina e rapina /Rictor siRNAs e os efeitos sobre a ERK e Slug em células DU145 (G). Ensaios de Migração em linhas de células APC com ou sem tratamento de combinação com rapamicina e CI-1040 (H) e invasão (I). (Erro bar = desvio padrão; n = 3 para cada grupo; * p 0,05; ** p 0,01).

17-AAG diminui expressão Slug via bloqueio dos dependentes de HSP90 AR estabilidade

Apesar de privação hormonal tinha efeito duradouro sobre a APC, que poderia resultar de uma série de eventos adversos sistêmicos. Como androgénio exercida seus efeitos através da ligação ao seu receptor (AR), que induz a activação do Slug, testámos se a terapia dirigida contra Slug via poderia ser visando AR. Foi estabelecido que a proteína de choque térmico 90 (Hsp90) é necessária para a estabilidade de proteínas, incluindo AR. Em seguida, estudaram se uso de Hsp90 inibidor 17-AAG poderia diminuir o efeito dos andrógenos nos perfis metastáticos da ACP através da inibição da Slug. As células foram tratadas com quer sozinho DHT ou com combinação de 300 nM de 17-AAG. Como esperado, a combinação de 17-AAG bloquearam a actividade Slug mais aparentemente em linhas de células sensíveis da hormona (Figura 3A). Além disso, a inibição da migração e invasão não foi observado apenas em linhas de células sensíveis de androgénio, mas em células PC-3 e também (Figura 3B, C). Para resumir, o bloqueio da Hsp90 desestabilizado AR levando a diminuição do efeito de andrógeno na promoção da migração celular e invasão. crosstalk efeito de 17-AAG poderia existir como ele também exerceu efeito nas células insensíveis andrógenos. níveis

Slug CaP em células tratadas com DHT ou combinação de DHT e 17-AAG (A). Ensaios de Migração em linhas de células APC com ou sem combinação tratada com DHT ou combinação de DHT e 17-AAG (B) e invasão (C). (Erro bar = desvio padrão; n = 3 para cada grupo; * p 0,05; ** p 0,01).

Slug inibe a apoptose Bim-mediada que pode ser resgatado por mTOR /Erk /HSP90 inibidores

efeitos até agora, nós estabelecemos de segmentação 3 vias relacionadas-Slug com efeitos profundos na inibição perfis metastáticos. Como Slug também foi responsável por seus a jusante efeitos anti-apoptóticos em células tumorais, examinamos se a combinação de drogas Slug-alvo conferido efeitos pró-apoptóticos. Em primeiro lugar, imitou espécies reativas de oxigênio (ROS), utilizando H

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2, e descobriu que as células com insensibilidade androgênica foram mais resistentes à ROS e andrógeno poderia resgatar a apoptose em linhas celulares sensíveis hormonais (Figura 4A). Como Bim foi responsável pela anti-apoptose mediada Slug, determinou-se ainda mais a expressão do BIM em todas as células tratadas com DHT. Expressão do BIM permaneceu inalterada em células insensíveis androgénio e diminuiu significativamente em células sensíveis de androgénio (Figura 4B). Para melhor caracterizar o papel do Slug em anti-apoptose, foi aplicado siRNA contra a expressão Slug em todas as linhas de células (Figura 4C). O efeito inibitório foi proeminente excepto para 22RV1 célula, em que a actividade era constitutivamente Slug baixo, representando a sua menor capacidade metastática inerente (Figura 1A). Testamos ainda mais a atividade da caspase-3 seguinte Slug knockdown. Expressão de caspase-3 foi significativamente reduzida em 3 linhas celulares com Slug hiperactivo e manteve-se inalterada em 22RV1 células (Figura 4E). Em seguida, aplicada a combinação de rapamicina, CI-1040 e 17-AAG para as células não transfectadas para testar os efeitos sinérgicos. Surpreendentemente, a combinação resgatou o efeito anti-apoptótico de Slug iniciada por androgénio e de ROS em todas as linhas celulares, em que foram obtidos significados estatísticos para DU145, PC-3 e LNCaP (Figura 4F). Ao todo, Slug conferida efeitos anti-apoptóticos em células PCA através de inibição da Bim, caminho mais provável de ser activado nas células sensíveis hormonais com a presença de androgénio. A pan-bloqueio da mTOR /ERK /Hsp90 pareceu ser na inibição Slug, assim como ele é actividade a jusante.

A morte celular nas células CaP tratados com DHT em resposta a ROS simulado por H

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2 (A). O nível de expressão de Bim em células tratadas com CaP DHT (B). Knockdown de Slug com ARNsi (C) e o nível de ARNm do BIM em linhas celulares de CaP seguintes Slug knockdown (D). Mudança de Caspase 3 nível de mRNA em células CaP seguintes Slug knockdown (E). Efeito da combinação de rapamicina, 17-AAG e CI1040 em morte celular das células tratadas com CaP DHT e H

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2. (Erro bar = desvio padrão; n = 3 para cada grupo; * p 0,05; ** p 0,01).

Combinação de inibidores de mTOR /Erk /HSP90 reduz células CaP circulando

in vivo

CaP são muito mais propensas a metástases ósseas de outros órgãos, para o qual hematogénea metástase é pré-requisito. Nós assim estabelecida modelos animais para testar a combinação do efeito do fármaco in vivo. Em vez de estabelecer o modelo de osso metastático, que foi difícil de controlar as lesões metastáticas minimamente, procurou-se detectar células tumorais circulantes, perfilando a capacidade metastática do tumor primário. Nós estabelecido pela primeira vez modelos de xenotransplante com as linhas celulares 4, respectivamente. A fim de normalizar maximamente nível de androgénio, foi realizada em todos os ratinhos orquiectomia e injectados 200 ug de DHT no óleo de sésamo-etanol por via subcutânea em dias alternados. Os ratinhos foram injectados com 200 uL de uma solução 1,2 mg /ml de rapamicina diariamente (5 dias por semana). Os murganhos também foram tratados duas vezes por dia por injecção intraperitoneal (IP) de 100 mg /kg de CI-1040, enquanto 17-AAG (80 mg /kg /d em óleo de milho estéril) foi entregue por uma injecção ip por dia. Durante o tratamento, os pesos corporais de todos os ratinhos foram monitorizados para o acompanhamento da toxicidade. As Figuras 5A, B, C, D apresentou os pesos dos ratinhos implaneed com diferentes linhas celulares de CaP em diferentes tratamentos. Não houve mudanças significativas entre os tratamentos e os grupos de controle, indicando efeitos não-tóxicos dos tratamentos. Depois que o sangue havia sido colhida a tempo real quantitativa PCR revelaram que as células LNCaP foram os mais potentes na capacidade metastática enquanto 22RV1 células dificilmente metástase. A terapia tripla efetivamente controlada evasão tumoral no sistema de circulação no resto 3 linhas celulares em comparação com qualquer 2 drogas ou privação hormonal sozinho (controle) (Figura 5E). A seguir, destinada a estudar se a combinação afectados ancoragem capacidade de as células de tumor circulantes e que assim injectado células tumorais na circulação do rato. Após o tratamento com uma dose única de rapamicina e 17-AAG, e injecção duas vezes de CI-1040 como acima mencionado, o sangue foi colhido no ponto de tempo definido. Como mostrado na Figura 5B, a terapêutica tripla significativamente reduzida células tumorais circulantes. Combinação de rapamicina e CI-1040 alcançou efeitos semelhantes em relação à privação de andrógeno. Tomados em conjunto, não só demonstraram que a medicação triplo de inibição de mTOR /ERK /Hsp90 reduzida capacidade metastática do tumor, mas também demonstrou que tal terapia direcionada esmagada a sensibilidade para androgénio das células. O inibidor foi consistente em células com ou sem sensibilidade hormonal e independentemente da presença de andrógenos (Figura 5F).

tendência de mudança de peso durante o período de tratamento em todos os 4 ratos xenoenxerto de células CaP (A-D). Circulating quantificação do DNA CaP em modelos de murganho de xenoenxerto implantado com 4 linhas de células APC e tratada com diferentes combinações de drogas (E). Circulating CaP ADN quantificação 24 h após a injecção venosa de células APC nos ratinhos que receberam um único tratamento de combinações de fármacos (F). (Erro bar = desvio padrão; n = 6 para cada grupo; * p 0,05; ** p 0,01).

Discussão

O combate à CaP continua sendo um grande saúde problema, especialmente para pacientes com doença em estágio avançado, para quem a terapia-alvo pode trazer esperança. Aqui nós demonstramos que a terapia alvo combinada contra Slug é eficaz em modelos CaP metastático. Com base na literatura anterior e nossos resultados, podemos concluir as diferentes características das células APC, que podem beneficiar futuros estudos para estabelecimentos de modelo adequado (Figura 6A). Mais importante, nós pode propor que Slug está situado na convergência do Erk via mTOR //HSP90-AR e, portanto, está respondendo mais à combinação em vez de monoterapia (Figura 6B). Bloqueando o up-stream de Slug, a inibição da capacidade metastática deve beneficiar diretamente de activação E-caderina. E-caderina é uma proteína de adesão célula-célula dependente de cálcio e funciona como um supressor de tumor. A perda de expressão ou função de E-caderina é um evento comum na progressão tumoral [9]. A regulação negativa da E-caderina é o alvo-chave do epitelial para mesenquimal (EMT) moduladores, que é conhecido para desmantelar junções célula-célula medicado-caderina e essencial para o desenvolvimento embrionário, a progressão do cancro, e a resistência à quimioterapia [10,11] . Por causa de seu papel crucial na EMT, E-caderina exige um controlo apertado no câncer. Assim, na maior parte dos cenários de cancro, a expressão de E-caderina é suprimida ao nível da transcrição. Várias vias pró-tumorigênicos, tais como MAPK /ERK e PI3K /Akt /mTOR, e Hsp90 /AR, participam na regulação EMT [12,13], e todos compartilham um ponto final comum: a ativação de uma série de fatores de transcrição que reprimir diretamente E-caderina. Vários fatores de transcrição foram identificados que suprimir a E-caderina incluindo Caracol, Lesma, Twist and ZEB1 através da sua interacção com o sítio de ligação de E-box no promotor E-caderina [14,15].

Profiling do células PCA é com base neste estudo com base em nossos resultados e relatos da literatura (a). O padrão esquemática que mostra como a combinação do efeito de drogas através da segmentação da via relacionada com a Slug Slug, onde está situado na zona central (B).

A via PI3K /Akt /mTOR via de sinalização é bem documentada para ser frequentemente desregulado e serve como uma via oncogénica em vários tipos de carcinomas [16]. Tem sido bem estabelecido que a via de sinalização de mTOR regula a síntese de proteínas em resposta a vários factores de crescimento e, por conseguinte, afecta tanto a sobrevivência das células e proliferação de células [17]. No presente estudo, a inibição de PI3K /Akt /mTOR, por rapamicina, parcialmente abolida HIF-1α-induzida do caracol e os níveis de expressão do Slug de curta duração, sugerindo expressão Slug pode ser regulada por via PI3K /Akt /mTOR sinalização [18, 19]. A activação da via PI3K /Akt sinalização foi encontrado para estimular caracol e espaçador através de expressão de GSK-3β sinalização /β-catenina e posteriormente sub-regular a E-caderina em diferentes contextos celulares [20]. Os dados atual suporta um papel crucial para o PI3K Akt HIF-1α ///mTOR sinalização na mediação do Slug-regulação da E-caderina em CaP. No entanto, a inibição prolongada da mTOR por rapamicina exibida diminuiu a regulação negativa da pastilha, o que é indicativo de uma via resistente a ser activado.

Como evidência emergente sugere que tanto a MAPK /ERK e PI3K /Akt percursos estão envolvidos na regulação da caderina-E, examinamos a ativação Erk e são surpreendidos ao descobrir que de bypass com contas Erk para o resistência à inibição de mTOR para lesma. Em células de cancro da próstata, Slug-dependente sobre-regulação foi mostrado para regular negativamente a expressão de E-caderina através da via de sinalização /ERK MAPK [21]. Caracterizado activated protein quinase de mamífero (MAPK) membros da via são divididos em três subfamílias principais; sinal extracelular regulado da cinase 1/2 (ERK 1/2), MAPK p38 e c-Jun N-terminal quinase (JNK); Conservado através da evolução, a via de sinalização ERK 1/2 é organizado em uma cascata de fosforilação de três quinase envolvendo Raf (ou MAPK quinase quinase), MEK (ou MAPK quinase) e ERK 1/2 (ou MAPK) [22,23] . A activação de ERK 1/2 em resposta a uma variedade de estímulos externos pode promover a expressão de genes específicos por meio de fosforilação de diversos factores de transcrição, tais como Elk-1 [24]. Devido à proximidade da via mTOR, Erk é muito provável que ser desviado quando a atividade da mTOR é inibida, como mostrado em nosso estudo. Portanto, a inibição das vias de MAPK /ERK, por Cl-1040 poderia ambos utilizados como uma terapia independente e como um sensibilizador para a rapamicina.

proteínas de choque térmico 90 (Hsp90) consistem de uma família altamente conservadas de proteínas que são necessários para a tolerância ao stress em células vivas. Hsp90 é uma chaperona molecular ubíqua, encontrada a ser sobre-expresso em uma variedade de cânceres, incluindo câncer de próstata, que é único entre os chaperones moleculares, como a maioria dos seus substratos conhecidos são proteínas de transdução de sinal [25]. Entre as suas proteínas clientes são os factores de transcrição, reguladores do ciclo celular, quinases de sinalização, mediadores de apoptose, assim como receptores de hormonas esteróides, tais como o receptor de androgénio (AR), que têm papel crítico na carcinogénese da próstata e na progressão para HRPC [26] . Além disso, a AR estimula o crescimento de HRPC através de um número de mecanismos que dependem intimamente Hsp90 para a sobrevivência celular, particularmente sobre-expressão de AR e de ganho de função mutações do gene de AR [27]. Portanto, visando Hsp90 é uma abordagem anticancerígeno particularmente atraente para o câncer de próstata. A acção inibidora de inibidores de Hsp90 ampla parece ser eficaz em células que expressam variantes de splicing de AR, que são destituídos do domínio de ligação do ligando e, por conseguinte, resistente aos antagonistas do AR convencional [28]. A primeira classe de inibidores de Hsp90 foi examinada análogos de geldanamicina, especificamente 17-alilamino-17-desmetoxi-geldanamicina (17-AAG).