Abstract
Fundo
Mais de 100.000 produtos químicos estão em uso, mas não foram testados pela sua segurança. Para superar as limitações no bioensaio câncer de várias estratégias de ensaio alternativas são exploradas. A incapacidade de controlar o início de forma não invasiva e progressão da doença de limites, no entanto, o valor de estratégias de ensaio correntes. Aqui, nós relatamos a aplicação de
In vivo
de imagem para um modelo de rato transgénico c-Myc de cancro do fígado para o desenvolvimento de um bioensaio câncer de curto prazo.
Metodologia /Apreciação principais
μCT e
18F-FDG μPET foram usadas para detectar e quantificar a lesões de tumor após o tratamento com o carcinogénio genotóxico NDEA, o agente promotor de tumores BHT ou o paracetamol hepatotoxina. O crescimento do tumor foi investigado entre as idades de 4 a 8,5 meses e lesões hepáticas detectadas imagem μCT com contraste, bem como a propagação metastática com alta sensibilidade e precisão, como confirmado por exame histopatológico. diferenças significativas no início do crescimento do tumor, a carga tumoral e o metabolismo da glucose foram observados quando o grupo de tratamento com NDEA foi comparado com qualquer um dos outros grupos de tratamento. tratamento DEN de ratinhos transgénicos c-Myc acelerou significativamente o crescimento do tumor e causou a propagação metastática do CHC no pulmão, mas este tratamento também induziu o crescimento do câncer de pulmão primário. Em contraste, BHT e paracetamol não promoveu hepatocarcinogênese.
Conclusões /Significado
O presente estudo evidencia a precisão de
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de imagem para definir o crescimento do tumor, a carga tumoral, número de lesões ea propagação metastática. Por conseguinte, a aplicação da
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técnicas de imagem para modelos animais transgénicos permita, eventualmente, bioensaios de câncer de curto prazo para melhorar significativamente a identificação de perigos e follow-up exames de diferentes órgãos por métodos não-invasivos.
Citation: Hueper K, Elalfy M, Laenger F, Halter R, Rodt T, Galanski M, et al. (2012) PET /CT imagem de c-Myc Transgenic Mice Identifica o Genotóxico N-nitroso-Diethylamine como cancerígenas em um curto prazo Cancer Bioensaio. PLoS ONE 7 (2): e30432. doi: 10.1371 /journal.pone.0030432
editor: Martin W. Brechbiel, Instituto Nacional de Saúde, Estados Unidos da América
Recebido: 17 de julho de 2011; Aceito: 20 de dezembro de 2011; Publicação: 02 de fevereiro de 2012
Direitos de autor: © 2012 Hueper et al. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Licença Creative Commons Attribution, que permite uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o autor original ea fonte sejam creditados
Financiamento:. Peças de o trabalho foi financiado pelo Ministério da Ciência e da Cultura, Lower Saxony, Alemanha; número de concessão: 25A.5-76251-99-3 /00 a Juergen Borlak, um PHD-bolsa de estudos do Ministério egípcio do Ensino Superior para Mahmoud Elalfy, uma bolsa de investigação GE Healthcare dado ao Instituto Fraunhofer de Toxicologia e Experimental Medicine, Hannover , Alemanha e pela Fundação alemã de Pesquisa (DFG) para cobrir os custos de publicação. Notavelmente, os financiadores não tiveram nenhum papel no desenho do estudo, coleta de dados e análise, decisão de publicar ou preparação do manuscrito
CONFLITO DE INTERESSES:.. Os autores declararam que não existem interesses conflitantes
Introdução
O carcinoma hepatocelular (HCC) é frequentemente observada em bioensaios de câncer como resultado da exposição da vida a qualquer drogas experimentais ou uma gama diversificada de produtos químicos. Especificamente, carcinogéneos podem ser distinguidas pelo seu modo de acção, alguns dos quais exercem actividade quer através de dano de ADN e, portanto, são definidos como agentes cancerígenos genotóxicos, tais como N-nitrosodietilamina (NDEA), enquanto que outros não prejudicam o ADN, mas causam perturbações no processo biológico que, em última análise leva ao crescimento descontrolado e são chamados de agentes cancerígenos não genotóxicos. Este último grupo de substâncias cancerígenas é inerentemente mais difíceis de prever. Além disso, drogas e produtos químicos não pode ser por si só tumorigénico, mas promover o crescimento do tumor.
Além disso, enquanto o processo de avaliação da segurança dos produtos químicos é harmonizada a nível internacional, continua a ser caro e demorado. A fim de reduzir o tempo necessário para uma avaliação do risco carcinogénico de drogas e produtos químicos, novos modelos animais transgénicos têm sido desenvolvidos e saídas de leitura biológicas a partir de tais modelos são comparados com o bioensaio do cancro estabelecido. No entanto, os bioensaios de câncer comuns requerem um período de observação de 2 anos e utilizar um grande número de animais que são posteriormente submetidos a exames histopatológicos [1].
Para superar as limitações no bioensaio câncer de várias estratégias de ensaio alternativas estão sendo explorada, seja envolvendo animais geneticamente modificados,
in vitro
ensaios baseados em células ou modelos computadorizados [2] – [7]. A este respeito, animais de laboratório geneticamente modificadas podem revelar-se útil na detecção precoce de substâncias cancerígenas do fígado e, portanto, podem permitir estudos de carcinogenicidade de curto prazo. Até agora, diversos modelos de knock-out, bem como modelos de ratinhos transgénicos de carcinoma hepatocelular foram relatados [8]. Por exemplo, a resposta ao agente cancerígeno DEN genotóxico foi avaliado num [9], bem como no modelo de p53 deficiente rasH2 transgénico [10] – [12]. Infelizmente, ambos os modelos não conseguiram identificar DEN como um carcinógeno de fígado em bioensaios de curto prazo do cancro render esta estratégia menos robusto para a detecção de carcinogéneos específicos de órgãos com estes dois modelos genéticos.
Além disso, os ensaios de roedor padrão de carcinogenicidade é capazes de monitorizar de forma não invasiva aparecimento e progressão da doença. Assim, técnicas de imagem como a tomografia micro computadorizada (μCT) e tomografia por emissão de positrões micro (μPET) pode tornar-se um método de escolha em estudos pré-clínicos para detectar
In vivo
lesões tumorais e quantificar a carga tumoral.
In vivo
de imagem, assim, contribuir para o refinamento de bioensaios de câncer e oferecer informações adicionais, tais como uma identificação da propagação metastática e crescimento do tumor secundário em tempo hábil [13].
Na verdade, o avanço recente em tecnologias de imagem de pequenos animais encorajou-nos a examinar a utilidade de μCT e μPET para a detecção de lesões tumorais em um modelo de rato transgénico de câncer de fígado. Com essas tecnologias facilitadoras μCT possui uma resolução de estruturas anatômicas de cerca de 50 um, proporcionando informação morfológica considerável. Isto requer, no entanto, a utilização de um agente de contraste específico de órgãos para permitir a imagiologia da morfologia parenquimatoso. Notavelmente, o modelo de ratinho transgénico de c-Myc se desenvolve eficientemente cancro do fígado num curto período de tempo. Neste modelo genético, c-Myc está direccionada para o fígado através da utilização do promotor α1-antitrypsine que é activada exclusivamente no fígado. Este modelo foi desenvolvido originalmente por Dalemans et al. [14], mas não tem sido explorada para a sua utilidade em bioensaios de cancro a curto prazo, como ainda. Notavelmente, estudos de patologia molecular humanos identificados c-Myc como hiperativo e overexpressed na maioria de carcinoma hepatocelular humano [15], portanto, proporcionando um racional para uma avaliação deste modelo de doença.
Enquanto alguns relatórios descrevem a aplicação de imagens anatômicas e metabólicas de neoplasias primárias do fígado em roedores [16] – [19], o objetivo deste estudo foi, em primeiro lugar, para desenvolver estratégias e definir parâmetros para a detecção e quantificação de lesões hepáticas por
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com contraste μCT e
18F-FDG μPET de imagem metabólica da captação de glicose e em segundo lugar, para avaliar a precisão destes métodos, quando comparado com histopatologia e em terceiro lugar, para determinar a utilidade do modelo de rato transgénico c-Myc em prever com precisão o carcinógeno de fígado DEN em bioensaios de curto prazo e, portanto, para avaliar se uma combinação de
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modalidades de imagem e o uso de modelos genéticos do rato pode ajudar a desenvolver bioensaios de câncer de curto prazo para a detecção precoce de drogas perigosas e produtos químicos.
Materiais e Métodos
modelo de tumor Transgenic
Todos os trabalhos animais seguidas à risca a política de serviços de saúde pública sobre o cuidado humano e uso de animais de laboratório. A permissão para realizar o estudo foi obtido pelo animal ética do bem-estar comitê da cidade de Hannover, Alemanha (Tierversuchsvorhaben 33.9-42502-04-08 /1619).
c-Myc ratinhos transgénicos foram o dom tipo de Dalemans et ai. [14]. Os animais foram mantidos como homozigotos no fundo C57 /BL6 e este fundo é amplamente utilizado em modelos de doenças transgénicos, tais como o modelo rasH2 e p53 deficiente. Notavelmente o transgene (ver Figura S1) constituída por um quadro de leitura aberta de c-Myc e as sequências reguladoras do promotor α1-antitrypsine para permitir a expressão do gene específico do fígado de c-Myc. Este modelo de doença genética tem uma incidência de cancro do fígado de 100%
O transgene foi detectada por PCR utilizando o iniciador de sentido directo:. 5′-CACTGCGAGGGGTTCTGGAGAGGC-3 ‘e o iniciador inverso: 5′-ATCGTCGTGGCTGTCTGCTGG-3’ . Foram utilizadas as seguintes condições de ensaio de PCR: 15 min., 95 ° C, 1 min 60 ° C, 1 min 70 ° C, 1 min 95 ° C, 31 ciclos
ratinhos transgénicos No total, 120 c-myc estavam examinado pelo
in vivo
imagem e /ou histopatologia, enquanto que os controles não transgênicos foram estudados apenas por exame histopatológico, uma vez que estes animais não têm tumores. Os ratinhos foram mantidos como grupos de animais com 1-4 ratinhos por gaiola em serradura num ciclo de luz-escuro de 12 horas, e 50% de humidade relativa e uma temperatura ambiente de 22 ° C. Os animais receberam ração padronizada e água potável ad libitum (Zucht, ssniff M- /, 10 mm, dieta completa para os ratos, ssniff Especificações GmbH, DE-59494, www.ssniff.de).
Desenho do estudo e tratamento de animais com NDEA, hidroxitolueno butilado (BHT) e paracetamol
Os animais foram divididos em 7 grupos de 24 animais cada e consistiu de N = 12 do sexo masculino e 12 do sexo feminino n =. O tratamento de ratinhos transgénicos com injecção intraperitoneal de NDEA, BHT ou paracetamol (Sigma Aldrich, Alemanha, com uma pureza de 99%), foi iniciada com a idade de 2 meses. A os animais de controlo não transgénicas transgénico e também foram tratados apenas com o veículo, isto é, óleo de milho ou solução salina fisiológica (Sigma Aldrich, Alemanha). NDEA ratos foram tratados uma vez por semana por injecção de 75 ug /g NDEA em solução salina ao longo de um período de 6 semanas, enquanto os animais que receberam 300 ug /g de BHT em óleo de milho foram tratados uma vez por semana durante 8 semanas. Além disso, 100 ug /g de paracetamol em solução salina serviu como um hepatotoxina não-carcinogénico e essa droga foi administrado uma vez por dia durante 5 dias por semana durante um período de 8 semanas (ver Tabela 1 para o regime de dosagem).
Como ratinhos C57BL /6 são resistentes ao hepatocarcinogenese induzido por NDEA [9] um grupo de tratamento não-transgénica NDEA e BHT não foi incluído no desenho do estudo é de considerável interesse que uma semelhante falta de sensibilidade foi relatada para p53 deficiente e de camundongos transgênicos rasH2 /CB6F1 que foram criados no mesmo C57BL 6 fundo /[11]. Do mesmo modo, demonstrou-se anteriormente que o BHT melhora a formação de tumores apenas se administrado após a exposição ao uretano agente genotóxico, mas não tem efeito sobre a sua ona [20] ou é mesmo de protecção, se for dado antes cancerígena [21], [22]. Um resumo do programa de tratamento é dado na Tabela 1.
A selecção das doses
Com base em dados publicados anteriormente, em que diferentes doses de DEN foram investigados (intervalo de dose de 75 a 200 mcg /g) para causa a formação de tumores em roedores não transgénicas [23], [24], [25], [26], uma dose de 75 ug /g de peso corporal foi seleccionada e administrada uma vez por semana durante 6 semanas, por administração intraperitoneal. No caso de BHT foi administrada uma dose de 300 ug /g de peso corporal. Esta dose foi relatado para causar a indução de tumor no fígado [20]. Finalmente, o paracetamol serviu como hepatotoxina não-carcinogénico e uma dose de 100 ug /g de peso corporal foi dado i.p. uma vez por dia durante 5 dias por semana durante um período de 8 semanas
In vivo de imagens de animais transgênicos por μCT e μPET
em quatro momentos diferentes – ou seja, com a idade de 4, 5,5, 7 e 8,5 meses –
in vivo
μCT e μPET de imagem foram empregados; os animais foram sacrificados depois para histopatologia.
Todos os procedimentos de imagiologia foram realizadas sob anestesia de inalação com isoflurano (Isoba veterinário., Essex Pharma, Alemanha) a uma concentração de 4% para a indução da anestesia e 1-2% para manutenção . Os ratos foram colocados em decúbito ventral sobre uma cama de temperatura controlada a 39 ° C (T /Pump, Gaymar, Orchard Park, NY, EUA), que permite mudanças entre modalidades de imagem sem reposicionamento e isoflurano foi fornecido através de um cone do nariz (Summit Anestesia Solutions, dobre , OR, EUA). A respiração dos animais foi espontânea, e a respiração foi monitorada continuamente por meio de um transdutor de pressão pequena (Biovet, imagiologia m2m, Newark, NJ, EUA). A respiração foi mantida a uma taxa de entre 60 e 100 por minuto. Após a aquisição de dados da imagem o tempo de recuperação dos animais da anestesia era geralmente inferior a cinco minutos. Em geral, os procedimentos foram bem toleradas.
Especificamente, μCT sequencial e
18F-FDG μPET foram realizadas com um total de 60 animais, como mostrado na Tabela 1. Os ratinhos foram fotografadas com a idade de 4 ( 1º sacrifício), 5,5 (2ª sacrifício), 7 (3ª sacrifício) e 8,5 meses (4 sacrifício). Os animais de controlo transgénicos foram examinadas com a idade de 8,5 meses única (4 Sacrifício), embora alguns imagiologia de contraste exploratória foi realizada com a idade de 2, 5 e 7 meses. Todos os animais foram sacrificados 2 dias após a imagiologia de PET. Neste momento, o marcador radioactivo desceu para abaixo do nível de detecção. Os achados de imagem foram corroborados por histopatologia padrão como detalhado abaixo.
contrastada imagem μCT
Todos os animais foram mantidos em jejum antes da imagem durante cerca de 6 horas. Três horas antes da tomografia computadorizada ratos anestesiados receberam uma injecção intravenosa de um agente de contraste iodado específico do fígado (DHOG, Fenestra LC, ARTE Inc., Saint-Laurent, Canadá) a um volume de cerca de 200-300 ul (10 ul /g de peso corporal) na veia da cauda. A aquisição de dados de imagem foi realizado como recomendado pelo fabricante e protocolos publicados anteriormente [18], [19].
A digitalização μCT foi feito com um animal scanner de tomografia de alta resolução pequena computadorizada (Explorar Locus, GE Healthcare, Chalfont St. Giles, UK). Os parâmetros de digitalização foram definidos como segue: tensão de tubo de 80 kVp, Tube Corrente 450 mA, número de aquisição de 360, número de visualizações 720, o tempo de exposição de 100 ms, uma média por quadro, axial campo de visão 33 mm. Os exames foram gravados sem gating respiratório. duração da verificação total foi de cerca de 12 minutos.
Os dados de imagem foi reconstruída usando um algoritmo de feixe cônico em um cluster linux 8-node. O tamanho voxel resultante do conjunto de dados isotrópico foi de 45 mm. valores de atenuação arbitrárias foram convertidos para a escala Hounsfield usando um fantasma de calibração com inserções de água, ar e osso.
μPET imagem
ratos anestesiados receberam uma injecção intraperitoneal (ip) de 10 MBq (
18F) -2-fluoro-2-desoxiglucose em um volume total de 50-100 ul de solução salina isotónica estéril, fornecido pelo Departamento de Medicina Nuclear, Hannover Medical School, Alemanha. Os animais foram submetidos a CT sequencial e imagiologia de PET que necessitou de múltiplas injecções na veia da cauda de possíveis lesões vasculares causa e embolização no local da injecção. Como i.v. tomografias necessário administração de Fenestra (veja acima)
18F-FDG foi dada por i.p. injecção. Isso pode atrasar a aquisição padrão de FDG, no entanto, não influenciou a interpretação geral dos dados, com a captação de glicose sendo proporcional ao crescimento do tumor como evidenciado no presente estudo. Portanto, depois de aquisições de imagem CT
18F-FDG foi administrado a ratos por injecção i.p. injecção. Os animais permaneceram anestesiados e após cerca de 35 min foram transferidos na mesma cama /posição do scanner CT para o aparelho de PET. Imagens estáticas foram adquiridos exatamente após 45 minutos da injeção do marcador usando uma câmera de alta resolução PET pequenos animais (Explorar Vista, GE Healthcare, Chalfont St. Giles, UK). tempo de aquisição total foi de 30 minutos para uma única posição de cama. As imagens foram corrigidas para eventos aleatórios e dispersão antes da reconstrução com um 3D-FORE algoritmo iterativo /2D-OSEM. Não foi utilizado nenhum correção de atenuação.
Imagem análise
μCT conjuntos de dados foram visualizados e analisados utilizando os pacotes de software Microvisão 2.2 (GE Healthcare, Chalfont St. Diles, UK), MeVisLab 2,0 (MEVIS Medical Solutions AG, Bremen, Alemanha) e OsiriX (v.3.7.1 de 32 bits, Pixmeo Sarl). O volume total do fígado foi calculada usando o módulo LiveWireMacro (MeVisLab 2.0), que utiliza um método de segmentação semi-automático com base em contorno. lesões hepáticas focais foram contados e quantificada por 2D-medição do maior diâmetro. O diâmetro (d) das lesões foi utilizado para estimativa do volume tumoral pela fórmula: volume do tumor (V) = 1/6 × π × d
3. Os volumes de todas as lesões hepáticas foram adicionados para determinar o volume total do tumor. A percentagem de tumores do fígado foi calculada como a razão entre o volume total do tumor (ml) e o volume do fígado total (ml).
registo rígida de conjuntos de dados de PET e CT foi baseado em estruturas anatómicas e usado para gerar conjuntos de dados fundidos. Regiões de interesse (ROI) foram definidas manualmente para lesões hepáticas focais de um diâmetro superior a 5 mm, como detectado em μCT e
18F-FDG μPET imagem. O sinal de fundo (não tumorais) foi determinado pela colocação de um ROI no parênquima do fígado livre de tumor e a contagem máxima por unidade de volume foi determinado para cada ROI para estimar as razões tumor para não-tumor.
histopatologia
Dois dias após a última ratos de imagem foram sacrificados eo fígado e pulmão foram removidos para exame histopatológico. Os pulmões e os fígados inteiros foram imersos em tamponada com formaldeído a 4% e embebidos em parafina por meio de processos laboratoriais padrão. Subsequentemente, foram preparadas secções de 4-5 ^ M dos blocos espaçados com um intervalo de 500 mm a partir do núcleo central do tecido embebido e coradas com H E. Essas lâminas foram examinadas usando um microscópio Olympus BX51 com um 40 × ampliação original. 4 achados morfológicos diferentes foram gravados: 1) parênquima hepático normal, conforme definido pelo tamanho da célula e preservação da arquitetura, 2) difusa lesão tóxica do parênquima hepático, tal como definido pelo balão, degeneração, mas preservação da arquitetura, 3) nódulos displásicos com agregados nodulares das células do fígado aumentados com displasia celular de baixo grau, 4) carcinoma hepatocelular, conforme definido pela atipia celular e arquitectónico com trabecular várias camadas ou pseudoglands. Tipo, número e tamanho foram registados para todas as lesões e em comparação com os resultados do exame radiológico. Além disso, a carga tumoral foi marcado semiquantitativa utilizando incrementos de 5%.
A análise estatística
O
in vivo
fotografada volume do fígado e do
ex vivo
medida peso do fígado foram registados, e o volume do fígado e o volume tumoral foram calculados e definida como a percentagem de tumor. Todos os valores são dados como média ± SEM. A significância estatística foi determinada pelo teste de correlação de Pearson (r é o coeficiente de correlação) e os resultados de imagiologia por histopatologia foram validados como descrito acima
O tumor-para não-tumor proporções foram definidos para os pequenos ( 5. mm), médio (5-10 mm) e lesões grandes ( 10 mm) e as diferenças estatisticamente significativas foram determinadas usando o one-way ANOVA e Bonferroni pós-teste
em diferentes pontos de tempo e para. todos os grupos de estudo as médias e desvios-padrão da porcentagem do tumor, a multiplicidade tumoral ea relação tumor-a-não-tumor foram comparados. A ANOVA one-way eo teste post Bonferroni foram utilizados para avaliar a significância estatística (cutoff p-valor determinado como 0,05).
Todas as análises estatísticas foram realizadas e visualizada usando SPSS Statistics 17.0 e GraphPad Prism 5.0 (GraphPad Software , Inc.).
resultados
morfologia do fígado com contraste e de imagem metabólica da glicose
no início do estudo, nenhum dos animais transgênicos tinham tumores hepáticos ou lesões precursoras enquanto que no final do estudo um total de 244 lesões hepáticas foram detectados que variaram em tamanho entre 0,9 mm e 25.0 mm. Notavelmente, a injecção intravenosa do agente de contraste iodado específico do fígado DHOG definida como lesões tumorais hipodenso, em comparação com o parênquima do fígado circundante normal (Figura 1). Lesões de um tamanho de 1 mm poderá ser identificadas com certeza por μCT mas não com a imagem FDG μPET para lesões de 5 mm. Em animais com uma carga tumoral elevada lesões individuais nem sempre podiam ser resolvidos devido a tumores individuais que se tinham fundido em conjunto (tumores de colisão).
fatias axial de um CT (A) e um FDG-PET scan (B) bem como cortes coronais de uma tomografia computadorizada (C) e visão macroscópica (D) de um fígado explantado de um ratinho tratado DEN com a idade de 7 meses. Quando comparado com os tumores normais parênquima do fígado são hypodens a CT como a absorção do agente de contraste específico hepático é reduzida. PET scans revelar lesões tumorais por uma captação do traçador aumentado devido ao metabolismo da glicose reforçada. Por causa do estágio avançado da doença tumores de diferentes tamanhos havia mesclados. K = rim, L = pulmão, S = coluna, Sp = baço, T = tumor.
Avaliação do crescimento e multiplicidade de lesões tumorais
O tratamento de camundongos transgênicos com a genotóxico hepatocarcinogen DEN induzida rapidamente o desenvolvimento de HCC. Com a idade de 4 meses (1) um sacrifício de 6 animais tiveram HCC, e a incidência de tumor já foi de 100% com a idade de 5,5 meses (2 sacrifício). Por tomografia computadorizada o volume do tumor e do fígado foi determinada e a relação resultante foi definida como percentagem do tumor (Figura 2A). Em geral, não houve diferença na incidência de tumores ou volume do tumor quando macho e ratinhos transgénicos c-myc do sexo feminino tratados com DEN foram comparados (Tabela 2).
(A) O volume do órgão e do tumor foi avaliada por TC e histopatológico. Retratado é o volume do tumor percentual em diferentes estágios medidos tanto pela histopatologia (cinza claro) ou por contraste de imagem CT (cinza escuro). O diâmetro médio de lesões (B) e o número total de lesões (C) são mostrados. * P 0,05. ** P . 0,01
Os dados foram validados por histopatologia como detalhado abaixo. Houve boa concordância entre a histopatologia e
in vivo
resultados de imagem. No que diz respeito ao crescimento do tumor foi observada a maior diferença entre a 1ª e 2ª sacrifício onde tomografias definido volumes tumorais percentuais de 2,8% e 58,0%, respectivamente. Com a idade de 8,5 meses (4 sacrifício) o volume do tumor percentagem foi de 69,3%. O diâmetro eo número de lesões foi determinada por tomografia computadorizada e por histopatologia. Com DEN as lesões tumorais aumentou o tempo dependente de 2,2 ± 0,3 mm (1 sacrifício) de 6,5 ± 0,9 mm (Figura 2B). Da mesma forma, a multiplicidade de tumores em animais tratados com NDEA aumentado a partir da primeira para segunda sacrifício mas diminuiu depois, possivelmente, como um resultado da fusão de tumores (Figura 2C).
O crescimento do tumor dependente do tempo também está representado na Figura 3, onde a CT e exames de PET de animais tratados DEN foram adquiridas com a idade de 5,5 e 7 meses, respectivamente. Aqui, o metabolismo da glicose em lesões hepáticas foi determinada por in vivo
18F-FDG μPET imagem.
(A) imagem CT demonstra uma lesão tumoral única (A1) em um rato 5,5 meses de idade, sem aumento
captação de 18F-FDG (A2). A imagem CT e PET fundido é representado na A3. (B) Com a idade de 7 meses de crescimento expansivo tumoral (B1), assim como um aumento da captação do traçador no carcinoma hepatocelular (B2) é observada. A imagem CT e a PET fundido é descrito em B3. G = vesícula biliar, K = rim, L = fígado, S = coluna, St = estômago, T = tumor.
Para permitir a localização anatômica exata de captação focal
18F-FDG, o registo e fusão de μCT e μPET conjuntos de dados foram adquiridos antes da análise quantitativa de imagens de glucose (ver Figura 3). Para este efeito, os animais foram colocados em decúbito ventral sobre uma cama com temperatura controlada multimodalidade sem reposicionar dos animais quando modalidades de imagem foram alteradas. Assim, os animais foram mantidos sob anestesia inalatória e na mesma posição cama entre CT e PET scan para permitir o registo de exames.
O
18F-FDG-uptake foi principalmente homogênea entre as lesões hepáticas. Algumas lesões maiores exibida uma absorção não uniforme dos
18F-FDG que foi particularmente proeminente nas partes periféricas do tumor. captação do traçador não homogénea foi associada com alterações císticas e necróticas do tumor adjacentes ao tecido tumoral vital como evidenciado por histopatologia.
De uma maneira geral, a proporção média do tumor para não-tumor era dependente do tamanho do tumor (Figura 4). Para lesões maiores do que 10 mm, a razão tumor-para não-tumor foi de 3,3 ± 0,6 e determinou-se estatisticamente aumentada significativamente (p 0,05) quando comparado com as lesões com um diâmetro de 5 a 10 mm (1,6 ± 0,2). Para lesões menores a razão tumor-para não-tumor foi de 0,98 ± 0,03, sugerindo, portanto, qualquer aumento no
18F-FDG-absorção quando comparado com o parênquima hepático normal.
tumor-para-não- rácio tumor, determinado por imagiologia de PET de glicose, foi significativamente aumentado nas lesões 10 milímetros. * P 0,05. ** P . 0,01
Figura 5 resume imagem PET /CT e fusão modalidade de imagens obtidas a partir de ratinhos transgénicos tratados com solução salina (Figura 5A), BHT (Figura 5B) ou DEN (Figura 5C ). Note-se, em 1 dos 6 animais tratados com BHT um tumor de . Observou-se 10 milímetros
Depicted é a morfologia do fígado, como determinado pela TC (A1, B1, C1), o metabolismo da glicose (A2 , B2, C2) e fundido PET e tomografia computadorizada (A3, B3, C3) de animais transgénicos tratados com solução salina fisiológica (a), com BHT (B) ou com NDEA (C) com a idade de 8,5 meses. Note, depois foi observado o tratamento com o crescimento do tumor expansivo DEN com grande aumento do peso do fígado e compressão e deslocamento de órgãos adjacentes. Aqui, as lesões mostrou sua captação 18F-FDG. Em contraste, nos animais de controlo correspondentes tratados com solução salina fisiológica não foram observadas lesões hepáticas. Após o tratamento com lesões pequenas hypodens BHT são notados, mas PET não mostrou uma absorção aumentada 18F-FDG. K = rim, L = fígado, S = coluna, Sp = baço, St = estômago, T = tumor.
Além disso, o tratamento de animais transgênicos com o paracetamol hepatotoxina não induziu o crescimento do tumor, conforme determinado por exame histopatológico (veja abaixo).
Validação dos resultados de imagiologia por histopatologia
O exame histopatológico evidenciou fígado normal com a preservação completa da arquitetura lobular, vias biliares e do parênquima vascular em camundongos não transgênicos. Em tratados com veículo c-Myc animais transgénicos displasia difusa foi observado (Figura 6A). Um pequeno número de animais transgénicos que receberam ou solução salina fisiológica (1/24 animais) ou óleo de milho (4/24 animais), bem como os animais tratados (BHT) 3/24 animais exibida nódulos displásico fígado uni ou multifocais 10-80 substituindo % do parênquima hepático que variavam em tamanho entre 1 e 10 mm. Estes focos consistiu em hepatócitos alargada com um rácio citoplasmática nuclear preservado, uni para bicelulares camadas e uma arquitetura nodular geral. Os animais transgénicos tratados com paracetamol foram semelhantes na histopatologia como observado com os controlos tratados com veículo (imagem não mostrado). Um animal de cada do óleo de milho e uma solução salina fisiológica animais transgénicos tratados exibida pequenos focos de carcinoma hepatocelular. Aqui, o tamanho da célula era menor, em comparação com os focos displásico com um aumento no tamanho do núcleo e uma distorção significativa da arquitectura revelando trabécula de várias camadas e zonas de pseudoglands císticas.
(A) displasia hepática difusa de solução salina fisiológica (= veículo) tratada em ratinhos transgénicos (A1) 50- e (A2) a ampliação de 200 vezes. (B) Grande displasia celular de vários graus em animais tratados com BHT em (B1) e 50- (B2) de ampliação de 200 vezes. (C) O carcinoma hepatocelular de um rato transgénico tratado com a substância cancerígena genotóxica DEN em (C1) 50 e (C2) de ampliação de 200 vezes.
O número, tamanho e agressividade biológica de lesões hepáticas foram inteiramente ligada ao tratamento DEN (Figura 6C). carcinoma hepatocelular com a arquitetura trabecular multicamadas foi observada como foram áreas pseudoglandulares e espaços vezes císticas dentro de tumores. Dos 18 animais examinados por exame histopatológico revelou 13 carcinomas hepatocelulares alguns dos quais (n = 10 animais) exibido nódulos displásicas adjacentes ao carcinoma hepatocelular bem. Além disso, 3 animais foram identificados com nódulos displásicos somente enquanto em 8 casos o HCC também foi acompanhada pela proliferação do ducto biliar marcado. Todos HCC tinha áreas de arquitetura trabecular multicamadas, a maioria também revelou áreas pseudoglandulares às vezes com grande cística e espaços Peliose-like. Devido à relação espacial e temporal perto de nódulos displásicos e HCC nos fígados dos animais transgênicos parece razoável definir nódulos displásicos como precursores e lesões precoces de câncer de fígado. Aqui, o tamanho das lesões pode ser usada como um meio para distinguir as lesões do fígado através do qual nódulos displásicas foram menores do que 5 mm e HCC eram maiores do que 10 mm.
Alguns animais tratados com NDEA exibida metástases do fígado primário câncer no pulmão (Figura 7B), mas o tratamento com DEN também induziu câncer de pulmão primário como evidenciado pela
in vivo
de imagem e histopatologia (Figura 7C). Assim, alguns animais foram sobrecarregados com o crescimento do tumor primário e secundário em dois órgãos diferentes.
(A) parênquima pulmonar normal de um animal de controlo tratado com veículo como mostrado por CT (A1) e por histopatologia (A2). CT de DEN animais tratados com a idade de 8,5 meses. Descrito são nódulos pulmonares de diferentes tamanhos (setas vermelhas). Histopatologia evidenciado esses nódulos pulmonares como metástase de um HCC pouco diferenciado (B2) e como adenocarcinoma bem do pulmão (C2).
Precisão
in vivo
imagem
Houve uma correlação altamente significativa entre o volume do fígado, calculado pela segmentação semi-automática de tomografias, eo peso do fígado, determinado
ex vivo
(coeficiente de correlação r = 0,99, p 0,001). Além disso, o volume do fígado calculada correlacionada com o volume de tumor estimado (r = 0,94, p 0,001). (Ver Figura S2)
Na Figura S3 fígado em relação ao peso corporal de ratinhos transgénicos tratados com NDEA ou BHT é dado. Quando o volume do tumor determinada pela
in vivo
μCT e imagem μPET foi comparada com a área de tumor definido por histopatologia, obteve-se uma correlação razoável (r = 0,82), portanto, demonstrar a bondade de
In vivo <