Abstract

células cancerosas do colo do útero geralmente abrigam um G defeito

1 /S checkpoint devido à interação de oncoproteínas virais com p53 e proteína do retinoblastoma. A activação de G

2 checkpoint /M pode assim tornar-se essencial para a protecção de células de cancro a partir de insultos genotóxicos, tais como quimioterapia. Em 52 pacientes com câncer cervical tratados com quimioterapia neoadjuvante, nós investigamos se os níveis de fosforilada Wee1 (pWee1), um G tecla

2 /M checkpoint quinase, e γ-H2AX, um marcador de DNA quebras de cadeia dupla, discriminação entre pacientes com uma resposta patológica completa (pCR) e aqueles com doença residual. Nós também testamos a associação entre pWee1 e Chk1 fosforilada (pChk1), uma quinase agindo a montante Wee1 no G

2 /M via checkpoint. pWee1, γ-H2AX e pChk1 foram avaliados retrospectivamente em biópsias de diagnóstico por imuno-histoquímica. Os graus de expressão pWee1 e pChk1 foram definidos usando três diferentes métodos de classificação, ou seja, a intensidade da coloração, pontuação Allred, e uma pontuação multiplicativa. y-H2AX foi analisada tanto como variável contínua e categórica. Independentemente da classificação utilizada, os níveis elevados de pWee1 e γ-H2AX foram significativamente associados com uma menor taxa de PCR. Na análise uni e multivariada, pWee1 e γ-H2AX foram ambos associados com a redução da PCR. A validação interna realizada através de um re-amostragem, sem procedimento de substituição confirmou a robustez do modelo multivariada. Finalmente, encontramos uma associação significativa entre pWee1 e pChk1. A mensagem transmitida pelo presente análise é que os biomarcadores de danos e reparação do ADN pode prever a eficácia da quimioterapia neoadjuvante em câncer cervical. Mais estudos são necessários para validar prospectivamente estes resultados encorajadores

Citation:. Vici P, Buglioni S, Sergi D, Pizzuti L, Di Lauro L, Antoniani B, et al. (2016) danificar o DNA e Reparação Biomarkers em cervicais pacientes com câncer tratados com quimioterapia neoadjuvante: Uma análise exploratória. PLoS ONE 11 (3): e0149872. doi: 10.1371 /journal.pone.0149872

editor: Yanchang Wang, Universidade Estadual da Flórida, Estados Unidos

Recebido: 03 de dezembro de 2015; Aceito: 07 de fevereiro de 2016; Publicação: 01 de março de 2016

Direitos de autor: © 2016 Vici et al. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Licença Creative Commons Attribution, que permite uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o autor original ea fonte sejam creditados

Data Availability:. Todos relevante os dados estão dentro do papel

financiamento:.. os autores não têm apoio ou financiamento para relatar

CONFLITO dE iNTERESSES:. os autores declararam que não existem interesses conflitantes

abreviações : ATM, Ataxia-telangiectasia mutada; ATR, ataxia telangiectasia e proteína relacionada com Rad3; Chk1, Checkpoint quinase 1; Chk2, Checkpoint quinase 2; DDR, DNA danos resposta; DSB, ruptura de fita dupla; pCR, a resposta patológica completa; pChk1, hosphorylated Chk1; y-H2AX, fosforilada histona H2A membro da família de X; pRb, proteína de retinoblastoma; pWee1, fosforilada Wee1; Wee1, proteína quinase Wee1-like

Introdução

As células eucarióticas estão constantemente expostos a fontes endógenas e exógenas de danos no DNA. A transmissão de ADN intacto para a descendência é assegurada por uma rede molecular complexa, a resposta a danos no ADN (RDA), que opera por meio da actividade coordenada dos pontos de verificação do ciclo celular, os mecanismos de reparação de ADN e vias apoptóticas [1, 2]. A presença de lesões genéticas desencadeia prisão mediada por checkpoint do ciclo celular [2]. Este evento permite efetores de reparação do ADN e vias apoptóticas para reparar a lesão ou eliminar células irremediavelmente danificados, respectivamente.

As células cancerosas aberrante usar mecanismos de reparo do DNA para sobreviver a condições estressantes, como a exposição à quimioterapia [2]. Uma característica comum a uma variedade de tumores, é a irregularidade da L um ponto de verificação

/fase S, resultante da inactivação mutacional ou funcional de p53 ou proteína do retinoblastoma (pRb) [3]. Quando isto ocorre, as células de cancro tornaram-se extremamente dependente da L

2 /H ponto de verificação para a paragem do ciclo celular e a reparação do ADN [3]. A proteína ataxia telangiectasia e relacionados com Rad3 (ATR) -Checkpoint quinase 1 (Chk1) -Wee1-como proteína cinase (Wee1) representa o núcleo de cascata de G

2 /H do ponto de verificação, cuja activação conduz à inibição da -ciclina dependente de quinase 1 e culmina na parada do ciclo celular mediada por checkpoint [3]. Em tal forma, as células cancerígenas têm tempo para corrigir lesões do ADN induzidas por quimioterapia, evitando a entrada em mitose um letal conhecido como catástrofe mitótica [4]. L

2 /dependência do ponto de verificação M em um fundo molecular p53 defeituosa é um conceito actualmente explorado para o desenvolvimento clínico de terapias à base de letalidade sintéticos. Quando G

1 /S-phase checkpoint células-defeituosos estão expostos a agentes quimioterapêuticos, a inibição farmacológica concomitante de G

2 checkpoint /M quinases é deletério para a aptidão de células [3].

Nós fundamentado que G

2 /M checkpoint “vício” para compensar defeitos de p53 ou pRb após a exposição a agentes genotóxicos podem ser explorados na busca de biomarcadores preditivos prevendo sensibilidade quimioterapia /resistência. Nesta análise exploratória nos concentramos sobre o câncer do colo do útero, o protótipo de tumores p53 e pRb-defeituosos. Com efeito, vírus do papiloma humano E6 e E7 oncoproteínas promover a degradação mediada por ubiquitina do p53 e pRb, respectivamente [5]. assim, retrospectivamente, investigou a associação entre os níveis de danos no DNA e reparação biomarcadores, avaliada em amostras bioptic coletadas de pacientes não tratados no momento do diagnóstico, e patológica resposta completa (PCR) após a quimioterapia neoadjuvante, ou seja, a quimioterapia entregues dentro do prazo entre o diagnóstico biópsia e ressecção cirúrgica. Todos os pacientes foram tratados de forma homogénea com o paclitaxel, ifosfamida e cisplatina (regime de ponta). Estamos focados em fosforilada Wee1 (pWee1) como um proxy de G

2 /M activação posto de controle, e os fosforilada Família histona H2A X (γ-H2AX) como um marcador de DNA quebras de cadeia dupla. Fosforilada Chk1 (pChk1) foi testado em uma fração de amostras para um estudo de sinalização.

Materiais e Métodos

Os participantes do estudo e Procedimentos

Cinquenta e dois confirmados histologicamente pacientes com câncer cervical (estágio Ib2-IIIa) que receberam quimioterapia neoadjuvante foram incluídos nesta análise retrospectiva. Todos os pacientes foram tratados com o regime de TIP (paclitaxel 175 mg /m

2 no dia 1 + ifosfamida 2500 mg /m

2 nos dias 1 e 2 + cisplatina 50 mg /m

2 no dia 2 cada 21 dias para três ou quatro ciclos) seguido por uma cirurgia radical. Os pacientes foram considerados elegíveis se eles completaram o tratamento previsto, os dados sobre as características clínicas e os resultados do tratamento estavam disponíveis, ea quantidade de materiais biológicos em suas biópsias foi suficiente para análises moleculares. A PCR foi definida como ausência de doença residual em amostras cirúrgicas. A avaliação imuno-histoquímica de pWee1, γ-H2AX e pChk1 foi realizado em tecidos embebidos em parafina fixadas em formalina (FFPE), obtido a partir dos espécimes biológicos recolhidos através de procedimentos bioptic em pacientes não tratados, utilizando os seguintes anticorpos: anti-fosfo-H2AX ( Ser139) (JBW301 clone) anticorpo monoclonal de ratinho (MAb) (Upstate, NY, EUA) a uma diluição de 1: 500, anti-fosfo-Wee1 (Ser642) (clone D47G5) de coelho de MAb (Cell Signaling, Danvers, MA, EUA ) na diluição de 1: 100, e anti-fosfo-Chk1 (Ser345) (clone 133D3) MAb coelho (Cell Signaling, Danvers, MA, EUA) a uma diluição de 1: 100. coloração imuno-histoquímica foi realizada em um Autostainer automatizado (BOND-III, Leica, Milão, Itália) por um polímero peroxidase livre de biotina (HRP) ligante sistema de anticorpo conjugado (Leica, Milão, Itália). Para cada tumor, três, 3 uM diferentes secções de parafina foram analisados ​​e examinados por microscopia de luz. Imunorreacção de células tumorais foi contado em quatro campos de alta potência (aumento de 400X) por seção. pWee1 pChk1 e foram consideradas positivas quando ≥10% das células neoplásicas mostraram uma imunorreactividade nuclear distinta. pWee1 e pChk1 foram classificados em uma escala de quatro grau baseado em intensidade de coloração (0: negativo, 1+: fraco, 2+: moderada, 3+: forte). Os tumores foram classificados como negativo (0 = pWee1

neg e pChk1

neg) ou positivo (1-3 = pWee1

pos e pChk1

pos) foram obtidas pontuações .A Allred como descrito anteriormente [6 ], considerando intensidade de coloração e a percentagem de células que expressam tumorais, e relatados de acordo com uma escala de 0 a 8. os tumores foram classificados como de baixo expressar se a pontuação Allred foi ≤ 2 (pWee1

Allred baixa, pChk1

allred baixo), ou tão alto expressar se a pontuação Allred foi 2 (pWee1

Allred alta, pChk1

Allred alta). As pontuações multiplicativos foram obtidas multiplicando a intensidade da coloração x a percentagem de células que expressam tumores e foram expressos em uma escala de 0 a 300. Os tumores foram classificados como de baixo expressando (pWee1

Multi baixa e pChk1

Multi baixo) ou alta expressando (pWee1

Multi alto e pChk1

Multi alta) usando a pontuação média de todos os tumores como ponto de corte. γ-H2AX expressão foi considerada como a percentagem de células que expressam tumorais e analisados ​​tanto como contínuo (γ-H2AX

cont) e como variável categórica, cuja modalidade foi definida pelo escore mediano de todos os tumores (γ-H2AX

baixa e γ-H2AX

alto). amostras de tumor foram avaliadas independentemente por dois investigadores (SB e MC), que foram cegos para os resultados do tratamento, e os casos discordantes foram revistos (MM). Este estudo retrospectivo foi realizado em conformidade com a Declaração de Helsinki e foi aprovado pelo Comitê de Ética da “Regina Elena” National Cancer Institute de Roma, o centro de coordenação. consentimentos informados por escrito foram garantidos antes da quimioterapia.

A análise estatística

Câncer e recursos relacionados ao paciente foram descritiva caracterizado por todos os pacientes incluídos na presente análise. Medianas e os intervalos foram usadas para informar sobre as variáveis ​​contínuas, e as variáveis ​​categóricas foram expressas por meio de freqüências e valores percentuais. A fim de avaliar as relações entre as variáveis ​​categóricas teste do qui-quadrado de Pearson da independência (2 caudas) e foram utilizados o teste exato de Fisher. O uso de modelos de regressão logística univariadas ajudaram a identificar variáveis ​​potencialmente afetando o resultado do tratamento. modelos de regressão logística multivariada foram construídas através da inclusão de variáveis ​​testando significativa na avaliação univariada ou identificados com base na plausibilidade clínica do seu papel em influenciar PCR. Para estimar o risco de um modelo multivariado overfitted e examinar a sua estabilidade, uma validação interna foi levada a cabo usando um procedimento de re-amostragem, sem reposição. Para este fim, uma centena de conjuntos de dados foram gerados aleatoriamente, removendo aproximadamente 20% da amostra original. Para cada simulação, que repetiu o modelo de regressão logística multivariada e coeficiente Kappa de Cohen, o valor preditivo positivo (PPV), o valor prognóstico negativo (NPV), Sensibilidade e Especificidade foram calculados. Foram considerados valores estatisticamente significativos p inferior a 0,05. As análises estatísticas foram realizadas utilizando o software SPSS (SPSS versão 21, SPSS Inc., Chicago, IL, EUA).

Resultados

As características basais dos 52 pacientes incluídos no estudo estão resumidos na tabela 1. O tempo médio entre a biópsia de diagnóstico e cirurgia radical foi 4,99 meses [IQ Range: 4,01-5,83]. Todas as amostras de pré-quimioterapia, que consistem em biópsias de diagnóstico, foram examinados para pWee1 e γ-H2AX, enquanto que estavam disponíveis para 37 amostras de dados pChk1. porcentagens medianas de células nucleares expressando para pWee1, pChk1 e γ-H2AX foram de 40% (min /max 10/80), 30% (min /max 10/80) e 30% (min /max 0/80), respectivamente . padrões de coloração imuno-histoquímica representativos são ilustrados na figura 1. Como mostrado na Tabela 2, encontramos uma associação estatisticamente significativa entre a expressão pWee1 nuclear elevada e reduzida taxa de PCR. A associação testado significativa para todos os métodos de pontuação investigado (pWee1

pos vs pWee1

neg, p = 0,016; pWee1

Allred alta vs pWee1

Allred baixo, p = 0,016; pWee1

Multi alta vs pWee1

Multi baixo, p = 0,034) (Tabela 2). Da mesma forma, níveis elevados de nucleares γ-H2AX foram associadas a reduzida taxa de PCR, tanto quando considerado como variável categórica e contínua (p = 0,037 e p ​​= 0,026 na Tabela 2 e Figura 2, respectivamente). Ao considerar a combinação dos dois marcadores, apenas 1 paciente de 16 anos com tumores positivos duplos sofreu uma PCR, 9 de 16 doentes com tumores negativos duplos alcançar uma PCR, e um resultado intermédio foi observada em pacientes cujos tumores expresso apenas um biomarcador (p = 0,009) (Tabela 3). Seis dos 8 mortes foram observados em tumores duplamente positivas (p = 0,013) (Tabela 3). No modelo de regressão logística univariada, pWee1 e γ-H2AX foram diretamente associadas com a PCR (pWee1

pos vs pWee1

neg: Odds Ratio (OR) 5,31, 95% Intervalo de Confiança (IC): 1,42-19,87, p = 0,013; y-H2AX

alta vs γ-H2AX

baixo: OR 4,20, 95% CI: 1,13-15,59, p = 0,032, respectivamente) (Tabela 4); o modelo multivariado confirmou o papel preditivo de pWee1 e γ-H2AX (Tabela 4). A validação interna realizada através de um procedimento de re-amostragem confirmou a robustez do modelo multivariada. Concordância, valor preditivo positivo, valor preditivo negativo, sensibilidade e especificidade são apresentados na Tabela 5. Finalmente, ao investigar padrões de co-expressão, nós não observamos associação entre pWee1 e γ-H2AX (dados disponíveis a pedido), enquanto que um estatisticamente associação significativa foi relatada entre pWee1 e pChk1 (Fig 3).

Três secções consecutivas para cada tumor são mostrados. (AC) Um tumor positivo triplo com nuclear γ-H2AX (A), pWee1 (B) e pChk1 (C) imunorreactividade. (DF) Um tumor que não expressam γ-H2AX (D), e que pWee1 co-expressa ( e) e pChk1 (F). (GI) Um tumor expressando expressão (I) nuclear γ-H2AX (G) que faltava tanto pWee1 (H) e pChk1

Na figura:. A linha horizontal superior da caixa é o 75º percentil; a linha horizontal inferior da caixa é o percentil 25; a barra horizontal dentro da caixa é o valor médio; a barra horizontal superior fora da caixa é o valor máximo; barra inferior horizontal fora da caixa é os valores mínimos.

(A) Associação de acordo com a coloração classificação baseada em intensidade (positivo vs negativo). (B) de acordo com a Associação Allred marcar classificação (alta vs baixo). (C) Associação de acordo com a classificação do escore multiplicativo (alta vs baixo).

Uma centena de conjuntos de dados de simulação menos movidos foram gerados, cada um cerca de 80 % do tamanho original.

Discussão

no presente estudo, retrospectivamente explorou o significado preditivo de expressão pWee1 e γ-H2AX, avaliado em biópsias de diagnóstico relacionados com 52 pacientes com câncer cervical que recebido quimioterapia neoadjuvante. Também foi investigada a associação entre pWee1 e pChk1, a fim de fornecer pistas sobre se a ativação Wee1 no cancro do colo do útero é mediada por Chk1. Para nosso conhecimento, este é o primeiro estudo relatórios sobre danos ao DNA e reparação biomarcadores em câncer cervical que exploraram o conceito de natureza defeituosa do G

checkpoint 1 /S-fase. No geral, observou-se uma associação estatisticamente significativa entre a expressão elevada de pWee1 e γ-H2AX e taxa reduzida de PCR. Assim, nós fornecemos primeiros indícios de que a expressão elevada de biomarcadores DDR em amostras de diagnóstico podem ser associados com eficácia subóptima da quimioterapia, avaliada através de PCR em tumores cirurgicamente ressecados. Observamos também uma associação positiva entre pWee1 e expressão pChk1 que sugere G

2 /M activação do ponto de verificação eficaz. Estamos cientes de que nossos resultados são gerador de hipóteses de natureza dado o caráter retrospectivo do estudo. . No entanto, para além da abordagem analítica simples, nosso estudo tem alguns pontos fortes importantes

Em primeiro lugar, a definição neoadjuvante oferece múltiplas vantagens para a identificação e desenvolvimento de biomarcadores de câncer: i) a análise de potenciais marcadores em um fundo molecular não “poluída” pela exposição de tratamentos anticancerígenos anteriores, ii) a identificação de marcadores preditivos para selecionar os pacientes que mais provavelmente beneficiar de quimioterapia, iii) a identificação de biomarcadores, que também têm significado prognóstico, apesar de evidências sobre a associação entre pCR e os resultados de sobrevivência a longo prazo no cancro cervical não é tão robusto como no cancro da mama [7, 8].

em segundo lugar, até agora, no cancro do colo do útero a busca de biomarcadores preditivos ligados ao aumento da capacidade de câncer células para proteger seu genoma quando desafiado com quimioterapia ou radioterapia tem sido focada exclusivamente em proteínas de nucleotídeos de reparação de excisão (NER), e em particular sobre a reparação de excisão cross-complementação grupo1 proteína (ERCC1) [9-13]. NER é delegada para corrigir lesões que distorcem hélice volumosos, como os causados ​​à DNA por terapia à base de platina. No entanto, no contexto da DDR, NER é um dos diversos efectores distais designados para manter a integridade do genoma. Um certo número de redes moleculares salvaguardar o genoma, se bem que o seu envolvimento depende do tipo de lesão. vias de reparo de DNA também incluem base de reparo de excisão (BER), reparo mismatch (MMR), a reparação direta, ea ruptura de fita dupla (DSB) reparo de recombinação. Este último engloba a reparação sem erros recombinação homóloga (HRR) e a propenso a erros não homóloga-extremidade de união (NHEJ) [1]. Portanto, o nível de complexidade biológica da RDA pode ser subestimado quando se considera exclusivamente um, ou alguns, componentes co-instalados numa rede específica de reparação. Além disso, foram levantadas preocupações sobre a confiabilidade e importância biológica, dos métodos de detecção ERCC1 [14, 15]. Por outro lado, nosso estudo se concentrou em componentes DDR mestre, cuja ativação é conhecido por ser particularmente eficaz no cancro cervical.

Em seguida, temos a hipótese de que os níveis endógenos de danos no DNA, espelhado por γ-H2AX, deveria ter sido acompanhada por a expressão aumentada de pWee1 e pChk1.Even embora o eixo de ATR-Chk1-Wee1 é activado principalmente por esticada de ADN em cadeia simples, estas estruturas anormais podem gerar LAP sobre colapso do garfo de replicação [16]. Além disso, nós concluímos que a activação de G

2 /H do ponto de verificação deve ser particularmente eficiente na presença de elevados níveis basais de danos de ADN endógenas, que representa um mecanismo adaptativo por meio do qual as células cancerosas neutralizar o stress replicação induzida pelo oncogene [16] . Com efeito, sabe-se que a ATR e Chk1 suprimir a resposta apoptótica após estresse replicação de ADN [17], e que os tumores caracterizados por níveis elevados de stress replicativa, tais como cancros myc-motoras, são extremamente vulneráveis ​​à segmentação farmacológica de G

2 /M quinases de ponto de verificação [18-23]. Nós não observamos associação entre pWee1 e γ-H2AX, mas estes parâmetros foram associados de forma independente com a PCR. Podemos especular que duas avenidas de reparação independentes, particularmente eficientes no cancro cervical, foram capturados neste estudo. Um candidato adequado é a Ataxia-telangiectasia mutada (ATM) -Checkpoint quinase 2 (Chk2) via, que é activado principalmente por LAP [16]. Existe uma ampla cooperação entre a via ATM-Chk2 e sinalização ATR-Chk1-Wee1 e ATM também fosforila H2AX [16].

Outro aspecto emergente a partir deste estudo refere-se à associação entre pWee1 e expressão pChk1. Wee1 é colocada a jusante de Chk1 [3], e fosforilação Wee1 em Ser642 aumenta a sua estabilidade no núcleo e promove a paragem do ciclo celular em G

2 /H transição [24, 25]. No entanto, para a nossa prova formal conhecimento de que este mecanismo regulador, ou seja, a fosforilação Chk1-driven de Wee1 em Ser642, opera em células de mamíferos ainda está faltando. A evidência atual na maior parte provém de estudos usando

Xenopus

extratos e

Schizosaccharomyces pombe

como sistemas modelo [26, 27]. Mesmo que o nosso estudo não foi desenhado para gerar idéias mecanicistas sobre a dinâmica que regem a ativação Wee1, seus resultados fornecem uma sugestão para futuras investigações pré-clínicas.

Um último ponto que merece consideração refere-se ao papel protetor da G

2 /H de activação do ponto de verificação no contexto de cancro de células estaminais [28]. A activação do eixo tem sido associada com a resistência à terapêutica em modelos de células estaminais cancro diferentes, incluindo o cérebro, pulmão e cancro do cólon [29-31]. Multiplicando os esforços para o estabelecimento de um conjunto de células-tronco do câncer cervical derivado do paciente para a caracterização molecular abrangente é uma estratégia que deve ser perseguida para dissecar ainda mais a relação existente entre a G

2 /M activação ponto de verificação e recursos quimiorresistentes. A relevância desta abordagem é ainda mais evidente quando se considera a necessidade de modelos celulares e animais mais precisos em função do número de inibidores de Chk1 e Wee1 que entraram desenvolvimento clínico [3, 32]. Por exemplo, um estudo de fase I com o primeiro-in-class Wee1 inibidor AZD1775 (MK1775) em associação com a terapia com cisplatina e radioterapia está em curso (identificador ClinicalTrials.gov: NCT01958658), e uma fase I de ensaios /II em combinação com topotecano /resultados cisplatina como concluída (ClinicalTrials.gov Identificador: NCT01076400). Além disso, a I-II ensaio clínico de fase de AZD1775 em combinação com quimioterapia foi iniciada em pacientes com ovário TP53 mutado epitelial, trompa de Falópio, ou cancro peritoneal primário [33].

Conclusões

para resumir, expressão pWee1 andγ-H2AX nas amostras pré-quimioterapia mostrou capacidade de prever pCR, em pacientes com câncer cervical tratados com paclitaxel neoadjuvante, ifosfamida e cisplatina. Com base nos resultados extremamente promissores aqui apresentados validação prospectiva ou, alternativamente, análises moleculares complementares no contexto de estudos prospectivos é garantido para melhor caracterizar a capacidade preditiva desses biomarcadores.

Reconhecimentos

Agradecemos Tania Merlino para assistência técnica.